Reconstitutie cytoarchitectuur en functie van menselijke epitheelweefsels op een open-top orgaanchip

Traditionele diffusale kweekmethoden slagen er vaak niet in om de complexe omgeving van levende organen samen te vatten, wat leidt tot het verlies van weefselspecifieke markers en functies. We hebben een open-top chip ontwikkeld die diffusale cultuur en microfluïdisch principe combineert om de micro-omgeving van epitheelweefsels nauw na te bootsen. Door biochemische en biomechanische signalen op te nemen die van nature aanwezig zijn in levende organen, maar vaak worden verwaarloosd door traditionele in vitro modellen, vertegenwoordigt de open-top chip een beter alternatief tussen gesloten systemen.

De procedure wordt vandaag gedemonstreerd door Adya Panchal, een onderzoeksstudent in mijn laboratorium. Breng om te beginnen de vereiste reagentia onder de bioveiligheidskast op ijs. Kweek weefselspecifieke mesenchymale cellen om 80% tot 90% confluentie te verkrijgen en dissocieer vervolgens de cellen met behulp van trypsine of andere methoden volgens de aanbevelingen van de fabrikant.

Pellet de cellen op 250g gedurende vijf minuten op 24 graden Celsius. Resuspendie van de celkorrel in 225 microliter elk van ijskoude 10X EMEM en reconstructiebuffer. Meng de cellen door pipetteren en voeg 1.800 microliter ijskoude Collageen 1-oplossing toe.

Meng vervolgens de pre-geloplossing op ijs door vijf tot zes keer op en neer te pipetteren. Neutraliseer de pre-geloplossing met 18 microliter van één normaal natriumhydroxide, meng voorzichtig door pipetteren en pipetteer vervolgens 150 microliter celbeladen hydrogel in de centrale kamer van de open chip terwijl u bellen vermijdt. Groepeer de chips in afzonderlijke petrischalen, inclusief een centrifugebuisdop gevuld met twee milliliter steriel dubbel gedestilleerd water in elke petrischaal, en incuber de petrischalen bij 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide.

Om oppervlaktemicropatterning van de stromale hydrogel uit te voeren, pipetteer 20 microliter van de geneutraliseerde Collagen 1 pre-gel-oplossing op het patroonoppervlak van een steriele 3D-geprinte stempel en plaats de stempel in de open kamer terwijl de stromale hydrogel nog steeds in vloeibare vorm is. Verwijder eventuele hydrogelresten die van de bovenkant van de open kamer kunnen morsen met behulp van een aspirator. Groepeer alle chips in afzonderlijke petrisalen met een conische buisdop gevuld met water zoals eerder gedemonstreerd.

En incuber alle petrisalen op 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide gedurende 90 minuten. Breng aan het einde van de incubatie de chips terug onder de bioveiligheidskast en verwijder voorzichtig de stempels met een precisiepincet om het risico op beschadiging van de hydrogel te verminderen. Zodra de gekweekte cellen 80% tot 90% confluentie bereiken, dissocieert u de cellen met behulp van proteolytische enzymprocedures zoals aanbevolen door de celleverancier.

Na dissociatie, pellet de cellen door centrifugatie en resuspendien de epitheelcellen terug naar de juiste celfragmentdichtheid zoals beschreven in het manuscript. Om de epitheelcel te zaaien, brengt u de chips van de incubator over in de bioveiligheidskast en spoelt u het stromale oppervlak drie keer met 100 microliter vers epitheelcelkweekmedium om overtollige coatingoplossing te verwijderen. Zodra het spoelmedium is aangezogen, zaait u het hydrogeloppervlak met 50 microliter van de epitheelcelsuspensie met behulp van de juiste celdichtheid en brengt u de chips vervolgens gedurende twee uur terug in de incubator.

Om cellulair afval te verwijderen, spoelt u het hydrogeloppervlak twee keer voorzichtig af met het celkweekmedium, ververst u het medium door autoclaveren in verzegelde autoclaveerbare containers en sluit u de chips aan op de peristaltische pomp. Pauzeer de peristaltische pomp, koppel de chips voorzichtig los van de pomp en haal de drager van het chiphuis eruit. Nadat u de chips van de incubator naar de bioveiligheidskast hebt overgebracht, verwijdert u het volume van het medium dat overblijft in het bovenste reservoir.

Zuig vervolgens al het medium uit het bovenste microfluïdische kanaal voorzichtig en klem de korte microfluïdische slang die is verbonden met de bovenste inlaten met behulp van bindmiddelclips om mediaverdamping en onderhoud van lucht-vloeistofinterface of ALI te verminderen. Plaats de open-top chip op de behuizingsdrager terug in de incubator. Sluit de chips opnieuw aan op de peristaltische pomp en hervat de stroom door de peristaltische pomp te starten.

Spoel de vaatkamer met endotheelcelkweekmedium en zaai vervolgens 25 microliter endotheelcelsuspensie. Draai de chips ondersteboven zodat endotheelcellen zich kunnen hechten aan het bovenoppervlak van de microfluïdische kamer. Groepeer de chips in petrischaaltjes.

Plaats ze terug in de couveuse zoals eerder aangetoond en laat de endotheelcellen een uur hechten. Aan het einde van de incubatie brengt u de chips over van de incubator naar de bioveiligheidskast en spoelt u het vaatkanaal tweemaal met endotheelcelkweekmedium om cellulair afval te verwijderen. Leg de chips plat om de hechting van de endotheelcellen aan het onderste oppervlak van het vaatkanaal te vergemakkelijken.

Vul het vasculaire mediumreservoir met het ontgaste vaatcelkweekmedium onder de bioveiligheidskast. Plaats de chips terug in de drager van de chipbehuizing en sluit de chips opnieuw aan op de middelgrote reservoirs aan de ene kant en op de peristaltische pomp aan de andere kant. Inspecteer de microfluïdische verbindingen om er zeker van te zijn dat alle chips correct zijn aangesloten en dat er geen zichtbare druppels medium druppelen.

Hervat vervolgens de vloeistofstroom door de peristaltische pomp te starten. Het microgepatterde geloppervlak met en zonder cellen wordt gevisualiseerd. Histologische analyse toonde volwassen meerlagige gestratificeerde epidermis gedifferentieerd op chip.

De bovenste foto van de huidchip toonde de aanwezigheid van de fibroblasten in de huidlaag. PECAM-1, VE-cadherine en von Willebrand toonden de differentiatie van menselijke microvasculaire endotheelcellen die samen werden gekweekt in de open-top huidchip. MUC5AC, alfa- en bèta-tubuline, chloorceleiwit 16, p63 en ZO-1 fluorescerende kleuring toonden volwassen luchtwegepitheel.

De kloppende trilharen en gedifferentieerde volwassen pseudo-gestratificeerde epitheel werden waargenomen op open-top luchtwegchip. Type I, Type II en E-cadherine fluorescerende kleuring toonde de aanwezigheid van volwassen pneumocyten op chip. Elektronenmicroscopie onthulde de aanwezigheid van microvilli en lysosomale blaasjes, bewijs van volwassen alveolair fenotype.

De histologische analyse toonde de aanwezigheid van platte plaveiselcellen die consistent zijn met het type I-fenotype, en kubusvormige kasseiachtige cellen die coherent zijn met het type II-fenotype en fibroblasten in de huidlaag. De aanwezigheid van enterocyten en de rijpe bokaal werd bevestigd door mucine 2- en E-cadherinekleuring. De fibroblasten in de huidlaag bevestigden de aanwezigheid van een eenvoudig kolomvormig epitheel.

Alle reagentia moeten koud zijn en de oppervlakken van de gel moeten voldoende worden gespoeld om een gelijkmatig oppervlak te verkrijgen. Het is belangrijk om niet-hechtende cellen en puin te verwijderen om een gelijkmatige celhechting en een compacte vuile monolaag en vaatwand te verkrijgen. Een vergelijkbare aanpak kan worden gebruikt om andere soorten epitheliale orgaanmodellen te genereren, zoals de darm en de longen, om te beoordelen hoe specifieke geneesmiddelen of omgevingsfactoren de homeostase van menselijke weefsels kunnen beïnvloeden, met een bijzondere nadruk op de epitheliale en vasculaire barrièrefunctie.

Met gemakkelijke toegang tot de werkzaamheidsfase van het stromacompartiment, kan onderzoek nu specifieke gezichtspatronen genereren en functionele weefselarchitectuur reproduceren, zoals de cryptviveoli, wat moeilijk te bereiken is met andere apparaten.