Techniek Driedimensionale epitheelweefsels Embedded binnen extracellulaire matrix
July 10th, 2016
Dit manuscript beschrijft een zachte lithografie gebaseerde techniek uniforme arrays van driedimensionale (3D) epitheliale weefsels gedefinieerde geometrische midden van extracellulaire matrix ingenieur. Deze methode is vatbaar voor een grote verscheidenheid aan celtypen en experimentele contexten en zorgt voor high-throughput screening van identieke herhalingen.
Het doel van deze procedure is om een verhoging van identieke driedimensionale weefsels te creëren die zijn ingebed in een collageengel voor gebruik in veel experimentele contexten, zoals het bepalen van de invloed van mechanische stress op vertakkingsmorfogenese. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van sleutelvragen in weefselmorfogenese, zoals het bepalen van de onderliggende mechanismen van collectief celgedrag. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat de geometrie van de geconstrueerde weefsels gecontroleerd en reproduceerbaar is, waardoor nauwkeurige manipulatie en meting van fysische en biochemische factoren mogelijk wordt.
Daarom is de steekproefomvang groot genoeg om conclusies te trekken met hoge statistische zekerheid. Begin met het voorbereiden van een siliconen master die fotogepatroon is met uw gewenste array met behulp van standaard fotolitografietechnieken. Het patroon dat in deze video wordt gebruikt, bestaat uit rechthoekige structuren die 200 micrometer uit elkaar staan.
Meng vervolgens 50 gram PDMS door de prepolymer en een uithardingsmiddel in een wegwerpbak in een verhouding van 10:1 te combineren. Plaats vervolgens het mengsel gedurende 15 tot 30 minuten onder vacuüm om eventuele luchtbellen die tijdens het mengproces zijn ontstaan, te verwijderen. Plaats de siliconen master met de getextureerde kant naar boven in een plastic weegboot en giet de gedegasseerde PDMS-oplossing op de mal.
Plaats vervolgens de schaal in een oven en laat de PDMS 12 uur uitharden bij 60 graden Celsius. Zodra het is uitgehard, verwijdert u de PDMS en de master uit de plastic container. Scheid voorzichtig de PDMS van de siliconenwafer.
Gebruik vervolgens een schone scheermes om eventueel overtollig PDMS rond de geïmprenteerde functies te verwijderen. Gebruik nu een scheermes om de gepatroneerde PDMS in afzonderlijke rechthoekige stempels te snijden. Bewaar deze stempels met de functies naar boven in een schone petrischaal met een diameter van 100 millimeter.
Bereid vervolgens een verse batch van gedegasseerde PDMS-oplossing voor met dezelfde verhouding van 10:1 van prepolymer naar uithardingsmiddel. Spincoat twee tot drie gram van deze oplossing op een petrischaal met een diameter van 100 millimeter en laat de PDMS vervolgens 12 uur uitharden bij 60 graden Celsius. Gebruik vervolgens een scheermes om de dunne laag PDMS in rechthoeken te snijden om als steunen voor de stempels te worden gebruikt.
Er zijn twee steunen nodig voor elke stempel. Zodra alle steunen zijn gesneden, steriliseer de PDMS-stempels en -steunen door ze onder te dompelen in 70% ethanol en ze te drogen met een aspirator in een bioveiligheidskabinet. Voeg in een bioveiligheidskabinet 50 microliter 1% BSA in PBS toe aan de bovenkant van elke stempel.
Plaats de met druppel bedekt zijnde stempels bij vier graden Celsius gedurende minimaal vier uur om ervoor te zorgen dat de BSA op het oppervlak van de stempel absorbeert. Breng vervolgens de stempels terug naar het bioveiligheidskabinet en aspireer de BSA-oplossing uit de PDMS-stempels. Was vervolgens de oppervlakken van de stempels twee keer met 50 microliter celkweekmedium.
Aspireer het medium na elke wasbeurt. Leg voor elke PDMS-stempel een weefselkweekschaal met een diameter van 35 millimeter neer. Leg in elke schaal twee PDMS-steunen neer, gescheiden door een afstand die iets minder is dan de lengte van de PDMS-stempels.
Gebruik vervolgens een pincet om glazen deksels met een diameter van 15 millimeter op te pakken en steriliseer ze met 70% ethanol. Aspireer het overtollige vocht van de deksels terwijl u ze met het pincet vasthoudt en bewaar ze vervolgens in een aparte petrischaal. Geef vervolgens 50 microliter van een collageenmengsel van vier milligram per milliliter direct op elke stempel af om het oppervlak van de PDMS-stempels gelijkmatig te bedekken.
Gebruik het pincet om elk van de met collageen bedekte PDMS-stempels op te pakken en draai ze voorzichtig om. Laat de omgekeerde stempels met het collageen naar beneden op de PDMS-steunen in de weefselkweekschalen zakken. Incubeer vervolgens de schalen gedurende 30 minuten bij 37 graden Celsius.
Geef vervolgens 50 microliter van de resterende collageenmengsel af op elk van de ronde deksels en incubeer ze gedurende 30 minuten bij 37 graden Celsius. Op dit punt oogst u uw celtype van belang. Hier hebben we EpH4 muis mammaire epitheelcellen die we in een concentratie van tussen de één en 10 miljoen cellen per milliliter hebben gesuspendeerd.
Verwijder nu de gelde collageenmonsters uit de incubator. Gebruik het pincet om de PDMS-stempels voorzichtig omhoog te tillen om ze los te maken van het gevormde collageen en gooi ze weg. Het is belangrijk om de stempel omhoog te tillen om de functies in het collageengel niet te vervormen.
Geef 30 microliter van de geconcentreerde celsuspensie af op het oppervlak van elk collageengel met gevormde holtes van de gewenste geometrie. Observeer de cellen onder een helderveldmicroscoop terwijl u de schalen heen en weer schudt om celbezinking binnen de holtes te bevorderen. De holtes moeten binnen vijf minuten worden gevuld.
Om overtollige cellen rond de holtes te verwijderen, kantelt u elke weefselkweekschaal op zijn zij en doseert u voorzichtig 400 microliter celkweekmedium over het oppervlak van het collageengel. Het is belangrijk om voorzichtig te wassen door langzaam kweekmedium over het gel te doseren terwijl de schaal wordt gekanteld, zodat alle overtollige cellen op het geloppervlak worden verwijderd en de cellen in de holtes van het gel niet worden verplaatst. Aspireer het vocht en herhaal de wasbeurt nog twee keer.
Controleer de collageengels onder de microscoop tussen elke wasbeurt in om te observeren wanneer de overtollige cellen zijn weggespoeld. Nadat de overtollige cellen rond de met cellen gevulde holtes zijn verwijderd, plaatst u de weefselkweekschalen in een incubator bij 37 graden Celsius gedurende 15 minuten. Draai vervolgens, met behulp van het pincet, de met collageen
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Overzicht
Dit manuscript beschrijft een techniek om uniforme arrays van driedimensionale (3D) epitheelweefsels te maken die ingebed zijn in een collageen-gel. Deze methode maakt hoge-doorvoer screening en nauwkeurige manipulatie van fysische en biochemische factoren mogelijk.
Belangrijke studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Weefselengineering
- Celgedrag
- Biochemische analyse
Achtergrond
- Engineering van 3D weefsels is cruciaal voor het bestuderen van weefselmorfogenese.
- Mechanische stress beïnvloedt vertakkingsmorfogenese.
- Reproduceerbaarheid in weefselgeometrie is essentieel voor experimentele nauwkeurigheid.
- Grote steekproefgroottes verhogen de statistische betrouwbaarheid van bevindingen.
Doel van het onderzoek
- Om identieke 3D weefsels te engineeren voor verschillende experimentele contexten.
- Om de invloed van mechanische stress op celgedrag te onderzoeken.
- Om de mechanismen van collectief celgedrag te begrijpen.
Gebruikte methoden
- Techniek gebaseerd op zachte litografie voor weefselengineering.
- Voorbereiding van een silicium master gefotopatroon met gewenste arrays.
- Inbedden van weefsels in collageen-gel.
- Hoge-doorvoer screening van weefselmonsters.
Belangrijkste resultaten
- Gecontroleerde en reproduceerbare geometrie van geëngineerde weefsels.
- Vermogen om fysische en biochemische factoren nauwkeurig te manipuleren.
- Hoge statistische betrouwbaarheid in experimentele conclusies.
- Inzichten in mechanismen van collectief celgedrag.
Conclusies
- De techniek biedt een robuust platform voor weefselengineering.
- Het vergemakkelijkt het bestuderen van mechanische invloeden op weefselontwikkeling.
- Bevordert het begrip van fundamentele biologische processen.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Engineering uniform 3D epithelial tissues embedded in ECM enables precise control over tissue geometry and microenvironmental factors, supporting mechanistic studies of branching morphogenesis and collective cell behavior. This approach enhances reproducibility and statistical power in preclinical discovery, facilitating target validation and pathway interrogation in disease-relevant systems. The method’s compatibility with downstream analytics such as traction force microscopy and molecular assays strengthens its utility in lead identification and predictive de-risking workflows.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by controlling tissue geometry to isolate mechanical and biochemical influences on epithelial morphogenesis.
- Operational Value: Provides reproducible, arrayed 3D tissues that support high-throughput evaluation of genetic or pharmacological perturbations.
- Predictive Value: Supports mechanistic de-risking by linking defined microenvironments to emergent tissue-level phenotypes such as branching.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantifiable, geometry-defined tissue arrays that serve as standardized substrates for compound screening in ECM-embedded contexts.
- Operational Value: Enables assay standardization through precise tissue spacing and uniform collagen embedding, reducing variability in readouts.
- Scalability: Supports parallel processing of identical tissues, increasing throughput for dose-response or time-course studies.
Translational & Preclinical Research
- Translational Relevance: Models epithelial tissue architecture relevant to organs such as mammary glands, supporting disease modeling in cancer invasion and stromal interactions.
- Mechanistic Continuity: Bridges discovery-phase microenvironment control with preclinical assessment of collective cell behavior and matrix remodeling.
- Risk-Adjusted Advancement: Enables early-stage evaluation of targets influencing tissue integrity and morphogenic potential.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target hypothesis testing to preclinical validation, particularly in studies requiring precise spatiotemporal control of cell-ECM interactions.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by enabling controlled variation of tissue geometry and ECM composition to dissect mechanotransduction pathways.
- Screening: Delivers assay-ready, reproducible 3D tissues embedded in collagen, suitable for evaluating compound effects on tissue-level phenotypes.
- Analytics: Generates structural and spatial readouts (e.g., branching patterns, cell alignment) that can be quantified and correlated with molecular endpoints.
- Translational Research: Connects engineered epithelial architectures to disease-relevant tissue processes such as invasion and stromal remodeling.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for generating standardized 3D tissues across multiple projects and cell types.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Enhances predictive confidence in target validation by reducing variability in tissue architecture and enabling precise environmental control.
- Operational Value: Promotes standardization and reproducibility through molded tissue arrays and defined ECM embedding.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision quality by providing quantitative, morphology-based readouts linked to mechanistic pathways.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of targets based on their influence on tissue morphogenesis and collective behavior.
Implementation Considerations
- Requires expertise in soft lithography, tissue culture, and ECM handling.
- Depends on access to photolithography equipment for master fabrication and PDMS molding capabilities.
- Necessitates standardization of collagen concentration, gelation timing, and cell seeding protocols across teams.
- Adaptation to alternative ECM proteins (e.g., Matrigel, fibrin) may require optimization of gelation and tissue stability.
- Practical limitations include the need for careful handling to avoid tissue distortion during stamp removal and gel manipulation.
