Techniek Driedimensionale epitheelweefsels Embedded binnen extracellulaire matrix
10 juli 2016
Dit manuscript beschrijft een zachte lithografie gebaseerde techniek uniforme arrays van driedimensionale (3D) epitheliale weefsels gedefinieerde geometrische midden van extracellulaire matrix ingenieur. Deze methode is vatbaar voor een grote verscheidenheid aan celtypen en experimentele contexten en zorgt voor high-throughput screening van identieke herhalingen.
Het doel van deze procedure is om een verhoging van identieke driedimensionale weefsels te creëren die zijn ingebed in een collageengel voor gebruik in veel experimentele contexten, zoals het bepalen van de invloed van mechanische stress op vertakkingsmorfogenese. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van sleutelvragen in weefselmorfogenese, zoals het bepalen van de onderliggende mechanismen van collectief celgedrag. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat de geometrie van de geconstrueerde weefsels gecontroleerd en reproduceerbaar is, waardoor nauwkeurige manipulatie en meting van fysische en biochemische factoren mogelijk wordt.
Daarom is de steekproefomvang groot genoeg om conclusies te trekken met hoge statistische zekerheid. Begin met het voorbereiden van een siliconen master die fotogepatroon is met uw gewenste array met behulp van standaard fotolitografietechnieken. Het patroon dat in deze video wordt gebruikt, bestaat uit rechthoekige structuren die 200 micrometer uit elkaar staan.
Meng vervolgens 50 gram PDMS door de prepolymer en een uithardingsmiddel in een wegwerpbak in een verhouding van 10:1 te combineren. Plaats vervolgens het mengsel gedurende 15 tot 30 minuten onder vacuüm om eventuele luchtbellen die tijdens het mengproces zijn ontstaan, te verwijderen. Plaats de siliconen master met de getextureerde kant naar boven in een plastic weegboot en giet de gedegasseerde PDMS-oplossing op de mal.
Plaats vervolgens de schaal in een oven en laat de PDMS 12 uur uitharden bij 60 graden Celsius. Zodra het is uitgehard, verwijdert u de PDMS en de master uit de plastic container. Scheid voorzichtig de PDMS van de siliconenwafer.
Gebruik vervolgens een schone scheermes om eventueel overtollig PDMS rond de geïmprenteerde functies te verwijderen. Gebruik nu een scheermes om de gepatroneerde PDMS in afzonderlijke rechthoekige stempels te snijden. Bewaar deze stempels met de functies naar boven in een schone petrischaal met een diameter van 100 millimeter.
Bereid vervolgens een verse batch van gedegasseerde PDMS-oplossing voor met dezelfde verhouding van 10:1 van prepolymer naar uithardingsmiddel. Spincoat twee tot drie gram van deze oplossing op een petrischaal met een diameter van 100 millimeter en laat de PDMS vervolgens 12 uur uitharden bij 60 graden Celsius. Gebruik vervolgens een scheermes om de dunne laag PDMS in rechthoeken te snijden om als steunen voor de stempels te worden gebruikt.
Er zijn twee steunen nodig voor elke stempel. Zodra alle steunen zijn gesneden, steriliseer de PDMS-stempels en -steunen door ze onder te dompelen in 70% ethanol en ze te drogen met een aspirator in een bioveiligheidskabinet. Voeg in een bioveiligheidskabinet 50 microliter 1% BSA in PBS toe aan de bovenkant van elke stempel.
Plaats de met druppel bedekt zijnde stempels bij vier graden Celsius gedurende minimaal vier uur om ervoor te zorgen dat de BSA op het oppervlak van de stempel absorbeert. Breng vervolgens de stempels terug naar het bioveiligheidskabinet en aspireer de BSA-oplossing uit de PDMS-stempels. Was vervolgens de oppervlakken van de stempels twee keer met 50 microliter celkweekmedium.
Aspireer het medium na elke wasbeurt. Leg voor elke PDMS-stempel een weefselkweekschaal met een diameter van 35 millimeter neer. Leg in elke schaal twee PDMS-steunen neer, gescheiden door een afstand die iets minder is dan de lengte van de PDMS-stempels.
Gebruik vervolgens een pincet om glazen deksels met een diameter van 15 millimeter op te pakken en steriliseer ze met 70% ethanol. Aspireer het overtollige vocht van de deksels terwijl u ze met het pincet vasthoudt en bewaar ze vervolgens in een aparte petrischaal. Geef vervolgens 50 microliter van een collageenmengsel van vier milligram per milliliter direct op elke stempel af om het oppervlak van de PDMS-stempels gelijkmatig te bedekken.
Gebruik het pincet om elk van de met collageen bedekte PDMS-stempels op te pakken en draai ze voorzichtig om. Laat de omgekeerde stempels met het collageen naar beneden op de PDMS-steunen in de weefselkweekschalen zakken. Incubeer vervolgens de schalen gedurende 30 minuten bij 37 graden Celsius.
Geef vervolgens 50 microliter van de resterende collageenmengsel af op elk van de ronde deksels en incubeer ze gedurende 30 minuten bij 37 graden Celsius. Op dit punt oogst u uw celtype van belang. Hier hebben we EpH4 muis mammaire epitheelcellen die we in een concentratie van tussen de één en 10 miljoen cellen per milliliter hebben gesuspendeerd.
Verwijder nu de gelde collageenmonsters uit de incubator. Gebruik het pincet om de PDMS-stempels voorzichtig omhoog te tillen om ze los te maken van het gevormde collageen en gooi ze weg. Het is belangrijk om de stempel omhoog te tillen om de functies in het collageengel niet te vervormen.
Geef 30 microliter van de geconcentreerde celsuspensie af op het oppervlak van elk collageengel met gevormde holtes van de gewenste geometrie. Observeer de cellen onder een helderveldmicroscoop terwijl u de schalen heen en weer schudt om celbezinking binnen de holtes te bevorderen. De holtes moeten binnen vijf minuten worden gevuld.
Om overtollige cellen rond de holtes te verwijderen, kantelt u elke weefselkweekschaal op zijn zij en doseert u voorzichtig 400 microliter celkweekmedium over het oppervlak van het collageengel. Het is belangrijk om voorzichtig te wassen door langzaam kweekmedium over het gel te doseren terwijl de schaal wordt gekanteld, zodat alle overtollige cellen op het geloppervlak worden verwijderd en de cellen in de holtes van het gel niet worden verplaatst. Aspireer het vocht en herhaal de wasbeurt nog twee keer.
Controleer de collageengels onder de microscoop tussen elke wasbeurt in om te observeren wanneer de overtollige cellen zijn weggespoeld. Nadat de overtollige cellen rond de met cellen gevulde holtes zijn verwijderd, plaatst u de weefselkweekschalen in een incubator bij 37 graden Celsius gedurende 15 minuten. Draai vervolgens, met behulp van het pincet, de met collageen
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit manuscript beschrijft een techniek om uniforme arrays van driedimensionale (3D) epitheelweefsels in een collageengel te engineeren. Deze methode maakt high-throughput screening en precieze manipulatie van fysische en biochemische factoren mogelijk.
Belangrijkste componenten van de studie
Wetenschappelijk vakgebied
- Weefseltechnologie
- Celgedrag
- Biochemische Analyse
Achtergrond
- Het engineeren van 3D-weefsels is cruciaal voor het bestuderen van weefselmorfogenese.
- Mechanische stress beïnvloedt de vertakkingsmorfogenese.
- Reproduceerbaarheid in de weefselgeometrie is essentieel voor de experimentele nauwkeurigheid.
- Grote steekproefgroottes vergroten het statistische vertrouwen in de bevindingen.
Doel van de studie
- Om identieke 3D-weefsels te ontwikkelen voor diverse experimentele contexten.
- Om de invloed van mechanische stress op het celgedrag te onderzoeken.
- Om de mechanismen van collectief celgedrag te begrijpen.
Gebruikte methoden
- Op soft lithografie gebaseerde techniek voor weefselengineering.
- Bereiding van een siliconen master met fotopatronen van de gewenste arrays.
- Inbedding van weefsels in collageengel.
- High-throughput screening van weefselmonsters.
Belangrijkste resultaten
- Gecontroleerde en reproduceerbare geometrie van gemanipuleerde weefsels.
- Mogelijkheid om fysieke en biochemische factoren nauwkeurig te manipuleren.
- Hoge statistische betrouwbaarheid van experimentele conclusies.
- Inzichten in de mechanismen van collectief celgedrag.
Conclusies
- De techniek biedt een robuust platform voor weefselkweek.
- Het faciliteert de studie naar mechanische invloeden op de weefselontwikkeling.
- Het bevordert het begrip van fundamentele biologische processen.
Veelgestelde vragen
Relevantie voor de Industrie
Het ontwikkelen van uniforme 3D-epitheelweefsels ingebed in ECM maakt een nauwkeurige controle over de weefselgeometrie en micro-omgevingsfactoren mogelijk, wat mechanistische studies naar vertakkingsmorfogenese en collectief celgedrag ondersteunt. Deze benadering verbetert de reproduceerbaarheid en statistische kracht bij preklinische ontdekkingen, wat de validatie van targets en het onderzoek naar signaalpaden in ziekte-relevante systemen faciliteert. De compatibiliteit van de methode met downstream-analyses, zoals tractiekrachtmicroscopie en moleculaire assays, versterkt het nut ervan in workflows voor lead-identificatie en voorspellende risicoreductie.
Strategische toepassingen in biofarmaceutische R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het toetsen van therapeutische hypothesen mogelijk door de weefselgeometrie te controleren, om zo mechanische en biochemische invloeden op epitheliale morfogenese te isoleren.
- Operationele waarde: Levert reproduceerbare, in arrays geordende 3D-weefsels die geschikt zijn voor high-throughput evaluatie van genetische of farmacologische perturbaties.
- Predictieve waarde: Ondersteunt mechanistische risicovermindering door gedefinieerde micro-omgevingen te koppelen aan opkomende fenotypes op weefselniveau, zoals vertakking.
Screening & assay-ontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Genereert kwantificeerbare, geometrisch gedefinieerde weefselarrays die dienen als gestandaardiseerde substraten voor compound screening in ECM-ingebedde contexten.
- Operationele waarde: Maakt assay-standaardisatie mogelijk door precieze weefselafstand en uniforme collagen-inbedding, waardoor variabiliteit in de meetwaarden wordt verminderd.
- Schaalbaarheid: Ondersteunt parallelle verwerking van identieke weefsels, wat de doorvoer voor dosis-responsvoet- of tijdreeksstudies verhoogt.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Translationele relevantie: Modelleert de architectuur van epitheelweefsel die relevant is voor organen zoals melkklieren, wat ziekte-modellering bij kankerinvasie en stromale interacties ondersteunt.
- Mechanistische continuïteit: Slaat een brug tussen de controle van de micro-omgeving in de ontdekkingsfase en de preklinische beoordeling van collectief celgedrag en matrixremodellering.
- Risico-gecorrigeerde vooruitgang: Maakt vroege evaluatie mogelijk van targets die de weefselintegriteit en het morfogene potentieel beïnvloeden.
Integratie van pijplijn en workflow
De methode past binnen het ontdekkingscontinuüm, van het testen van hypothesen over targets tot preklinische validatie, in het bijzonder bij studies die een nauwkeurige spatiotemporele controle van cel-ECM-interacties vereisen.
- Discovery Biology: Ondersteunt hypothesetoetsing door gecontroleerde variatie van weefselgeometrie en ECM-compositie mogelijk te maken om mechanotransductiepaden te ontleden.
- Screening: Levert reproduceerbare, assay-klare 3D-weefsels ingebed in collageen, geschikt voor het evalueren van compound-effecten op fenotypes op weefselniveau.
- Analytics: Genereert structurele en ruimtelijke read-outs (bijv. vertakkingspatronen, celuitlijning) die gekwantificeerd en gecorreleerd kunnen worden met moleculaire eindpunten.
- Translationeel onderzoek: Verbindt engineered epitheliale architecturen met ziekte-relevante weefselprocessen zoals invasie en stromale remodellering.
- Enterprise Reuse: Vestigt een herbruikbaar platform voor het genereren van gestandaardiseerde 3D-weefsels over meerdere projecten en celtypen heen.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellende vertrouwen bij targetvalidatie door variabiliteit in de weefselarchitectuur te verminderen en nauwkeurige omgevingscontrole mogelijk te maken.
- Operationele waarde: Bevordert standaardisatie en reproduceerbaarheid door middel van gegoten weefselarrays en gedefinieerde ECM-inbedding.
- Strategische waarde: Verbetert de kwaliteit van go/no-go-beslissingen door kwantitatieve, op morfologie gebaseerde readouts te leveren die gekoppeld zijn aan mechanistische pathways.
- Impact op portfolio: Ondersteunt risico-gecorrigeerde prioritering van targets op basis van hun invloed op weefselmorfogenese en collectief gedrag.
Overwegingen voor Implementatie
- Vereist expertise in zachte lithografie, weefselkweek en het bewerken van ECM.
- Is afhankelijk van toegang tot fotolithografie-apparatuur voor de fabricage van de master en mogelijkheden voor PDMS-gieten.
- Vereist standaardisatie van de collageenconcentratie, de timing van de gelering en de protocollen voor het zaaien van cellen tussen teams.
- Aanpassing aan alternatieve ECM-eiwitten (bijv. Matrigel, fibrine) kan optimalisatie van de gelering en weefselstabiliteit vereisen.
- Praktische beperkingen omvatten de noodzaak van zorgvuldige hantering om weefselvervorming tijdens het verwijderen van de stempel en de manipulatie van de gel te voorkomen.
