Het afstemmen van de contractiliteit en vervormingsmodi van actieve op actine gebaseerde assemblages in vitro: van tweedimensionale actieve netwerken tot druppels van vloeibare kristallen

Dit onderzoek richt zich op zachte biologische materialen en heeft tot doel de onderliggende fysische mechanismen te onderzoeken die vorm en organisatie reguleren en materialen geïnspireerd door biologische cellen.

Biologische en in vitro modelsystemen zijn inherent complex met veel valkuilen, en monstervoorbereiding is van cruciaal belang voor hun reproduceerbaarheid. Dit protocol is ontworpen om de reproduceerbaarheid in deze systemen te verbeteren.

Deze resultaten maken de weg vrij om mechanismen te detecteren, te karakteriseren en de functie van fysische krachten en biomaterialen te begrijpen. Dit kan generaliseerbaar zijn naar verschillende biopolymeren en organellen.

[Verteller] Bereid om te beginnen het te laden monster voor door vijf microliter 10XF-buffer toe te voegen aan een microcentrifugebuis en voeg een volume gedeïoniseerd gedestilleerd water toe, zodat het uiteindelijke monstervolume 50 microliter zal zijn nadat de resterende componenten zijn toegevoegd. Pipetteer één microliter 25% bèta-mercaptoethanol, één microliter 225 milligram per milliliter glucose, één microliter van een mengsel van glucose-oxidase en 85.000 eenheden per milliliter katalysator in de oplossing. Voeg vervolgens een microliter 25 millimolaire ATP en 10 microliter 2%, 15 centipoise methylcellulose toe en meng grondig door te pipetteren. Om te beginnen met actinepolymerisatie, mengt u niet-geëtiketteerde actine met geëtiketteerde actine en voegt u het actinemengsel toe aan de voorbereide F-bufferoplossing. Pipetteer de oplossing op en neer om een goede menging te garanderen. Laat de actine bij kamertemperatuur polymeriseren in de microcentrifugebuis. Om vervolgens een flowcel voor te bereiden, plaatst u twee stukken dubbelzijdige tape parallel aan elkaar over de breedte van het microscoopglaasje om de grenzen van het flowcelkanaal te vormen. Plaats de afdekstrook over het tapekanaal en zorg ervoor dat deze loodrecht op het microscoopglaasje staat. Druk op het gedeelte van het dekglaasje dat in contact komt met de dubbelzijdige tape om een goede afdichting te creëren en luchtbellen te elimineren. Knip met een scheermesje overtollige tape van het microscoopglaasje en het dekglaasje af, zodat de enige zichtbare tape zich in het monsterkanaal bevindt. Om een cilindermonsterkamer voor te bereiden voor twee deplanermonsters, spoelt u eerst het dekglaasje af met ethanol, water en ethanol. Droog het af met gefilterde lucht. Breng een dunne laag van vijf minuten epoxy aan om de glazen klooncilinder op de dekglaasje te plakken. Voeg 3,5 microliter oppervlakteactieve olieoplossing toe aan een transparante of lichtgekleurde microcentrifugebuis. Pipetteer zonder te mengen vijf microliter van de actineoplossing op de bovenkant van de olie-oppervlakteactieve stoflaag. Sluit de buis. Houd de bovenkant van de microcentrifugebuis vast en tik tegen de onderkant om een eerste schuim met zichtbare emulsie te vormen en blijf tikken totdat het uniforme micro-emulsies vormt. Voordat u de flowcel laadt, mengt u een kleine hoeveelheid epoxy van vijf minuten. Om een stroomcel te laden, pipetteert u een tot drie microliter oppervlakteactieve olieoplossing in het monsterkanaal van de stroomcel om een kleine prop te maken die het kanaal nat maakt. Kantel de flowcel om eventuele luchtspleten te verwijderen die ontstaan als gevolg van de terugwijkende olie-oppervlakteactieve stof meniscus voordat u het monster toevoegt. Piket onmiddellijk de monsteroplossing emulsiesuspensie in de ingang van de stroomcel om het kanaal te vullen. Dicht elke kant van het stroomcelkanaal af met epoxy van vijf minuten. Om de cilindermonsterkamer voor niet-emulsiemonsters te vullen, pipetteert u vijf microliter oppervlakteactieve olieoplossing op de bodem van de glazen cilinderkamer. Kantel en draai de dekslip langzaam om het oppervlak en de onderste cilinder te bedekken met de oppervlakteactieve oplossing. Verwijder overtollige oppervlakteactieve olieoplossing met behulp van een pipet om een dunne laag te verkrijgen en tegelijkertijd volledige verdamping van de olie te voorkomen. Voeg de monsteroplossing onmiddellijk toe aan de kamer. Bedek de kamer met een klein stukje polytetrafluorethyleen of PTFE-tape om verdamping en stroming te voorkomen. Monteer het monster op de microscooptafel. Start time-lapse-beeldvorming van actine met behulp van een 20x, 40x, 60x of 100x objectief met onderdompeling in olie of water om een voldoende hoge numerieke opening te garanderen voor beeldvorming met hoge resolutie. Als polymerisatie in een monsterkamer is, laat polymerisatie dan ongeveer 30 minuten staan of totdat er geen zichtbare filamentverlenging of beweging is. Voeg een crosslinker toe aan het monster en voeg vervolgens myosine toe als pre-gepolymeriseerde filamenten door langzaam ongeveer de helft van het totale volume in het monster te pipetteren. Start ten slotte de time-lapse-beeldvorming. Het representatieve confocale fluorescentiebeeld van het verstrengelde actinenetwerk wordt hier getoond. Het verstrengelde actinenetwerk is gelijkmatig verdeeld over het oppervlak. Heldere vlekken in deze afbeelding vertegenwoordigen overlappingen van filamenten, terwijl donkere gebieden duiden op een minimale aanwezigheid van actine. Thermische fluctuaties leiden tot lokale intensiteitsveranderingen en zichtbare buiging van actinefilamenten. De toevoeging van myosine II veroorzaakt buiging en reorganisatie van het actinenetwerk met zichtbare accumulatie van myosine puncta op lange tijdstippen. Netwerkcontractie is afhankelijk van de myosineconcentratie en ATP-concentratie. In verknoopte actinenetwerken leidt door myosine geïnduceerde contractie tot gecoördineerde beweging over langere lengteschalen in vergelijking met verstrengelde netwerken.