Microfluïdica en fluorescentiemicroscopie gebruiken om de assemblagedynamiek van single actinefilamenten en -bundels te bestuderen

We combineren fluorescentiemicroscopie met microfluïdica om te bestuderen hoe actinebindende eiwitten de assemblage en de demontage van actinefilamenten reguleren. Met microfluïdica zijn we in staat om reacties te kwantificeren die tegelijkertijd op tientallen individuele actinefilamenten plaatsvinden, terwijl we biochemische en mechanische omstandigheden nauwkeurig regelen. Vergeet niet dat oplossingen eerst parallel worden geïnjecteerd totdat ze de kamer bereiken, en vervolgens worden filamenten sequentieel blootgesteld aan elke oplossing door de drukinstelling te wijzigen.

Om de bereiding van polydimethylsiloxaan of PDMS, kamerassemblage te starten, verwarmt u de hete plaat voor op 100 graden Celsius. Stel een gereinigde PDMS-kamer en een glazen deksel in een schone petrischaal drie tot vijf minuten bloot aan ultraviolet licht in een diepe UV-reiniger. Als u klaar bent, plaatst u de PDMS-kamer over de afdekslip, zodat de twee oppervlakken die direct aan UV worden blootgesteld, in contact worden gebracht.

Om luchtbellen te verwijderen die vastzitten in de PDMS-afdeksleufinterface, drukt u voorzichtig met een vinger op het oppervlak van de kamer. Druk sterk op hoeken en zijkanten en zorg ervoor dat het plafond van de kamer niet in contact komt met het glasoppervlak. Plaats de kamer met de glazen bodem naar de kookplaat gericht op 100 graden Celsius gedurende vijf minuten.

Gebruik de kamer dan onmiddellijk, of bewaar het in een schone petrischaal voor een week. Om de inlaat- en uitlaatbuis te spoelen, vult u een reservoirbuis van 2 milliliter met 300 microliter F-buffer, schroeft u deze op de microfluïdische houder en stelt u de druk in op 300 millibar. Laat vijf tot acht druppels F-buffer verloren gaan, stel vervolgens de druk in op nul en herhaal de procedure voor elk kanaal.

Stel vervolgens de druk in voor de uitlaat op de reservoirbuis vier tot 50 millibar, zodra een druppel uit de buispunt komt, sluit u de buis aan op de uitlaat van de PDMS-kamer. Terwijl de vloeistof de kamer vult en uit alle inlaten komt, stelt u de uitlaatdruk in op 20 millibar. Stel later de druk voor de reservoirbuis in op 1 tot 50 millibar.

Om te voorkomen dat er luchtbellen ontstaan, moet u ervoor zorgen dat er een druppel uit de buis en de PDMS-inlaat komt voordat u de buis aansluit op de inlaat. Stel de druk van de inlaat in op 30 millibar. Nadat u de inlaten twee en drie hebt aangesloten zoals gedemonstreerd, stelt u de druk van alle inlaten in op 20 millibar en de uitlaatdruk op nul millibar.

Zorg ervoor dat de stroomsnelheden in de inlaten ongeveer gelijk zijn. Stel bij het vervangen van het reservoir alle inlaatdrukken in op 12 millibar en de uitlaatdruk op 5 millibar. Om snel een oplossing te injecteren, stelt u de druk van de overeenkomstige inlaat in op 150 millibar en past u de druk in de andere inlaten aan op ongeveer 100 millibar, zodat het resulterende debiet in de inlaten 500 nanoliter per minuut is.

Om de oplossing te wijzigen, vult u 200 tot 300 microliter van de oplossing in een nieuwe reservoirbuis en stelt u de druk in op de wijzigingsinstelling. Schroef vervolgens de reservoirbuis van de inlaat los. Zodra zich een kleine druppel heeft gevormd aan de buispunt, schroeft u de nieuwe buis in met de verse oplossing, wijzigt u de drukinstelling in een hoog debiet.

Afhankelijk van de microfluïdische configuratie en een kamergeometrie, wacht u drie tot vijf minuten totdat de oplossing de buis heeft opgevuld en de kamer heeft bereikt. Het proces kan worden gevolgd door de toename van fluorescentie in de loop van de tijd te meten. Voor de oppervlaktefunctionalisatie, verander oplossing drie tot 200 microliter van 50 picomolaire spectrine-actinezaden in F-buffer en injecteer de oplossing gedurende twee minuten met high flow drie.

Voor de oppervlaktepassivering, wisselbuis drie met 300 microliter van 5% BSA in F-buffer, injecteer vervolgens gedurende vijf minuten bij high flow drie, gevolgd door vijf minuten bij midflow drie, met verminderde druk van zeven tot acht millibar in kanalen één en twee om een tegenstroom van 100 nanoliter per minuut te krijgen. Het gehele kameroppervlak wordt gepassiveerd. Verander buis drie naar F-buffer om het kanaal gedurende vijf minuten te spoelen bij high flow drie.

Verander later buizen één tot drie met respectievelijk één micromolaire actine profiline, 0,15 micromolaire actine en F-buffer, zoals uitgelegd in het manuscript, en injecteer vers bereide oplossingen met behulp van de hoge stroom die allemaal vooraf is ingesteld gedurende drie tot vier minuten. Schakel de microscoop in en pas de belichtingstijd van de camera aan op 100 tot 200 milliseconden, de excitatielaser op 10 tot 20% vermogen en de totale interne reflectiefluorescentie, of TIRF-diepte, op 200 tot 300 nanometer om de beelden vast te leggen met een 60X-objectief. Stel vervolgens de drukinstelling in op midflow één gedurende 10 minuten om de filamentpolymerisatie te registreren met een snelheid van één frame elke 20 seconden, gevolgd door midflow twee gedurende 15 minuten voor filamentveroudering.

Leg depolymerisatie vast in de epifluorescentiemodus bij één frame elke vijf seconden, schakel na één tot twee frames over naar midflow drie om filamenten op te nemen die depolymeriseren met ongeveer 10 subeenheden per seconde. Om het experiment te resetten, breekt u alle fluorescerend gelabelde filamenten door ze gedurende twee minuten continu bloot te stellen aan de laser met maximaal vermogen. Test verschillende omstandigheden door oplossingen één, twee of drie te vervangen en ze gedurende drie tot vier minuten met een hoog debiet te injecteren.

De uitkomst van het basispolymerisatie/depolymerisatie experiment wordt hier gepresenteerd. De resulterende kymografen werden gebruikt om de polymerisatie- en depolymerisatiesnelheden te kwantificeren. Wanneer de gekweekte actinefilamenten werden blootgesteld aan een fluorescerend gelabelde cofilin-oplossing, werden cofilinclusters nucleated en groeiden ze naar de puntige en prikkeldraadeinden.

Wanneer afzonderlijke filamenten worden blootgesteld aan fascin, vormen ze bundels die helderder lijken en niet perfect zijn uitgelijnd met de stroom. Het is erg belangrijk om te voorkomen dat er luchtbellen in het systeem worden geïntroduceerd bij het vervangen van buizen en let op dat reservoirbuizen niet leeg raken. Deze techniek was van cruciaal belang om trekkrachten toe te passen op tientallen afzonderlijke filamenten, te kijken naar de mechanische gevoeligheid van formin en cofilin en ARP2 / 3-debranching.