In kaart brengen van disfunctionele eiwit-eiwitinteracties bij ziekte

Ons werk brengt disfunctionele eiwit-eiwitinteracties direct in kaart vanuit inheemse cellen en weefsels, waarmee wordt onthuld hoe ziekte cellulaire netwerken herbedraad. In tegenstelling tot de meeste interatomaire methoden vereist dfPPI geen genetische engineering en vaardigheden voor patiëntencohorten, waarbij per monster één multiplex-vangst wordt gebruikt. Om te beginnen bereid je een eiwitextractiebuffer voor met 20 millimolaire Tris, 20 millimolaire kaliumchloride, 5 millimolaire magnesiumchloride en 0,01% Nb-40.

Voeg direct voor gebruik protease- en fosfataseremmers toe en houd de buffer op ijs. Plaats het bevroren weefselmonster in een micro-tissue homogenisatorbuis voorzien van een stamper. Voeg 500-700 microliter van de native lysisbuffer toe, waarbij het volume wordt aangepast op basis van weefselcompactheid en het gemak van homogenisatie.

Homogeniseer vervolgens het monster op het ijs door de stamper voorzichtig op en neer te bewegen en tegen de schuurwanden totdat een uniforme suspensie is verkregen. Incubeer de lysaten op 4 graden Celsius gedurende 30 minuten door het flesje op een rotatie-eenheid te plaatsen. Meng de monsters voorzichtig tijdens de incubatie door de rotatie.

Met een benchtopcentrifuge centrifugeer je de monsters op 13.000 G gedurende 10 minuten bij 4 graden Celsius om cellulair afval te verwijderen. Verzamel voorzichtig de supernatanten en doe ze over in doorzichtige microcentrifugebuizen van 1,5 milliliter. Bepaal de totale eiwitconcentratie in het supernatant met behulp van de BCA Assay Kit volgens de instructies van de fabrikant.

Neem vervolgens een aliquot polyurethaankralen rechtstreeks van de isopropanolkol. Laat de kralen bezinken om het opslagwater te verwijderen. Aspireer voorzichtig de isopropanol, voeg dan native lysisbuffer toe en suspendeer de kralen volledig opnieuw door zacht pipetteren of inversieën.

Om de kralen te wassen en in evenwicht te brengen, vortex je de buis en centrifugeer je hem. Daarna aspireer je het supernatant met een vacuümleiding met een pipetpunt, waarbij je erop let dat de pellet niet wordt verstoord. Voeg bindende buffer toe aan de gewassen kralen in een gelijke verhouding om een uniforme werkkralenslurry te creëren.

Aliquot 40 microliter polyurethaankraal-kraalslib in 1,5-milliliter microcentrifugebuizen, met een afgeknipte pipettip voor een soepele doseer. Was de kralen vervolgens drie keer met een native lysisbuffer door 1 milliliter buffer aan elke buis toe te voegen. Vortex de buis om de kralen opnieuw te laten hangen, centrifugeer dan op 10.000 G gedurende 1 minuut en verwijder de supernatant door aspiratie.

Na de laatste wasbeurt verwijder je het grootste deel van het resterende vocht uit de buizen, zodat de kraalkorrel ongestoord blijft. Voeg de genormaliseerde eiwitextracten toe aan individuele 1,5-milliliter microcentrifugebuizen met 40 microliter control bead slurry. Stel het uiteindelijke volume aan op 250 microliter door de juiste hoeveelheid native lysisbuffer toe te voegen.

Incubeer de monsters bij 4 graden Celsius gedurende 30 minuten met rotatie op een end-over-end rotator die werkt op 10-15 omwentelingen per minuut. Centrifugeer de buizen op 10.000 G gedurende 1 minuut bij 4 graden Celsius om de controlekorrels samen met geaggregeerde of onoplosbare eiwitten te pelleteren. Verzamel voorzichtig het supernatant uit de controlekralen met een pipet van 1 milliliter en doe het over in verse 1,5-milliliter buizen met 40 microliter gewassen polyurethaankraal-slurry.

Incubeer de monsters bij 4 graden Celsius gedurende 3 uur met rotatie op een end-over-end rotator. Na het zorgvuldig centrifugeren van de buizen, aspireer je het supernatant en was je de kralen vier keer, zoals eerder gedemonstreerd. Verwijder eventuele resterende PBS uit de tube.

Suspendeer de gewassen kralen opnieuw in 80 microliter 2 molair ureum, vers bereid in 50 millimolair ammoniumbicarbonaat bij pH 8,5 door pipetten of korte vortex. Voeg vervolgens dithiothreitol toe om een eindconcentratie van 1 millimolar te bereiken. Na het afsluiten van de buis, incubeer je 30 minuten bij 37 graden Celsius met schudden van 1.100 omwentelingen per minuut op een verwarmde orbitale shaker.

Voeg jodoacetamide toe om een uiteindelijke concentratie van 3,67 millimolaar te bereiken. Incubeer de buizen in het donker op kamertemperatuur gedurende 45 minuten met schudden op 1.100 omwentelingen per minuut. Voeg nu extra dithiothreitol toe om eventuele niet-gereageerde jodoacetamide te blussen, zodat je een eindconcentratie van 3,67 millimolair hebt, en meng voorzichtig door te pipetten.

Voeg 750 nanogram van 0,5 milligram per milliliter massaspectrometrie-kwaliteit Lys-C protease toe aan het monster. Breng het mengsel 1 uur uit op 37 graden Celsius met schudden op 1.150 omwentelingen per minuut. Voeg vervolgens 750 nanogram vers bereide tripsin van 0,5 milliliter per milliliter sequencing-grade toe aan het monster.

Breng het mengsel een nacht uit bij 37 graden Celsius met schudden van 1.150 omwentelingen per minuut. De volgende dag centrifugeer je het monster op 1.000-5.000 G gedurende 1-5 minuten op kamertemperatuur. Breng het supernatant voorzichtig over in een verse microcentrifugebuis van 1,5 milliliter met een pipet, en gooi de kralen weg.

Pas de pH van de digestie aan tot onder de 3 door 50% trifluorazijnzuur druppelgewijs toe te voegen. Controleer de pH met indicatorstrips. PU-beads vingen HSP90, HSC70 en hete eiwitten sterk op uit het epichaperome hoge lysaat met minimale signalen van het epichaperome lage lysaat, wat de biologische specificiteit van de sonde bevestigt.

Het vrachtprofiel van de PU-kraal toonde een rijk, hoog moleculair gewicht signaal in de PU-kralenbaan en minimale achtergrond in de controlekraalbaan, wat de succesvolle probe-activiteit bevestigde. Coomassie-gekleurde SDS-PAGE-gels vertoonden een consistente bandverdeling over vier in-gel bewerkte monsters, waarmee succesvolle verrijking van eiwitcomplexen uit native lysaten vóór massaspectrometrie werd bevestigd. Technische reproduceerbaarheid werd bevestigd door principal component-analyse, waarbij replicatiemonsters dicht op elkaar geclusterd waren terwijl verschillende monsters schoon van elkaar werden gescheiden.

Precursorionenintensiteitsverdelingen toonden aan dat de meeste kenmerken variatiecoëfficiënten onder 20% hadden, met mediane waarden tussen 9,7% en 11,9% over de monsters, wat consistente peptidedetectie en -herstel bevestigde. Hiërarchische clustering van log-getransformeerde eiwitabundanties toonde sterke monsterafscheiding en behouden variatie tussen monsters met eiwitintensiteiten variërend van lage abundantie tot sterk verrijkte eiwitten. Pathway-verrijkingsanalyse toonde brede annotatiedekking aan over meerdere ontologieën, waaronder genontologiecategorieën en gecureerde databases, zoals Reactome, KEGG en WikiPathways.

dfPPI stelde ons in staat mechanistische en therapeutische inzichten te ontdekken die andere benaderingen simpelweg niet kunnen bereiken. dfPPI brengt interomics naar het niveau van echte ziektecohorten en de inheemse aandoeningen, waardoor precieze mechanistische en therapeutische hypotheses mogelijk worden. We breiden nu dfPPI uit om netwerkniveauveranderingen bij neurodegeneratieve ziekten, zoals Alzheimer en Parkinson, in kaart te brengen.