Chirurgisch protocol voor een groot, herafsluitbaar schedelraam dat longitudinale, multimodale elektrofysiologische opnames van het muis default mode netwerk mogelijk maakt

Het Default Mode Network, of het DMN, is een cruciaal, grootschalig netwerk, betrokken bij een reeks cognitieve functies en neuropsychiatrische aandoeningen zoals depressie. Het bestuderen van de complexe dynamiek van het DMN in diermodellen levert onschatbare inzichten op in de functie ervan in zowel gezonde als pathologische toestanden. Een belangrijke uitdaging is echter geweest om stabiele, langdurige en grootschalige elektrofysiologische opnames uit te voeren van de meerdere diepe en verspreide knooppunten, de DMN, in wakkere, zich gedragende muizen.

Hier presenteren we een nieuw tweefasen-chirurgisch protocol ontwikkeld in het laboratorium van Eero Castren. Deze techniek creëert een groot, duurzaam en herafsluitbaar schedelraam dat herhaalde longitudinale opnames van meer dan 1.000 elektrodekanalen gelijktijdig mogelijk maakt. Dit wordt bereikt door micro-elektrocorticografie op oppervlakteniveau, micro-ECoG, te combineren met twee Neuropixels-probes, waardoor ongekende toegang tot het Default Mode Network mogelijk is.

Deze video biedt een stapsgewijze gids voor deze robuuste chirurgische procedure, van diervoorbereiding en implantatie van de hoofdplaat tot het creëren van het chronische craniale venster, waarmee hoogwaardige, langdurige dataverzameling voor netwerkneurowetenschappelijk onderzoek wordt gegarandeerd. Alle getoonde procedures zijn goedgekeurd door de Nationale Proefraad in Finland en voldoen aan de Europese richtlijn ter bescherming van dieren die voor wetenschappelijke doeleinden worden gebruikt. Fase 1, Diervoorbereiding en Hoofdplaatimplantatie.

Om deze procedure uit te voeren, begint u met het voorbereiden van alle benodigde chirurgische materialen en apparatuur. Verdoof de muis met 4% isofluraan en houd de anesthesie op 1,5 tot 2,5% met een zuurstofstroom van 0,5 liter per minuut. Scheer de vacht vanaf de bovenkant van het hoofd en leg het dier op een gecontroleerde verwarmingskussen met een interne temperatuursensor die is gekalibreerd om de lichaamstemperatuur gedurende de procedure op 37 graden Celsius te houden.

Breng carbomer oogzalf aan om uitdroging van het hoornvlies te voorkomen. Bevestig de muis in het stereotactische frame zodat de schedel plat ligt en dien preoperatieve pijnstillers en ontstekingsremmers toe via subcutane injecties, carprofen, buprenorfine en dexamethason. Desinfecteer het geschoren gebied met povidon-jodiumoplossing en injecteer lidocaïne-epinefrine-oplossing als lokaal anestheticum onder de huid van de hoofdhuid.

Maak een kleine dwarsdoorsnee bij de earline en vergroot de incisie geleidelijk zodat de bovenkant van het schedeloppervlak volledig blootligt. Maak de blootgestelde schedel zorgvuldig schoon met aceton totdat al het zichtbare periost is verwijderd om een sterke hechting van het implantaat te garanderen. Gebruik een stompe, ronde scalpelmesje om eventuele restanten van periosteale en bindweefselfragmenten te verwijderen die de acetonspoeling niet volledig heeft opgelost.

Met het stereotactische apparaat markeer je een rechthoekig oppervlak van 4 bij 7,6 millimeter op de schedel ten opzichte van bregma. De rechthoek moet twee millimeter zijwaarts vanaf bregma aan beide zijden uitstrekken, drie millimeter rostral en 4,6 millimeter caudaal. Markeer vervolgens de twee intracraniële inbrengplaatsen van de probe op de rechterhersenhelft.

Markeer de rostrale probe-plaats op 1,66 millimeter vooraan en 1,95 millimeter lateraal van bregma, en de caudale probe-plaats op 2,2 millimeter posterior en 1,9 millimeter lateraal van bregma. Vervolgens graveer je een kruispatroon over alle blootgestelde botoppervlakken buiten het aangewezen raamgebied met een chirurgisch mes nummer 11, en maak je een ondiepe maar gedefinieerde groeven van ongeveer 0,2 tot 0,4 millimeter diep om een uniform raster van ongeveer één bij één millimeter te vormen. Maak een fijne lijmapplicator door een steriele 30G-naald op de punt van een wattenstaafje te plaatsen en de naald in een V-vorm te buigen.

Doe cyanoacrylaatlijm in een wegwerpplastic weegboot en doop de applicator in het lijmreservoir. Plak lijm aan over elk blootgesteld en gegraveerd botoppervlak, waarbij je niet meer dan één afzetting per plek aanbrengt zodat de dekking grondig is, maar nooit overdreven. Laat de lijm zeven minuten drogen voordat je verder gaat.

Voor het implanteren van de referentiesocket kies je de boorplaats boven de positie van het linker cerebellum om zichtbare oppervlakkige vaten te vermijden. Boor het pilotgat in vijf tot tien seconden durende bursts met een ronde stalen braam van 20.000 tot 25.000 patronen per minuut totdat het gat transparanter wordt en een lichtroze tint onthult. Plaats de vergulde referentiedop in het pilotgat, bevestig deze met cyanoacrylaatlijm en versterk de verbinding met UV-uithardbare tandcement.

Hard het tandcement uit met een LED-uithardende penlamp gedurende één minuut. Vervolgens plaats je een kleine hoeveelheid UV-uithardend tandcement op de top van het blootliggende rostralbot en leg je de hoofdplaat onder de schedel zodat één rand op de cementsteiger rust, uitgehard rond de referentiesocket, en de tegenoverliggende rand rust op de verse rostralcementdab. Zorg dat de kopplaat gecentreerd en waterpas is.

Versterk de structuur door tandcement aan te brengen rond de basis van de hoofdplaat en rond het gegraveerde bot en de referentiesocket te cirkelen totdat er een doorlopende, afgesloten omheining rond de omtrek van het toekomstige schedelraam is gevormd. Tot slot heb ik het tandcement uitgehard met het LED-uithardingslampje voor één minuut. Zodra het cement volledig is uitgehard, laat de muis dan wakker worden uit de narcose.

De eerste fase is nu voltooid. Laat de muis minstens 48 uur herstellen voordat je doorgaat naar de volgende fase. Fase 2, Chronische Schedelraamcreatie.

De tweede fase vereist dezelfde hulpmiddelen en medicatie als de eerste fase, behalve de lokale verdoving. Daarnaast vereist deze fase een steriel, dun PDMS-membraan, koude, kunstmatige cerebrospinale vloeistof die op ijs wordt gehouden, een elastomeersiliconenkit en een op maat gemaakte 3D-geprinte beschermkap. Minstens 48 uur na de eerste operatie opnieuw verdoofen met isoflurane, plaats deze op het verwarmingskussen op het stereotactische frame en dien de preoperatieve medicijnen toe zoals in de eerste fase, behalve de lidocaïne-epinefrine lokale verdoving.

Begin met het verdunnen van het bot met de tandboor langs de rechthoekige omtrek die in Fase 1 is aangegeven, beginnend bij 25.000 patronen per minuut met het boorapparaat in een hoek van 90 graden ten opzichte van het botoppervlak, en voer één of twee iets diepere passen uit langs de rechthoekige randen om een eerste snijgroef te creëren. Boor ondiepe groeven in het bot en tandcement naast het schedelraam bij de twee probe-insertiecoördinaten. Deze groeven dienen als de blijvende visuele herkenningspunten die zichtbaar blijven nadat de botflap is verwijderd en worden gebruikt om de intracraniële probes herhaalbaar te positioneren in latere elektrofysiologische sessies.

Breng ijskoude, steriele kunstmatige hersenvocht regelmatig toe tijdens het boren om thermische schade aan de onderliggende cortex te voorkomen en bloedingen te minimaliseren. Verlaag de boorsnelheid geleidelijk tot 20.000 schoten per minuut naarmate het bot dunner wordt. Blijf boren langs de rechthoekige rand totdat het bot binnen de omtrek ongeveer voor 90% is verdund.

Boor niet helemaal door de schedel. Schakel over op de fijn gebogen dura-haak. Steek de punt met uiterste voorzichtigheid onder de rand van het dunne bot in en schuif de haak langs de raamomtrek, waarbij je voorzichtig de botflap losmaakt van de omliggende schedel en het onderliggende weefsel.

Til de succesvol losgemaakte botflap voorzichtig op met de dura-haak in een achter- naar voorste richting tot ongeveer 35 graden boven het schedeloppervlak. Pak de opgetilde rand vast met de tang en zwaai zachtjes naar links en rechts totdat de plaat volledig loslaat. Maak het blootgestelde gebied voorzichtig schoon van gestold bloed met herhaalde washes van ijskoude ACSF.

Plaats een enkele steriele prefab PDMS-membraan direct onder het durale oppervlak zodra het bloeden is afgenomen. Wanneer het de juiste grootte heeft, zal het het raam precies bedekken en passief aan de dura hechten, waardoor het vlak tegen de hersenen wordt gehouden. Sluit de craniotomie af door siliconenkit aan te brengen.

Vul elke kier tussen het tandcementomhulsel en de binnenrand van de hoofdplaat, zodat de randen van het BDMS-membraan volledig omsluiten en overlappen. Bevestig een op maat gemaakte 3D-geprinte beschermkap op de hoofdplaat met een kleine hoeveelheid cyanoacrylaatlijm om het raam tussen de opnamesessies te beschermen. De muis is nu klaar voor herstel en moet worden overgebracht naar zijn thuiskooi voor individuele huisvesting om schade aan het implantaat te voorkomen.

Een geslaagde operatie resulteert in een helder, transparant venster over de cortex, met zichtbare bloedvaaten en minimale tekenen van ontsteking of infectie. Deze helderheid kan meer dan 21 dagen worden gehandhaafd, waardoor langdurige longitudinale studies mogelijk zijn. Ruwe elektrofysiologische signalen die via het chronische venster werden opgenomen, behielden hoge kwaliteit gedurende de longitudinale tijdlijn.

Hier worden representatieve breedbandige micro-ECoG-sporen, bemonsterd van een posterior retrospleniaal rooster en gelijktijdige intracraniële probe lokale veldpotentiaalsporen afkomstig van een oppervlakkig corticaal kanaal, naast elkaar getoond voor de eerste opnamedag en 21 dagen daarna. Opnames van dag 21 vertonen vergelijkbare signaalamplitude, spectrale inhoud en afwezigheid van bewegings- en ruisartefacten ten opzichte van dag-0-opnames van hetzelfde dier, wat bevestigt dat noch de chronische aanwezigheid van het PDMS-membraan- en siliconenafdichting, noch de herhaalde durale puncties een detecteerbare degradatie van het oppervlak of de intracraniële sondesignaalkwaliteit veroorzaakten in oppervlakkige corticale lagen, waar degradatie als eerste zou worden verwacht. De primaire validatie van deze techniek is het verzamelen van stabiele, hoogwaardige multimodale elektrofysiologische gegevens in de loop van de tijd.

Het hersluitbare venster maakt het mogelijk om herhaaldelijk probes in te brengen om van dezelfde neuronale populaties over weken te registreren. Over de alfa-band tonen fasevergrendelingswaardematrices, berekend vanuit kanalen langs de caudale high-density intracraniële elektrodeprobe, een stabiele functionele architectuur tussen de baseline en de dag 21 post-behandelingssessie. Dit toont reproduceerbare herinsertie naar dezelfde corticale locatie in plaats van formeel traceren van dezelfde individuele neuronen.

Hoewel een kleine intercessietranslatie van de schacht een gelijke eenheidsclaim uitsluit, blijft de aggregaatlaminaire en regionale structuur van de alfabandinteracties behouden, wat ondersteunt dat het chronische venster longitudinale bemonstering van hetzelfde functionele circuit mogelijk maakt. Om direct te verifiëren dat het chronische venster reproduceerbare laminaire targeting van dezelfde diepe structuren over sessies heen ondersteunt, werden current source density- of CSD-kaarten berekend van de LFP-kanalen van de probes. Stimulus-geëvokeerde CSD-profielen tonen aan dat de verwachte laminaire sinkbronsignaturen, waaronder de prelimbische cortex en het anterieure cingulate gebied, tussen sessies behouden blijven.

De laminaire vermogensprofiel-overlays tussen de twee sessies zijn zeer vergelijkbaar tussen sessies, waarbij de Pearson-correlatie 0,81 is. De verschillen die in de secundaire motorische cortex worden waargenomen, zijn waarschijnlijk te wijten aan bewegingsverschillen tussen opnames. Omdat CSD-plotten anatomische informatie bevat, kan het een niet-terminale uitlezing binnen de sessie geven van welke hersengebieden elke sonde momenteel bemonstert, onafhankelijk van postmortale weefselkleuringen.

De reproduceerbaarheid van micro-ECoG-plaatsing aan het oppervlak over sessies wordt kwantificeerd onafhankelijk van de intracraniële CSD-uitlezing. Bandbeperkte ruimtelijke vermogenskaarten die worden berekend vanuit het micro-ECoG-raster op Dag 0 en Dag 21 worden over elkaar heen gelegd, en de pixelgewijze correlatie van de twee kaarten wordt afzonderlijk berekend voor de rostrale en caudale subroosters. Sub-grid profielcorrelaties blijven hoog en de ruimtelijke barcodes van de twee sessies co-lokaliseerden zichtbaar dezelfde corticale energiehotspots op zowel de rostrale als de caudale helft van de array.

Een sinusvormige uitlijningslijn die zichtbaar is door het doorschijnende rooster, samen met de gegraveerde botgroeven bij de inzetcoördinaten van de probe, ondersteunt daarom millimeterschaal reproduceerbaarheid van micro-ECoG-plaatsing over het longitudinale interval van 21 dagen. Om de techniek verder te valideren, werden immunohistochemische kleuringen uitgevoerd voor GFAP en IBA1 in postmortale hersensneden ongeveer vier weken na de craniotomie. GFAP worden tot expressie gebracht door astrocyten, die worden opgereguleerd bij reactieve gliose zoals hersenletsel of ontsteking.

IBA1 daarentegen wordt tot expressie gebracht door microglia, die actiever zijn tijdens neuro-inflammatoire processen. De validatiecohort bestond uit dieren waarbij de volledige tweefasenoperatie werd uitgevoerd en het craniale venster vervolgens drie keer werd heropend op postoperatieve dag 0, 21 en 22. In deze cohort werden echter geen micro-ECoG-plaatsingen of intracraniële probe-inserties uitgevoerd.

Het venster werd tussen sessies opnieuw afgesloten, zoals tijdens een elektrofysiologische opname. Deze cohort isoleert daarom de ontstekingsbijdrage van het chronische venster en herhaalde durale blootstelling van eventuele door de sonde veroorzaakte weefselschade. Er werden geen significante verschillen waargenomen in beide markers tussen de controlegroep zonder chirurgie en de voertuiggroep die de operatie onderging.

Deze representatieve microfoto's tonen geen kwalitatief bewijs van reactieve gliose of microgliale activatie in het gebied direct onder het venster. Echter, er werd een lichte toename van microgliale en astrocytenactivatie waargenomen, respectievelijk naast het traject van de probe en in de hemisfeer van de probe-insertie, wat waarschijnlijk het gevolg kan zijn van de te hoge insertiesnelheid van de intracraniële probe. Een succesvolle operatie resulteert in een helder, transparant venster over de cortex met minimale ontsteking.

Na de chronische behandelperiode kan er wat zwelling van de hersenen optreden. Dit kan worden beheerd met zorgvuldige monitoring en, indien nodig, het toedienen van aanvullende pijnstillers. Voor opnames verwijder je simpelweg de kap en de sealant, plaats je de micro-ECoG-rasters en Neuropixels-probes en begin je met het verzamelen van gegevens van het wakkere, zich gedragende dier.

Samenvattend biedt dit tweefasige chirurgische protocol een betrouwbare en zeer effectieve methode om een groot, chronisch craniaal venster bij muizen te creëren. De belangrijkste voordelen van de procedure zijn de minimale schade aan de dura en de grote blootstelling die het biedt, wat cruciaal is voor de gelijktijdige plaatsing van zowel oppervlakte micro-ECoG-roosters als meerdere diepe hersen-neuropixelsondes. Deze methode maakt ongekende longitudinale onderzoeken mogelijk van netwerkbrede elektrofysiologische dynamica in het DMN en andere grootschalige circuits.

Het opent de deur naar diepgaand onderzoek naar neurale onderbouwingen van complexe gedragingen en de pathofysiologie van hersenaandoeningen, wat uiteindelijk helpt bij de ontwikkeling van nieuwe therapieën.