Name: confocal microscopy for protein localization
Uploaded: 2023-04-30T07:08:35.000Z
Duration: 13 min 13 s
Channel: JoVE

1. Materiały
Bufory
<ol>
	<li>Bufor do przemywania : 1 X sterylny roztwór soli fizjologicznej buforowany fosforanami (PBS) bez wapnia i magnezu</li>
	<li>Bufor utrwalający: 1% paraformaldehyd w PBS</li>
	<li>Bufor przepuszczalny: 0,1% Triton X-100 w PBS</li>
	<li>Bufor blokujący: 1% albuminy surowicy bydlęcej w PBS</li>
	<li>Pożywka do wzrostu komórek: DMEM uzupełniony 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS), penicyliną/streptomycyną i L-glutaminą</li>
</ol>
Sprzęt
<ol start="6">
	<li>Okap z przepływem laminarnym</li>
	<li>Inkubator nawilżany (37°C, 5% CO2)</li>
	<li>Konfokalny laserowy mikroskop skaningowy; tutaj, Nikon Eclipse Ti laser</li>
</ol>
Materiały i odczynniki
<ol start="9">
	<li>Szkiełka do hodowli komórkowych w komorze </li>
	<li>Antyblakowy nośnik montażowy z DAPI (do barwienia jąder)</li>
	<li>Szklana osłona mikroskopu</li>
	<li>Delikatne chusteczki zadaniowe</li>
	<li>Pipety i końcówki</li>
</ol>
Odczynniki specyficzne dla testów
<ol start="14">
	<li>Komórki przylegające (pierwotne komórki lub linie komórkowe); tutaj użyto mysich fibroblastów transfekowanych CD1d (LCD1). </li>
	<li>Przeciwciała pierwszorzędowe do wykrywania celów komórkowych; tutaj użyto szczurzego anty-mysiego CD107a (LAMP-1) i mysiego anty-mysiego CD1d. </li>
	<li>Przeciwciała drugorzędowe sprzężone z fluoroforem specyficzne dla pierwszorzędowych izotypów przeciwciał; tutaj zastosowano antyszczurzą IgG skoniugowaną z Alexafluorem 488 i anty-mysią IgG skoniugowaną z Alexafluorem 647. </li>
</ol>
2. Protokół
Przygotowanie do barwienia przeciwciał
Wysiewanie komórek
<ol>
	<li>Ponownie zawieś interesujące komórki w pożywce wzrostowej. </li>
	<li>Następnie wysiewać 500 μl zawiesiny komórkowej / na studzienkę do dołków 4-dołkowego szkiełka komorowego. (W tym przypadku komórki LCD1 wysiewano w 2,5x105 komórek/komorę w 500 μl pożywki wzrostowej. Gęstość wysiewu może się różnić w zależności od linii komórkowych). </li>
	<li>Inkubować szkiełko komorowe przez noc w inkubatorze o stężeniu 5% CO2 w temperaturze 37°C, aby komórki mogły przylegać do szkła. </li>
	<li>Następnego dnia odessać pożywkę z każdej studzienki, a następnie przemyć komórki 1X 500 μl PBS. </li>
</ol>
Fiksacja
<ol start="5">
	<li>Aby utrwalić komórki, dodaj 500 μl 1% roztworu paraformaldehydu do każdej studzienki i inkubuj przez 15 minut w temperaturze pokojowej. </li>
	<li>Po inkubacji należy zebrać paraformaldehyd do odpowiedniego pojemnika na niebezpieczne odpady płynne. </li>
	<li>Następnie przemyj komórki 3 razy 500 μl PBS, aby usunąć wszelkie pozostałości utrwalacza. </li>
</ol>
Przenikanie
<ol start="8">
	<li>Przepuszczalność komórek przez inkubację z 500 μl buforu/studzienki przepuszczalnej przez 15 minut w temperaturze pokojowej. </li>
	<li>Następnie przemyj komórki krótko 3 razy 500 μl PBS. </li>
</ol>
Blokowanie
<ol start="10">
	<li>Inkubować komórki w każdym dołku z 500 μl buforu blokującego przez 1 godzinę w temperaturze 4°C, aby zablokować niespecyficzne wiązanie przeciwciał. </li>
</ol>
Inkubacja przeciwciał pierwotnych
<ol start="11">
	<li>Zassać bufor blokujący z komór suwakowych. </li>
	<li>Następnie dodaj 500 μl rozcieńczonego roztworu przeciwciała pierwszorzędowego do komórek. (W tym przypadku anty-CD107a (LAMP-1) rozcieńczono w stosunku 1:500, a anty-CD1d użyto w postaci nierozcieńczonej (przeciwciało monoklonalne 1H6 zostało uprzejmie dostarczone przez dr Randy'ego Brutkiewicza)). </li>
	<li>Inkubować szkiełka przez noc w temperaturze 4°C.</li>
</ol>
Uwaga: W przypadku sondowania więcej niż jednego celu upewnij się, że przeciwciała pierwszorzędowe są różnymi izotypami. Zalecane stężenia przeciwciał różnią się w zależności od producenta i należy je miareczkować przed użyciem. 
Inkubacja przeciwciał wtórnych
<ol start="14">
	<li>Odessać pierwotny roztwór przeciwciała ze studzienek. </li>
	<li>Umyj komory studzienne 4 razy 500 μl PBS. </li>
	<li>Następnie dodaj 500 μl rozcieńczonego roztworu przeciwciał drugorzędowych do każdej studzienki. (W tym przypadku oba przeciwciała drugorzędowe - anty-mysie IgG Alexafluor 647 i anty-szczurze IgG Alexafluor 488 zostały rozcieńczone w stosunku 1:2000 w buforze blokującym). </li>
	<li>Inkubować w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę w ciemności. </li>
	<li>Po inkubacji odessać wtórny roztwór przeciwciała. </li>
	<li>Przemyć komory 4 razy 500 μl PBS w celu usunięcia wszelkich niezwiązanych przeciwciał drugorzędowych. </li>
</ol>
Uwaga: Zalecane stężenia przeciwciał różnią się w zależności od producenta i należy je miareczkować przed użyciem. W przypadku sondowania więcej niż jednego celu, przeciwciała drugorzędowe muszą być sprzężone z różnymi fluoroforami o unikalnych widmach wzbudzenia/emisji. Należy również pamiętać o wzbudzeniu/emisji przeciwbarwienia jądrowego (tj. DAPI) podczas wyboru fluoroforów. Na wybór fluoroforu może mieć wpływ konfiguracja laserowa zastosowanego mikroskopu konfokalnego. Konfiguracja lasera maszyny będzie dyktować, które fluorofory są odpowiednie do eksperymentu. 
3. Montaż szkiełek nakrywkowych
<ol>
	<li>Najpierw ostrożnie wyjmij komory ze szkiełka. </li>
	<li>Następnie przytrzymaj szkiełko pod kątem nad delikatną chusteczką zadaniową i usuń płyn z krawędzi, nie dotykając komórek. </li>
	<li>Dodaj 1 kroplę pożywki montażowej zapobiegającej blaknięciu, zawierającej barwnik jądrowy DAPI, na każdą sekcję komórek. </li>
	<li>Następnie umieść szkiełko nakrywkowe o wymiarach 20 mm x 60 mm na szkiełku, przytrzymując je nad krawędziami opuszkami palców. (Unikaj tworzenia się pęcherzyków na komórkach, ponieważ zakłócają one obrazowanie). </li>
	<li>Zetrzyj wszelkie dodatkowe podłoże montażowe po bokach delikatną ściereczką zadaniową i przechowuj szkiełka w ciemności w temperaturze pokojowej do tygodnia. </li>
</ol>
4. Obrazowanie konfokalne
Próbki obrazu w konfokalnym laserowym mikroskopie skaningowym. W przypadku danych pokazanych na rysunku 2 użyto aparatu Nikon Eclipse Ti A1R z oprogramowaniem NIS Elements Advanced Research. Poniższa sekcja zawiera szczegółowe informacje na temat procedury przechwytywania obrazów za pomocą wyżej wymienionego oprogramowania. 
<ol>
	<li>Aby rozpocząć obrazowanie komórek, otwórz oprogramowanie ' NIS Elements Advanced Research', klikając na ' ikonę oprogramowania NIS.'</li>
	<li>Następnie w oknie sterowania kliknij zakładkę "TiPad" i wybierz żądany cel obrazowania. (W tym przypadku użyto pierwszego obiektywu 40x). </li>
	<li>Załaduj slajd z komórkami na stół montażowy i wyśrodkuj go pod obiektywem. </li>
	<li>Teraz w zakładce 'A1plus Compact GUI' ustaw lasery odpowiednie dla używanych fluoroforów. Kliknij symbol koła zębatego, aby otworzyć menu ustawień barwnika i spektralnego, a następnie wybierz potrzebne kanały i ustaw laser dla każdego kanału. </li>
	<li>Następnie wybierz odpowiednie emisje z menu rozwijanego pod pierwszym lustrem dichroicznym. </li>
	<li>Następnie, w oknie 'A1plus Compact GUI', kliknij na 'Ch. Series', aby skonfigurować serię kanałów liniowych, która określa, czy używane lasery będą działać na próbce jednocześnie, czy sekwencyjnie. (W tym przypadku wybrano sekwencyjne przejścia, zaczynając od kanału 1, następnie kanału 2, a następnie 4). </li>
	<li>Następnie rozpocznij skanowanie, klikając ikonę "Strzałka" u góry. W tym momencie, gdy obrazowanie jest na żywo, w oknie "A1plus Compact GUI" kliknij przesuwaną skalę i zmodyfikuj rozmiar otworka, aby zapewnić ograniczenie nieostrego światła. (W tym przypadku użyto najniższego dostępnego ustawienia (0,5). </li>
	<li>Następnie dostosuj ustawienia 'high voltage' i 'offset' pod każdym laserem do odpowiednich poziomów, używając przesuwanych skal, aby umożliwić wykrycie określonego zabarwienia, jednocześnie ograniczając potencjalne przebarwienia tła. Jeśli dostępna jest próbka do barwienia dodatniego, zacznij od zobrazowania tej próbki dla każdego kanału, aby upewnić się, że ustawienia lasera zapewniają optymalny stosunek sygnału do szumu. 
	Uwaga: wysoka intensywność lasera przez dłuższy czas może powodować fotowybielanie. </li>
	<li>Po ustawieniu optymalnych wartości HV i offsetu dla każdego lasera, kliknij zakładkę 'ND Acquisition', a następnie wybierz ikonę 'Z', aby ustawić parametry dla serii z. Następnie, podczas pobierania obrazu na żywo próbki, najpierw ustaw dół, znajdując dolną część obrazu i klikając przycisk 'bottom', a następnie znajdź górną pozycję próbki i kliknij przycisk 'top'. Ustaw rozmiar kroku, wpisując preferowany rozmiar kroku w μm dla każdego kroku lub określając, ile kroków jest potrzebnych. </li>
	<li>Po ustawieniu parametrów serii Z wybierz żądany rozmiar/rozdzielczość obrazu w pikselach. Aby to zrobić, kliknij okno 'A1plus Compact GUI' i pod ikoną 'size' wybierz żądaną rozdzielczość. Aby zmniejszyć szum obrazu, można wybrać menu rozwijane obok symbolu "ø", aby uśrednić wybraną liczbę obrazów. </li>
	<li>Teraz kliknij zakładkę 'Uruchom teraz' w menu 'ND Acquisition', aby rozpocząć obrazowanie próbki. </li>
	<li>Po zakończeniu obrazowania zapisz obraz, klikając 'File', a następnie 'Zapisz jako', co spowoduje wyeksportowanie pliku obrazu z rozszerzeniem '.nd2'. Na koniec powtórz proces dla każdej z pozostałych próbek. </li>
</ol>

Konfokalne barwienie fluorescencyjne jest stosunkowo prostą procedurą, która pozwala uzyskać niezwykle wysokiej jakości obrazy próbek, które są przygotowywane w podobny sposób, jak w przypadku konwencjonalnej mikroskopii fluorescencyjnej. Krótko mówiąc, próbki są utrwalane, przepuszczalne, a następnie blokowane. Pierwszorzędowe przeciwciała przeciwko białku lub białkom będącym przedmiotem zainteresowania mogą się związać, a następnie przeciwciała drugorzędowe sprzężone z fluoroforem są używane do wizualizacji barwienia. ...

konfokalna mikroskopia fluorescencyjna: technika określania lokalizacji białek w fibroblastach myszy

Confocal Fluorescence Microscopy: A Technique to Determine the Localization of Proteins in Mouse Fibroblasts

Źródło: Dominique R. Bollino1, Eric A. Legenzov2, Tonya J. Webb1 
1 Wydział Mikrobiologii i Immunologii, Szkoła Medyczna Uniwersytetu Maryland oraz Kompleksowe Centrum Onkologiczne im. Marleny i Stewarta Greenebaumów, Baltimore, Maryland 21201 
2 Centrum Inżynierii i Technologii Biomedycznej, Szkoła Medyczna Uniwersytetu Maryland, Baltimore, Maryland 21201
Konfokalna mikroskopia fluorescencyjna to technika obrazowania, która umożliwia zwiększenie rozdzielczości optycznej w porównaniu z konwencjonalną "szerokokątną" mikroskopią epifluorescencyjną. Mikroskopy konfokalne są w stanie osiągnąć lepszą rozdzielczość optyczną x-y poprzez "skanowanie laserowe" - zazwyczaj zestaw luster sterowanych napięciem (lustra galwanometryczne lub "galvo"), które kierują światło laserowe na każdy piksel próbki na raz. Co ważniejsze, mikroskopy konfokalne osiągają doskonałą rozdzielczość osiową Z dzięki zastosowaniu otworka do usuwania nieostrego światła pochodzącego z miejsc, które nie znajdują się w skanowanej płaszczyźnie Z, umożliwiając w ten sposób detektorowi zbieranie danych z określonej płaszczyzny z. Ze względu na wysoką rozdzielczość z osiągalną w mikroskopii konfokalnej, możliwe jest zbieranie obrazów z serii płaszczyzn z (zwanych również stosem z) i konstruowanie obrazu 3D za pomocą oprogramowania. 
Przed omówieniem mechanizmu działania mikroskopu konfokalnego ważne jest, aby zastanowić się, w jaki sposób próbka oddziałuje ze światłem. Światło składa się z fotonów, pakietów energii elektromagnetycznej. Foton uderzający w próbkę biologiczną może oddziaływać z cząsteczkami składającymi się na próbkę na jeden z czterech sposobów: 1) foton nie oddziałuje i przechodzi przez próbkę; 2) foton jest odbity/rozproszony; 3) foton jest absorbowany przez cząsteczkę, a pochłonięta energia jest uwalniana w postaci ciepła w procesach znanych jako rozpad niepromieniujący; oraz 4) foton jest absorbowany, a energia jest następnie szybko reemitowana jako foton wtórny w procesie znanym jako fluorescencja. Cząsteczka, której struktura pozwala na emisję fluorescencji, nazywana jest fluoroforem. Większość próbek biologicznych zawiera znikome endogenne fluorofory; W związku z tym należy użyć egzogennych fluoroforów w celu uwydatnienia interesujących cech próbki. Podczas mikroskopii fluorescencyjnej próbka jest oświetlana światłem o odpowiedniej długości fali do absorpcji przez fluorofor. Po absorpcji fotonu mówi się, że fluorofor jest "wzbudzony", a proces absorpcji określa się jako "wzbudzenie". Kiedy fluorofor oddaje energię w postaci fotonu, proces ten jest znany jako "emisja", a wyemitowany foton nazywa się fluorescencją. 
Wiązka światła używana do wzbudzania fluoroforu jest skupiana przez soczewkę obiektywu mikroskopu i zbiega się w "punkcie ogniskowym", w którym jest maksymalnie skupiona. Poza punktem centralnym światło ponownie się rozchodzi. Belki wchodzące i wychodzące mogą być wizualizowane jako para stożków stykających się w punkcie centralnym (patrz rysunek 1, lewy panel). Zjawisko dyfrakcji nakłada ograniczenie na to, jak mocno wiązka światła może być skupiona - wiązka w rzeczywistości skupia się na punkcie o skończonej wielkości. O wielkości ogniska decydują dwa czynniki: 1) długość fali światła oraz 2) zdolność soczewki obiektywu do zbierania światła, która charakteryzuje się aperturą numeryczną (NA). "Plamka" ogniskowa rozciąga się nie tylko w płaszczyźnie x-y, ale także w kierunku z i jest w rzeczywistości objętością ogniskową. Wymiary tej objętości ogniskowej określają maksymalną rozdzielczość osiągalną przez obrazowanie optyczne. Chociaż liczba fotonów jest największa w obrębie ogniskowej, stożkowe ścieżki światła powyżej i poniżej ogniska również zawierają mniejszą gęstość fotonów. W ten sposób można wzbudzić dowolny fluorofor na ścieżce światła. W konwencjonalnej (szerokokątnej) mikroskopii epifluorescencyjnej emisja z fluoroforów powyżej i poniżej płaszczyzny ogniskowej przyczynia się do nieostrej fluorescencji ("zamglone tło"), co zmniejsza rozdzielczość i kontrast obrazu, jak pokazano na rysunku 1, z czerwonym sześcianem reprezentującym emisję fluoroforu powyżej płaszczyzny ogniskowej (czerwona gwiazda), która powoduje fluorescencję nieostrą (u góry po prawej). Problem ten został rozwiązany w mikroskopii konfokalnej, dzięki wykorzystaniu otworu otworkowego. (Rysunek 2, na dole po prawej). Jak pokazano na rysunku 3, otwór otworkowy umożliwia emisje pochodzące z miejsca ogniskowania dotarcie do detektora (po lewej), jednocześnie blokując nieostrą fluorescencję (po prawej) przed dotarciem do detektora, poprawiając w ten sposób zarówno rozdzielczość, jak i kontrast. 
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/10501/10501fig1.jpg"> 
Rysunek 1. Rozdzielczość optyczna epifluorescencji a mikroskopia konfokalna. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/10501/10501fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku. </a>
Wiązka światła używana do wzbudzenia fluoroforu jest skupiana przez soczewkę obiektywu mikroskopu i zbiega się przy objętości ogniskowej, a następnie rozchodzi się (po lewej). Czerwona gwiazda reprezentuje płaszczyznę ogniskową próbki, która jest obrazowana, podczas gdy czerwony kwadrat reprezentuje emisję fluoroforu powyżej płaszczyzny ogniskowej. Podczas przechwytywania obrazu tej próbki za pomocą mikroskopu epifluorescencyjnego, emisja z nieostrego czerwonego kwadratu będzie widoczna i przyczyni się do powstania "zamglonego tła" (u góry po prawej). Mikroskopy konfokalne posiadają otwór otworkowy, który zapobiega wykrywaniu światła emitowanego poza płaszczyzną ogniskowej, eliminując "zamglone tło" (na dole po prawej). 
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/10501/10501fig2.jpg"> 
Rysunek 2. Efekt otworkowy w mikroskopii konfokalnej. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/10501/10501fig2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku. </a>
Chociaż największe natężenie światła wzbudzającego występuje w ognisku soczewki (po lewej, czerwony owal), inne części próbki nie znajdujące się w ognisku (po prawej, czerwona gwiazda) otrzymają światło i fluoryzują. Aby zapobiec przedostawaniu się światła emitowanego z tych nieostrych obszarów do detektora, przed detektorem znajduje się ekran z otworkiem. Tylko ostre światło (po lewej) emitowane z płaszczyzny ogniskowej jest w stanie przedostać się przez otwór i dotrzeć do detektora. Nieostre światło (po prawej) jest zablokowane przez otwór i nie dociera do detektora. 
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/10501/10501fig3.jpg"> 
Rysunek 3. Główne elementy konfokalnego laserowego mikroskopu skaningowego. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/10501/10501fig3large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku. </a>
Dla uproszczenia, mechanistyczny opis mikroskopu konfokalnego ograniczy się do opisu Nikon Eclipse Ti A1R. Chociaż mogą występować niewielkie różnice techniczne między różnymi mikroskopami konfokalnymi, A1R dobrze służy jako model do opisu funkcji mikroskopu konfokalnego. Wiązka światła wzbudzającego, wytwarzana przez układ laserów diodowych, jest odbijana przez pierwotne zwierciadło dichroiczne do obiektywu, który skupia światło na obrazowanej próbce. Pierwotne zwierciadło dichroiczne selektywnie odbija światło wzbudzenia, przepuszczając jednocześnie światło o innych długościach fal. Następnie światło napotyka lustra skanujące, które przesuwają wiązkę światła po próbce w sposób x-y, oświetlając pojedynczy (x,y) piksel na raz. Fluorescencja emitowana przez fluorofory w oświetlonym pikselu jest zbierana przez soczewkę obiektywu i przechodzi przez główne zwierciadło dichroiczne, aby dotrzeć do szeregu fotopowielaczy (PMT). Wtórne zwierciadła dichroiczne kierują światło emisyjne do odpowiedniego PMT. Światło wzbudzenia rozproszone przez próbkę z powrotem do obiektywu jest odbijane przez pierwotne zwierciadło dichroiczne z powrotem w kierunku próbki, a tym samym zapobiega się wejściu na ścieżkę światła detekcji i dotarciu do PMT (patrz rysunek 3). Pozwala to na ilościowe określenie stosunkowo słabej fluorescencji bez zanieczyszczenia światłem rozproszonym od wiązki światła wzbudzenia, która jest zwykle o rzędy wielkości intensywniejsza niż fluorescencja. Ponieważ otwór otworkowy blokuje światło spoza objętości ogniskowej, światło docierające do detektora pochodzi z wąskiej, wybranej płaszczyzny z. W związku z tym obrazy mogą być zbierane z serii sąsiadujących ze sobą płaszczyzn z; Ta seria obrazów jest często określana jako "stos Z". Za pomocą odpowiedniego oprogramowania można przetworzyć stos z w celu wygenerowania obrazu 3D próbki. Szczególną zaletą mikroskopii konfokalnej jest możliwość rozróżnienia subkomórkowej lokalizacji barwienia. Na przykład rozróżnienie między barwieniem błonowym a barwieniem wewnątrzkomórkowym, co jest bardzo trudne w przypadku konwencjonalnej mikroskopii epifluorescencyjnej (1, 2, 3). 
Przygotowanie próbki jest ważnym aspektem obrazowania konfokalnego. Mocną stroną technik mikroskopii optycznej jest elastyczność obrazowania żywych lub nieruchomych komórek. Podczas próby tworzenia obrazów 3D, ze względu na liczbę obrazów, które należy uzyskać w celu uzyskania stosu z, trudności w utrzymaniu zdrowia komórek oraz ruch żywych komórek i ich organelli, typowe jest użycie komórek stałych. Procedura utrwalania i barwienia komórek do fluorescencji konfokalnej jest podobna do tej konwencjonalnie stosowanej w immunofluorescencji. Po hodowli na szkiełkach komórkowych lub na szkiełkach nakrywkowych, komórki są utrwalane za pomocą paraformaldehydu w celu zachowania morfologii komórek. Nieswoiste wiązanie przeciwciał jest blokowane za pomocą albuminy surowicy bydlęcej, mleka lub normalnej surowicy. W celu zachowania swoistości przeciwciał drugorzędowych, stosowany roztwór nie powinien pochodzić od tego samego gatunku, u którego wytworzone zostały przeciwciała pierwszorzędowe. Komórki są inkubowane z pierwszorzędowymi przeciwciałami, które wiążą interesujący antygen. Podczas znakowania kilku celów komórkowych, pierwszorzędowe przeciwciała muszą pochodzić z innego gatunku. Przeciwciała znakujące antygen są następnie wiązane przez przeciwciała drugorzędowe sprzężone z fluoroforem. Przeciwciała drugorzędowe sprzężone z fluoroforem powinny być dobrane tak, aby były zgodne z długościami fal wzbudzenia laserowego dostępnymi w mikroskopie konfokalnym. Podczas wizualizacji wielu antygenów, widma wzbudzenia/emisji fluoroforów powinny różnić się na tyle, aby ich sygnały można było rozróżnić za pomocą analizy mikroskopowej. Wybarwiona próbka jest następnie montowana na szkiełku w celu obrazowania. Pożywka montażowa służy do zapobiegania fotowybielaniu i odwodnieniu próbki. W razie potrzeby można użyć podłoża montażowego zawierającego przeciwbarwnik jądrowy (np. DAPI lub Hoechst) (4). 
W poniższym protokole mysie fibroblasty transfekowane w celu ekspresji CD1d (LCD1) wybarwiono przeciwciałami rozpoznającymi CD1d i CD107a (LAMP-1). CD1d jest głównym receptorem podobnym do kompleksu zgodności tkankowej 1 (MHC 1) obecnym na powierzchni komórek prezentujących antygen, który zawiera antygeny lipidowe. LAMP-1 (lizosomalne białko błonowe-1) jest białkiem transbłonowym występującym głównie w błonach lizosomalnych. W celu prawidłowej prezentacji antygenu, CD1d jest transportowany przez kompartment lizosomalny o niskim pH, więc LAMP-1 jest używany jako marker kompartmentu lizosomalnego w tym protokole. Sondując komórki LCD1 z anty-CD1d i anty-LAMP-1, które zostały wytworzone u różnych gatunków, można zastosować przeciwciała drugorzędowe z unikalnymi fluoroforami do określenia lokalizacji każdego białka w komórce i tego, czy CD1d jest obecny w dodatnich przedziałach lizosomalnych LAMP-1.

W tym eksperymencie mysie fibroblasty wyrażające gen glikoproteiny powierzchniowej CD1d zostały utrwalone, wybarwione immunologicznie i zobrazowane pod mikroskopem konfokalnym. Reprezentatywny obraz uzyskany przy użyciu powyższego protokołu pokazano na rysunku 4. W górnym panelu A prezentowane są jednokanałowe obrazy pokazujące wzór barwienia każdego pojedynczego celu. Obrazy te składają się z pojedynczego fragmentu (wycinka) przechwyconego stosu z. Prawy panel pokazuje barwienie DAPI jąd...

Konfokalna mikroskopia fluorescencyjna: technika określania lokalizacji białek w fibroblastach myszy

Source: Dominique R. Bollino1, Eric A. Legenzov2, Tonya J. Webb1
1 Department of Microbiology and Immunology, University of Maryland School of Medicine ...

Konfokalna mikroskopia fluorescencyjna jest specjalistyczną techniką obrazowania służącą do lokalizacji białka lub antygenu będącego przedmiotem zainteresowania w próbce komórki lub tkanki poprzez znakowanie antygenu barwnikiem fluorescencyjnym sprzężonym z przeciwciałami i wykrywanie sygnału fluorescencyjnego. Oferuje wyższą rozdzielczość przestrzenną niż szerokokątna mikroskopia fluorescencyjna, za pomocą dwóch otworków umieszczonych w płaszczyznach ogniskowych soczewki obiektywu, nadając jej nazwę konfokalną. Umożliwia użytkownikom wizualizację barwienia na poziomie subkomórkowym, takim jak różnicowanie między barwieniem błony powierzchniowej a barwieniem wewnątrzkomórkowym. Mikroskop konfokalny działa na podobnej podstawowej zasadzie, co klasyczny mikroskop fluorescencyjny. Wiązka ze źródła światła, zwykle lasera konfokalnego, jest odbijana przez zwierciadło dichroiczne i skupiana przez soczewkę obiektywu na próbce. Światło to pobudza fluorofory do emitowania innej długości fali, która wraca przez soczewkę obiektywu i zwierciadło dichroiczne do aparatu lub okularu. Zwiększona rozdzielczość mikroskopu konfokalnego wynika głównie z obecności dwóch otworków, które są bardzo małymi otworami, przez które przechodzi światło na ścieżkach światła wzbudzenia i emisji. Otwory są strategicznie rozmieszczone w płaszczyźnie ogniskowej soczewki obiektywu. Przejdźmy teraz do schematu rozmieszczenia mikroskopu w widoku z boku, aby przejrzeć ścieżkę światła. Po przejściu przez otwór wzbudzenia, wiązka światła wzbudzenia ma efekt pochodząca z punktu ogniskowego, co umożliwia soczewce obiektywu skupienie światła również w punkcie na próbce. Wiązka emisyjna z tego ogniska zbiega się w otworze emisyjnym, który umożliwia jej przejście. Teraz podczas wzbudzenia fluorofory w obrębie ścieżki światła, powyżej i poniżej punktu ogniskowego, są również lekko wzbudzone. Podczas gdy światło emisyjne pochodzące z ogniska przechodzi przez otwór otworkowy, emisje z nieostrych punktów zbiegają się przed lub za otworkiem emisyjnym, a zatem są blokowane, co powoduje zmniejszoną fluorescencję tła. Cykl wzbudzenia-emisji-detekcji należy powtórzyć dla każdego punktu obrazowania w obszarze zainteresowania, co można wykonać na kilka różnych sposobów. Na przykład konfokalne skanowanie laserowe wykorzystuje zwierciadła skanujące galwanometryczne, które odchylają światło wzbudzenia pod różnymi kątami. W związku z tym przesuwanie wiązki światła w poprzek próbki w płaszczyźnie XY. Wirujący dysk konfokalny wykorzystuje dysk z układem otworków, który obraca się, aby zmienić układ otworków. Dzięki temu użytkownicy mogą za każdym razem oświetlać wiele małych punktów obrazowania w próbce, stopniowo pokrywając cały obszar w miarę obracania się dysku. W wyniku występowania otworków, obraz XY na detektorze przedstawia wąską płaszczyznę Z. W związku z tym obrazy mogą być zbierane z serii następujących po sobie płaszczyzn Z, często nazywanych stosem Z. Na podstawie tych obrazów odpowiednie oprogramowanie może wygenerować obraz 3D wzorca sygnału fluorescencji w próbce. W tym protokole będziesz obserwować barwienie immunologiczne fibroblastów myszy, a następnie obrazowanie pod mikroskopem konfokalnym w celu zróżnicowanej wizualizacji białka powierzchniowego komórki i białka lizosomalnego. Na początek, przy użyciu sterylnych technik, ponownie zawieś interesujące komórki w 500 mikrolitrach pożywki wzrostowej na studzienkę, a następnie zasiew je w dołkach czterodołkowego szkiełka podstawowego. Tutaj używamy mysich fibroblastów, które zostały transfekowane w celu ekspresji cząsteczki prezentującej antygen, CD1d. Aby komórki przylegały do szkła, umieść szkiełko w inkubatorze z 5% dwutlenkiem węgla w temperaturze 37 stopni Celsjusza i inkubuj przez noc. Rano odessać pożywkę z każdej studzienki, a następnie przemyć komórki raz 500 mikrolitrami PBS przez kilka sekund. Aby utrwalić komórki, dodaj 500 mikrolitrów 1% roztworu paraformaldehydu do każdej studzienki i inkubuj przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Po inkubacji należy zebrać paraformaldehyd do odpowiedniego pojemnika na niebezpieczne odpady płynne, a następnie usunąć wszelkie pozostałości utrwalacza, myjąc komórki trzykrotnie PBS przez kilka sekund. Aby umożliwić przenikanie przeciwciał do komórek, dodaj 500 mikrolitrów buforu przepuszczalnego do każdej studzienki i inkubuj na stole przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Po przepuszczalności przemyj komórki krótko trzy razy 500 mikrolitrami PBS. Następnie dodaj 500 mikrolitrów buforu blokującego do każdej studzienki i inkubuj przez godzinę w temperaturze czterech stopni Celsjusza, aby zapobiec wiązaniu się niespecyficznych przeciwciał. Przygotować przeciwciała pierwszorzędowe, anty-CD1d i anty-LAMP-1, w odpowiednich stężeniach roboczych. Następnie odessać bufor ze studzienek i przykryć komórki w każdej studzience 500 mikrolitrami rozcieńczonego roztworu przeciwciał pierwszorzędowych, a następnie inkubować szkiełko na płaskiej powierzchni przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnego ranka rozcieńczyć przeciwciała drugorzędowe, w tym przypadku przeciwciało anty-mysie i anty-szczurze z wyraźnymi znacznikami fluorescencyjnymi, w buforze blokującym do odpowiednich stężeń roboczych. Następnie odessać roztwór przeciwciała pierwotnego ze studzienek, a następnie czterokrotnie przemyć komórki 500 mikrolitrami PBS. Następnie dodaj 500 mikrolitrów rozcieńczonego roztworu przeciwciał drugorzędowych do każdej studzienki i inkubuj w temperaturze pokojowej przez godzinę w ciemności. Po inkubacji odessać roztwór przeciwciała drugorzędowego i przemyć studzienki czterokrotnie 500 mikrolitrami PBS w celu usunięcia wszelkich niezwiązanych przeciwciał drugorzędowych. Aby zamontować próbki po ostatnim myciu, należy ostrożnie odłączyć i wyjąć komory z szkiełka. Aby usunąć resztki PBS, przytrzymaj szkiełko pod kątem nad delikatną chusteczką roboczą i usuń płyn z krawędzi bez dotykania komórek. Po usunięciu nadmiaru PBS dodaj jedną kroplę pożywki montażowej zapobiegającej blaknięciu, zawierającej barwnik jądrowy DAPI, na każdą sekcję komórek. Następnie weź szkiełko nakrywkowe o wymiarach 20 na 60 milimetrów i opuszkami palców zacznij powoli opuszczać szkiełko nakrywkowe na obu krawędziach, uważając, aby uniknąć tworzenia się pęcherzyków na komórkach. Zetrzyj wszelkie dodatkowe nośniki montażowe na szkiełkach delikatną ściereczką zadaniową i przechowuj szkiełka w ciemności w temperaturze pokojowej przez okres do tygodnia. Aby rozpocząć obrazowanie komórek, najpierw kliknij ikonę oprogramowania NIS na pulpicie. W oknie sterowania kliknij kartę TiPad u góry i wybierz żądany cel do obrazowania. Następnie załaduj slajd z komórkami na stół montażowy i wyśrodkuj go pod obiektywem. Następnie na karcie A1plus Compact GUI obok zakładki TiPad ustaw lasery odpowiednie dla zastosowanych fluoroforów. Kliknij symbol koła zębatego, aby otworzyć menu ustawień barwnika i spektralnego. Po otwarciu menu ustawień barwnika i spektralnego wybierz potrzebne kanały i ustaw laser dla każdego kanału. Następnie wybierz odpowiednie emisje z rozwijanego menu pod pierwszym lustrem dichroicznym. Następnie, w oknie A1plus Compact GUI, kliknij Ch.Series, aby skonfigurować serię kanałów liniowych, która określa, czy używane lasery będą działać na próbkę jednocześnie, czy sekwencyjnie. Następnie rozpocznij skanowanie, klikając ikonę strzałki u góry. W tym momencie, gdy obrazowanie jest na żywo, w oknie A1plus Compact GUI kliknij przesuwaną skalę i zmodyfikuj rozmiar otworka, aby zapewnić ograniczenie nieostrego światła. Następnie dostosuj ustawienia wysokiego napięcia i przesunięcia pod każdym laserem do odpowiednich poziomów za pomocą przesuwnych skal, aby umożliwić wykrycie określonego zabarwienia, jednocześnie ograniczając potencjalne przebarwienia tła. Jeśli dostępna jest próbka do barwienia dodatniego, zacznij od zobrazowania tej próbki dla każdego kanału, aby upewnić się, że ustawienia lasera zapewniają optymalne proporcje sygnału do szumu. Po ustawieniu optymalnych wartości HV i offsetu dla każdego lasera kliknij zakładkę ND Acquisition, a następnie wybierz ikonę Z, aby ustawić parametry dla serii z. Następnie, podczas uzyskiwania obrazu próbki na żywo, najpierw ustaw dno, znajdując dolną część obrazu i klikając dolny przycisk. Następnie znajdź górną pozycję próbki i kliknij górny przycisk. Ustaw rozmiar kroku, wpisując preferowany rozmiar kroku w mikronach dla każdego kroku lub określając, ile całkowitych kroków jest potrzebnych. Aby wybrać żądany rozmiar/rozdzielczość obrazu w pikselach, kliknij okno Aiplus Compact GUI, a następnie pod ikoną rozmiaru wybierz żądaną rozdzielczość. Aby zmniejszyć szum obrazu, możesz wybrać menu rozwijane obok symbolu theta, aby uśrednić wybraną liczbę obrazów. Następnie kliknij kartę Run Now (Uruchom teraz) w menu ND Acquisition (Akwizycja ND), aby rozpocząć obrazowanie próbki. Po zakończeniu obrazowania zapisz obraz, klikając plik, a następnie zapisz jako, co spowoduje wyeksportowanie pliku obrazu z rozszerzeniem dot-nd2. Na koniec powtórz proces dla każdej z pozostałych próbek. W tym eksperymencie mysie fibroblasty wyrażające gen glikoproteiny powierzchniowej CD1d zostały utrwalone, wybarwione immunologicznie i zobrazowane pod mikroskopem konfokalnym. Ten obraz pokazuje pojedynczy fragment stosu Z w 40-krotnym powiększeniu, gdzie CD1d jest zabarwiony na czerwono. Próbka została wybarwiona LAMP-1, markerem lizosomalnym, w kolorze zielonym. Barwienie jądrowe DAPI użyto do pokazania jąder komórek. Na złożonym obrazie, w którym trzy różne kanały są połączone, pojawienie się koloru żółtego wynika z nakładania się kanałów czerwonego i zielonego i wskazuje obszar, w którym CD1d i LAMP-1 są kolokalizowane w lizosomach. Obszary, w których obecny jest tylko jeden kolor, wskazują na obecność CD1d lub LAMP-1 bez kolokalizacji. Ten obraz przedstawia renderowanie 3D komórek zbudowanych z obrazów uchwyconych w stosie z, a ta metoda umożliwiła zbudowanie widoku z boku tej grupy komórek. Poniższy obraz przedstawia wycinek ze stosu z osią Z w 100-krotnym powiększeniu, demonstrując bardziej szczegółowo wzorce ekspresji tych dwóch białek. Różowe obwódki po prawej stronie obrazu wyświetlają przekrój poprzeczny współrzędnej x wyznaczonej przez różową linię na obrazie, która reprezentuje widok z boku na różowej linii. Podobnie niebieska obwódka u dołu obrazu pokazuje przekrój poprzeczny współrzędnej y wyznaczonej przez niebieską linię na obrazie, która reprezentuje widok z przodu na niebieskiej linii. Renderowanie 3D obrazu z-stack umożliwia użytkownikom przeglądanie obrazu w 3D, wizualizując wszystkie płaszczyzny x, y i z. Można to wykorzystać do badania kolokalizacji różnych barwników w różnych regionach komórki.

confocal-fluorescence-microscopy-technique-to-determine-localization

Education

JoVE Science Education

Advanced Biology

Biologia zaawansowana

Immunology

Immunologia

confocal microscopy for protein localization

Confocal fluorescence microscopy is used to show where proteins are located inside cells with better detail than wide-field epifluorescence microscopy. It improves image clarity by scanning the sample with lasers and using a pinhole to block out-of-focus light. This makes it easier to see whether a signal comes from the cell surface or from inside the cell.

The method relies on fluorescence, which happens when a molecule absorbs light and then gives off a new photon. A fluorophore is a molecule that can fluoresce. Because most biological samples have very little natural fluorescence, researchers usually add fluorescent labels to highlight the structures they want to study.

A confocal microscope focuses light into a small focal volume, not just a single point in the x-y plane. The size of that volume depends on the wavelength of light and the numerical aperture, or NA, of the objective lens. Light above and below the focal plane can still excite fluorophores, but the pinhole removes most of the unwanted emission before it reaches the detector.

Compared with conventional epifluorescence microscopy, this design reduces the hazy background caused by out-of-focus fluorescence. The result is sharper images and better contrast. Confocal microscopy also allows collection of images from a series of z-planes, called a z-stack, which can be processed into a 3D image with software.

The microscope described in the protocol uses diode lasers, a primary dichroic mirror, scanning mirrors, and photomultiplier tubes, or PMTs. The dichroic mirror reflects the excitation light into the objective while letting other wavelengths pass through. The scanning mirrors move the beam across the sample one pixel at a time, and the PMTs detect the emitted fluorescence. The pinhole and optical path also help keep scattered excitation light out of the detector so the weaker fluorescence signal can be measured more clearly.

One major advantage of confocal imaging is that it can separate membrane staining from intracellular staining more clearly than wide-field methods. This is useful when studying where a protein is found inside a cell. It is especially helpful when a 3D view is needed from a z-stack.

Preparing the sample is an important part of the process. For 3D imaging, fixed cells are often used because live cells can move and are harder to keep healthy while many z-planes are collected. Cells are grown on chamber slides or coverslips, fixed with paraformaldehyde, and blocked with bovine serum albumin, milk, or normal serum to reduce nonspecific antibody binding. The blocking solution should not come from the same species used to make the primary antibodies.

Next, the cells are stained with primary antibodies that bind the target antigen. If several targets are being labeled, each primary antibody must come from a different species. Fluorophore-conjugated secondary antibodies then bind the primary antibodies. Their excitation and emission properties must match the lasers on the confocal microscope, and the fluorophores should be different enough that the signals can be separated. A mounting medium is used to protect the sample from photobleaching and drying, and it may include a nuclear counterstain such as DAPI or Hoechst.

In the protocol shown here, mouse fibroblasts were made to express CD1d and were stained for CD1d and CD107a, also called LAMP-1. CD1d is a major histocompatibility complex 1, or MHC 1, like receptor that presents lipid antigens on antigen-presenting cells. LAMP-1 is a transmembrane protein found mainly in lysosomal membranes and serves as a marker for the lysosomal compartment. Because CD1d must travel through this low-pH compartment for proper antigen presentation, confocal imaging can show whether CD1d is present in LAMP-1-positive lysosomes.

Confocal Microscopy for Protein Localization

confocal-microscopy-for-protein-localization

flow cytometry and fluorescence-activated cell sorting (facs): isolation of splenic b lymphocytes

flow-cytometry-fluorescence-activated-cell-sorting-facs-isolation

Sorting B Cells from Spleen with FACS

Flow cytometry and FACS can be used to separate B lymphocytes from a mixed spleen cell sample. The immune system protects the body from infectious organisms and other invaders. White blood cells, also called leukocytes, are the main cells involved in this defense. Leukocytes can be grouped into subpopulations such as myeloid cells, lymphocytes, and dendritic cells. These groups can be distinguished by biological, physical, and functional features. Cell size, granularity, and secretion are...

magnetic activated cell sorting (macs): isolation of thymic t lymphocytes

magnetic-activated-cell-sorting-macs-isolation-of-thymic-t-lymphocytes

Enriching Thymic T Cells with Magnetic Sorting

Thymic T cell enrichment with magnetic sorting helps isolate a targeted immune cell group from a mixed sample. The immune system relies on many cell types, and lymphocytes are a major part of adaptive immunity. B cells usually respond to extracellular infections, such as bacterial infections, while T cells usually respond to intracellular infections, such as viral infections. Magnetic sorting enriches selected cells by using magnetic beads and antibodies against cell surface proteins. First,...

elisa assays: indirect, sandwich, and competitive

elisa-assays-indirect-sandwich-and-competitive

ELISA Methods for Detecting Antigens

ELISA methods detect antigens, antibodies, proteins, hormones, peptides, and other biomolecules in biological samples. Enzyme-linked immunosorbent assay is highly sensitive because it can detect very low antigen levels. It works by using an antigen-antibody interaction, then an enzyme-linked antibody turns a colorless substrate into a colored or fluorescent signal that a plate reader can measure. Different ELISA formats are used for different sample types and antibody setups. Indirect ELISA is...

elispot assay: detection of ifn-&#947; secreting splenocytes

elispot-assay-detection-of-ifn-secreting-splenocytes

ELISPOT Assay for Single-Cell Immune Detection

ELISPOT is a sensitive assay for detecting immune cells that release a specific protein. It is based on an ELISA, or enzyme-linked immunosorbent assay, but it shows single-cell responses as visible spots. The method was first described in 1983 by Czerkinsky to count B cell hybridomas that produce antigen-specific immunoglobulins. The assay was later adapted to measure cytokine-producing T lymphocytes. Because of that, ELISPOT is now a gold standard for measuring antigen-specific T cell...

immunohistochemistry and immunocytochemistry: tissue imaging via light microscopy

immunohistochemistry-immunocytochemistry-tissue-imaging-via-light

Antibody Staining of Tissue and Cells

Antibody staining of tissue and cells lets scientists see where a specific antigen is located. Immunohistochemistry, or IHC, uses thin tissue sections. Immunocytochemistry, or ICC, uses isolated cells or cells grown in culture. Both methods rely on antibodies that carry a chemical or fluorescent tag, such as peroxidase or rhodamine, so the target antigen can be detected under a light microscope. IHC keeps the structure of the whole tissue in place while the sample is stained. That makes it...

antibody generation: producing monoclonal antibodies using hybridomas

antibody-generation-producing-monoclonal-antibodies-using-hybridomas

Hybridoma Cell Culture for Monoclonal Antibodies

Hybridoma cell culture is used to produce monoclonal antibodies, or mAbs, with a known antigen specificity. Monoclonal antibodies come from a single clone of cells, so they recognize one target more precisely than polyclonal antibodies, which are a mixed group of antibodies against different antigenic determinants. That difference matters when similar molecules share epitopes, or antigen sites, that can confuse an antibody test. Polyclonal antisera can react with more than one related antigen.

immunofluorescence microscopy: immunofluorescence staining of paraffin-embedded tissue sections

immunofluorescence-microscopy-immunofluorescence-staining-paraffin

Fluorescent Antibody Staining of Tissue Slides

Fluorescent antibody staining lets scientists see specific proteins in thin tissue sections on glass slides. It is used to study normal tissue structure and to better understand how disease works. In many cases, the tissue comes from patient biopsies or from experimental in vivo models. The tissue is usually fixed in formalin or paraformaldehyde and embedded in paraffin wax before it is cut. This preservation method supports long-term storage and makes sectioning possible. A microtome is used...

confocal fluorescence microscopy: a technique to determine the localization of proteins in mouse fibroblasts

Confocal fluorescence microscopy is used to show where proteins are located inside cells with better detail than wide-field epifluorescence microscopy. It improves image clarity by scanning the sample with lasers and using a pinhole to block out-of-focus light. This makes it easier to see whether a signal comes from the cell surface or from inside the cell. The method relies on fluorescence, which happens when a molecule absorbs light and then gives off a new photon. A fluorophore is a...

immunoprecipitation-based techniques: purification of endogenous proteins using agarose beads

immunoprecipitation-based-techniques-purification-endogenous-proteins

Protein Pull-Down with Antibodies and Beads

Immunoprecipitation uses antibodies and Protein A/G agarose beads to isolate a specific protein from a cell lysate. It is also called a pull-down assay. The term "immuno" refers to the antibody, and "precipitation" means pulling a substance out of solution. The target protein can be endogenous or recombinant. Recombinant proteins often carry epitope tags such as myc or flag, which makes purification easier because antibodies against these tags are usually strong and effective. Antibodies...

cell cycle analysis: assessing cd4 and cd8 t cell proliferation after stimulation using cfse staining and flow cytometry

cell-cycle-analysis-assessing-cd4-cd8-t-cell-proliferation-after

Tracking T Cell Division with CFSE and Flow Cytometry

Tracking T cell division with CFSE and flow cytometry shows how immune cells respond after stimulation. The cell cycle is a normal process of life. During it, a cell changes step by step and divides into two daughter cells. This happens throughout life when the body needs new cells for growth and repair. Cells that are not cycling are in the G0 phase, which means they are quiet. Once a cell enters the cycle, it moves through G1, S, G2, and M phases. G1 is a checkpoint for the resources needed...

adoptive cell transfer: introducing donor mouse splenocytes to a host mouse and assessing success via facs

adoptive-cell-transfer-introducing-donor-mouse-splenocytes-to-host

Tracking Transferred Mouse Splenocytes by FACS

Adoptive cell transfer is a method for moving cells into a host animal to study biology or help treat disease. Researchers can use it to follow cell movement and distribution, or to test how transferred cells behave in a mouse model. Tracking systems such as cell surface markers and CFSE staining can help show where the cells go after transfer. This approach has several uses in mouse studies. It can support cancer research by transferring specific cell populations as an experimental treatment...

assay for cell death: chromium release assay of cytotoxic ability

assay-for-cell-death-chromium-release-assay-of-cytotoxic-ability

Chromium Release Assay for Immune Cell Killing

The chromium release assay measures how well immune cells kill target cells in the lab. It is used to test the cytotoxic ability of T cells, NK cells, and other effector cells against infected cells or tumor cells. This assay works by labeling target cells with chromium-51, a radioactive tracer called Na2 51CrO4. The label quickly marks cellular proteins inside the target cells. When effector cells damage the target-cell membrane, the labeled proteins are released into the culture supernatant...

immunology

This collection covers many staple techniques of immunology labs, including the labeling and sorting of immune cells. It also demonstrates proliferation methods for immune cells and antibodies, as well as common assays for immune activity including ELISA. Finally, it demonstrates staining and imaging of immune tissue and cell samples.

See how confocal fluorescence microscopy uses lasers, a pinhole, and z-stacks to reveal protein location in mouse fibroblasts and other cells.

Confocal Microscopy for Protein Localization

Description

Transcript

Tags