Name: chromium release assay for immune cell killing
Uploaded: 2023-04-30T07:09:15.000Z
Duration: 11 min 48 s
Channel: JoVE

Przegląd procedur
Typowy test uwalniania 51Cr do pomiaru śmierci komórki obejmuje następujące kroki:
<ol>
	<li>Najpierw komórki docelowe są oznaczone symbolem Na2[51Cr]O4. To odróżnia je od komórek efektorowych w teście. </li>
	<li>Podczas znakowania komórek docelowych pobiera się komórki efektorowe i, stosując technikę rozcieńczania seryjnego, na 96-dołkowej płytce testowej z okrągłym dnem generowane jest zmniejszające się miareczkowanie komórek efektorowych. </li>
	<li>Pod koniec znakowania komórek docelowych komórki są najpierw myte, a następnie do płytki testowej, która zawiera już serię rozcieńczeń komórek efektorowych, dodaje się określoną liczbę komórek. </li>
	<li>Następnie mieszanina komórek celu-efektora jest inkubowana przez określony czas, aby umożliwić wystarczającą interakcję komórek z komórkami docelowymi, aby pośredniczyć w lizie komórek. </li>
	<li>Na koniec supernatanty hodowlane są zbierane i zbierane do probówek. Ilość 51Cr jest określana ilościowo za pomocą licznika gamma. </li>
	<li>Na koniec dane są zbierane i wykorzystywane do obliczenia "procentowej specyficznej lizy komórek" komórek docelowych. </li>
</ol>
1. Oznaczanie komórek docelowych za pomocą 51Cr
<ol>
	<li>Aby rozpocząć, przygotuj komórki docelowe (tutaj - ludzka linia komórkowa czerniaka WM793) do zawiesiny pojedynczej komórki. </li>
	<li>W tym celu należy najpierw wyjąć pożywkę z kolby do hodowli tkankowej. </li>
	<li>Następnie umyj komórki 5 ml 1X PBS. </li>
	<li>Trypsynizuj komórki, dodając 1 ml trypsyny do płytki przez ~2 min.</li>
	<li>Delikatnie postukać w kolbę, aby poluzować komórki z powierzchni kolby. </li>
	<li>Dodać 5 ml pożywki RPMI do kolby i pipetować pożywkę w górę iw dół, aby odłączyć komórki. </li>
	<li>Zebrać zawiesinę komórek do stożkowej probówki o pojemności 15 ml i odwirować zawiesinę komórek przez 5 minut przy 1200 obr./min. Zdekantować supernatant. </li>
	<li>Dodaj 10 ml pożywki do osadu i delikatnie pipetuj pożywkę w górę iw dół, aby doprowadzić komórki do zawiesiny. </li>
	<li>Określ stężenie komórek za pomocą hemocytometru. </li>
	<li>Przenieś komórki 1x106 do nowej stożkowej probówki o pojemności 15 ml. </li>
	<li>Odwirować zawiesinę komórek przez 5 minut przy 1200 obr./min i zdekantować supernatant. </li>
	<li>Krótko zawirować rurkę, aby ponownie zawiesić osad komórek w małej objętości pozostawionego podłoża. </li>
	<li>Dodaj 100 μCi 51Cr bezpośrednio do zawiesiny komórki docelowej WM793. 
	Uwaga: Powinna być przygotowana dedykowana przestrzeń laboratoryjna dla tej konkretnej radioaktywności. Ponadto powinno być zapewnione wystarczające ekranowanie ołowiu do bezpiecznego przechowywania i używania 51Cr podczas wszystkich etapów, a także odpowiednie oznakowanie wskazujące, gdzie przechowywane są próbki z 51Cr. Niezbędny jest również licznik Geigera wyposażony w sondę naleśnikową, do badania przestrzeni pod kątem ewentualnego zanieczyszczenia. </li>
	<li>Dodaj mały kawałek taśmy radioaktywnej do probówki, aby wskazać, że probówka jest teraz radioaktywna. </li>
	<li>Umieścić probówkę w inkubatorze o temperaturze 37°C z ołowianą osłoną i inkubować przez 1 godzinę. Przesuwaj probówkę co 15-20 minut, aby zwiększyć wychwyt chromu przez komórki docelowe. </li>
	<li>Po okresie inkubacji przemyj komórki docelowe 5 ml FBS, aby usunąć nadmiar 51Cr.</li>
	<li>Odwirować komórki z prędkością 1200 obr./min przez 5 min. Zdekantować radioaktywny FBS do odpowiedniego pojemnika na odpady. </li>
	<li>Ponownie zawiesić granulat i umyć po raz drugi za pomocą FBS. Sprawdzić osad pod kątem wbudowanej radioaktywności za pomocą licznika Geigera. </li>
	<li>Zawiesić osad w 10 ml kompletnej pożywce, uzyskując stężenie komórek 105 komórek/ml. 
	Uwaga:Krok liczenia komórek po oznaczeniu 51Cr jest tutaj pomijany, głównie ze względów bezpieczeństwa. Można założyć, że stężenie komórek WM793 jest takie samo jak przed oznakowaniem 51Cr. </li>
</ol>
2. Przygotowanie komórek efektorowych
<ol>
	<li>Można stosować różne komórki efektorowe, takie jak ludzkie lub mysie limfocyty T oraz komórki NK. W tym przykładzie użyto PBMC wyizolowanych z krwi pełnej metodą wirowania w standardowym gradionym gradicynie gęstości (do stężenia 5x106). </li>
	<li>Na początek dodaj 100 μl pożywki do hodowli tkankowej do każdego dołka w jednym z rzędów (tutaj rząd A, Patrz tabela 1) 96-dołkowej płytki o okrągłym dnie. W tym przypadku nie są dodawane żadne komórki efektorowe i będą one służyć jako "ślepa próba" do określenia "minimalnego/spontanicznego uwolnienia 51Cr" z komórek docelowych. </li>
</ol>
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/10505/10505table1.jpg"> 
Tabela 1: 51Układ testu uwalniania Cr: Wiersz A- Komórki docelowe (104 komórek/ 100 μL) inkubowane tylko z pożywką (generuje "ślepą próbę" w celu określenia "minimalnego/spontanicznego uwolnienia 51Cr"). Rzędy dołków B do C- zawierających różne proporcje efektora do komórki docelowej (E:T), w zakresie od 50:1 do 1,5:1. Wiersz komórek docelowych H- (104 komórek/100 μL) inkubowanych z 1% NP-40 (NP-40 lizuje komórki docelowe, generując "maksymalne lub całkowite uwolnienie 51Cr"). Każdy stosunek E:T jest testowany w trzech egzemplarzach dla każdego warunku eksperymentalnego. Kolumna 1-3- niestymulowane PBMC i kolumna 4-6- PBMC stymulowane CpG.
<ol start="3">
	<li>Następnie wygeneruj 2-krotne szeregowe rozcieńczenie komórek PBMC (w trzech egzemplarzach dla każdego warunku eksperymentalnego), aby uzyskać stężenie komórek efektorowych w zakresie od 5x105 do 15,625 komórek/100 μL pożywki (tutaj rzędy od B do G). 
	Uwaga: W tym przykładzie stosunek początkowy efektora do komórki docelowej (E: T) wynosi 50:1. Stosunek ten można jednak dostosować w zależności od specyfiki eksperymentu. </li>
	<li>Pozostaw ostatni wiersz pusty (tutaj wiersz H), nie dodając żadnych komórek efektorowych do tych studzienek. (Ten wiersz zostanie użyty do wygenerowania "całkowitej liczby zliczeń/min, lub (c. p. m)" lub "maksymalnego uwolnienia 51Cr"). </li>
	<li>Umieścić płytkę w inkubatorze o temperaturze 37°C, aż komórki docelowe będą gotowe do dodania. </li>
</ol>
3. Dodanie do testu komórek docelowych 51Cr oznaczonych WM793 do testu
<ol>
	<li>Po okresie inkubacji wyjąć komórki docelowe z inkubatora i przemyć 5 ml FBS w celu usunięcia nadmiaru 51Cr.</li>
	<li>Odwirować komórki z prędkością 1200 obr./min przez 5 minut, używając przeznaczonej do tego wirówki. </li>
	<li>Usunąć płuczkę FBS (radioaktywny supernatant) do odpowiedniego pojemnika na odpady. </li>
	<li>Powtórz etap mycia, ponownie zawieszając granulkę w świeżych 5 ml FBS. </li>
	<li>Ponownie odwirować komórki z prędkością 1200 obr./min przez 5 minut.</li>
	<li>Na koniec ponownie zawiesić osad w 10 ml kompletnego podłoża. </li>
	<li>Wlej 51Zawiesinę komórek WM793 znakowaną Cr (105 komórek/ml) do jednorazowego zbiornika na odczynnik. </li>
	<li>Następnie dodaj 100 μl tych znakowanych komórek docelowych do każdej studzienki 96-dołkowej płytki komórki efektorowej, używając pipety wielokanałowej. </li>
	<li>Następnie dodaj 100 μL 1% NP-40 (w wodzie) do rzędu studzienek, które są pozbawione jakichkolwiek komórek efektorowych (tutaj rząd H). 1% NP-40 spowoduje lizę komórek docelowych, a zatem te studzienki będą służyć jako kontrole do określenia "całkowitej liczby / min, lub (c. p. m)" lub maksymalnego uwolnienia 51Cr. </li>
	<li>Przymocuj pokrywkę do talerza, dodając mały kawałek taśmy przepuszczającej gaz z każdej strony płytki i umieść kawałek taśmy radioaktywnej na pokrywie, aby wskazać, że zawiera 51Cr.</li>
	<li>Krótko odwirować płytkę z prędkością 1200 obr./min. Jeśli używana jest tylko jedna płytka doświadczalna, dodaj płytkę równoważącą do wirówki. 
	Uwaga: Ważne jest, aby używać wirówki oznaczonej do pracy z próbkami radioaktywnymi. </li>
	<li>Wyjmij płytkę z wirówki. </li>
	<li>Umieść płytkę w inkubatorze o temperaturze 37°C z małym kawałkiem ołowianej osłony nad płytką dla dodatkowego bezpieczeństwa. Inkubować przez 16 godzin, aby umożliwić lizę komórek docelowych. 
	Uwaga: Okres inkubacji może wynosić od 4 do 18 godzin, w zależności od użytych komórek efektorowych i potencjalnego zastosowanego mechanizmu zabijania. </li>
</ol>
4. Zbieranie supernatantów
<ol>
	<li>Pod koniec okresu inkubacji ostrożnie usunąć taśmę wokół krawędzi płytki i zdjąć pokrywkę. </li>
	<li>Następnie umieść ramkę do zbioru na talerzu, upewniając się, że małe krążki filtracyjne są na swoim miejscu dla każdej z bawełnianych zatyczek. Zapewni to pobranie supernatantu bezkomórkowego. </li>
	<li>Teraz powoli i delikatnie wciśnij bawełniane zatyczki do studzienek. </li>
	<li>Po około 10 sekundach zwolnij nacisk na bawełniane zatyczki, a następnie przenieś bawełniane zatyczki na paski rurki. </li>
	<li>Umieść każdą z tych probówek w wtórnej probówce FACS. </li>
	<li>Na koniec załaduj probówki FACS na licznik gamma i uruchom próbki, aby określić ilościowo ilość 51Cr uwolnionego w każdym stanie. Próbki są zwykle mierzone przez 1 minutę, co pozwala na łatwe określenie "zliczeń na minutę". </li>
	<li>Ostrożnie zapisz kolejność, w jakiej rurki zostały załadowane do lady. </li>
</ol>
5. Analiza danych
<ol>
	<li>W tym przypadku niestymulowane PBMC dodano do pierwszych trzech kolumn, a PBMC stymulowane CpG (CpG ODN, (1 μg/ml) przez 24 godziny) dodano do kolumn 4-6. Patrz tabela 2. </li>
</ol>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td>1</td>
			<td>2</td>
			<td>3</td>
			<td>4</td>
			<td>5</td>
			<td>6</td>
			<td>7</td>
			<td>8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A</td>
			<td>1251</td>
			<td>1157</td>
			<td>1086</td>
			<td>917</td>
			<td>1118</td>
			<td>1140</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B</td>
			<td>1832</td>
			<td>1986</td>
			<td>1971</td>
			<td>7629</td>
			<td>7913</td>
			<td>8180</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C</td>
			<td>1677</td>
			<td>1739</td>
			<td>1428</td>
			<td>5454</td>
			<td>5055</td>
			<td>5268</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D</td>
			<td>1638</td>
			<td>1552</td>
			<td>1734</td>
			<td>4239</td>
			<td>3582</td>
			<td>3786</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E</td>
			<td>1658</td>
			<td>1580</td>
			<td>1339</td>
			<td>2818</td>
			<td>2623</td>
			<td>2750</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F</td>
			<td>1579</td>
			<td>1472</td>
			<td>1483</td>
			<td>2028</td>
			<td>1779</td>
			<td>1769</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>G</td>
			<td>1326</td>
			<td>1325</td>
			<td>1184</td>
			<td>1801</td>
			<td>1654</td>
			<td>1565</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H</td>
			<td>9220</td>
			<td>9367</td>
			<td>8067</td>
			<td>8774</td>
			<td>9647</td>
			<td>8236</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>I</td>
			<td colspan="2">Średnia z A1,A2,A3 -&gt;</td>
			<td>1164.67</td>
			<td>Spontaniczny c.p.m</td>
			<td></td>
			<td>1058.33</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>J</td>
			<td colspan="2">Średnia z B1,B2,B3 -&gt;</td>
			<td>1929.67</td>
			<td>9.91%</td>
			<td></td>
			<td>7907.33</td>
			<td>87.50%</td>
			<td>50:1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K</td>
			<td colspan="2">Średnia z C1,C2,C3 -&gt;</td>
			<td>1614.67</td>
			<td>5.83%</td>
			<td></td>
			<td>5259</td>
			<td>53.67%</td>
			<td>25:1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L</td>
			<td colspan="2">Średnia z D1,D2,D3 -&gt;</td>
			<td>1641.33</td>
			<td>6.17%</td>
			<td></td>
			<td>3869</td>
			<td>35.91%</td>
			<td>12.5:1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M</td>
			<td colspan="2">Średnia z E1,E2,E3 -&gt;</td>
			<td>1525.67</td>
			<td>4.68%</td>
			<td></td>
			<td>2730.33</td>
			<td>21.36%</td>
			<td>6.25:1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N</td>
			<td colspan="2">Średnia z F1,F2,F3 -&gt;</td>
			<td>1511.33</td>
			<td>4.49%</td>
			<td></td>
			<td>1858.67</td>
			<td>10.22%</td>
			<td>3.12:1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>O</td>
			<td colspan="2">Średnia z G1,G2,G3 -&gt;</td>
			<td>1278.33</td>
			<td>1.47%</td>
			<td></td>
			<td>1673.33</td>
			<td>7.86%</td>
			<td>1.56:1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P</td>
			<td colspan="2">Średnia z H1,H2,H3 -&gt;</td>
			<td>8884.67</td>
			<td>Maksymalny c.p.m</td>
			<td></td>
			<td>8885.67</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Unstim PBMC</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>CpG-stim PBMC</td>
			<td>Stosunek E:T</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 2: 51Dane testu uwalniania Cr: Wartości danych "Liczby na minutę" / "c. p. m", średnie wartości c. p. m i obliczone procentowe wartości lizy specyficznej. 
<ol start="2">
	<li>Zebrane dane (zliczenia na minutę, czyli c.p.m.) zostały wprowadzone do komórek arkusza kalkulacyjnego w taki sam sposób, w jaki próbki zostały ułożone na oryginalnej płytce. </li>
	<li>W pierwszej kolejności obliczono średnie z trzech egzemplarzy. Tabela 2 - komórki od I3 do P3, dla niestymulowanych PBMC i komórki I6 do P6, dla PBMC stymulowanych CpG.</li>
	<li>Po ustaleniu średnich obliczono procent specyficznej lizy dla każdego stanu przy użyciu następującego wzoru: - 
	 
	<img src="/files/ftp_upload/10505/10505eq1.jpg"></li>
	<li>Procent swoistej lizy obliczono dla każdego stanu (Tabela 2 - komórki J4 do O4, dla niestymulowanych PBMC i J7 do O7, dla niestymulowanych PBMC). </li>
</ol>

Opisany tutaj test ma znaczną elastyczność, ponieważ w zależności od zadawanego pytania można stosować różne komórki efektorowe i docelowe. Na przykład swoistość komórek efektorowych można określić za pomocą różnych komórek docelowych lub mechanizm zabijania komórek efektorowych można określić za pomocą komórek z niedoborem określonych białek lub za pomocą inhibitorów specyficznych dla białek. Głównym problemem związanym z testem uwalniania 51Cr jest możliwość wysokiego tempa spontanicznego uwalniania przez ko...

test na śmierć komórki: test uwalniania chromu o zdolności cytotoksycznej

Assay for Cell Death: Chromium Release Assay of Cytotoxic Ability

Źródło: Frances V. Sjaastad1,2, Whitney Swanson2,3 i Thomas S. Griffith1,2,3,4 
1 Program podyplomowy z mikrobiologii, immunologii i biologii nowotworów, Uniwersytet Minnesoty, Minneapolis, MN 55455 
2 Centrum Immunologii, Uniwersytet Minnesoty, Minneapolis, MN 55455 
3 Wydział Urologii, Uniwersytet Minnesoty, Minneapolis, MN 55455 
4 Masońskie Centrum Onkologiczne, Uniwersytet Minnesoty, Minneapolis, MN 55455
Jedną z głównych funkcji komórek układu odpornościowego jest usuwanie komórek docelowych, które zostały zakażone wirusami lub przeszły transformację w komórkę nowotworową. Testy in vitro do pomiaru zdolności cytotoksycznej komórek odpornościowych są podstawą w laboratoriach od wielu lat. Testy te zostały wykorzystane do określenia zdolności limfocytów T, komórek NK lub innych komórek odpornościowych do zabijania komórek docelowych w sposób specyficzny dla antygenu lub niespecyficzny. Ligandy śmierci (np. Ligand Fas lub TRAIL), cytokiny (np. IFNg lub TNF) lub granulki cytotoksyczne (tj. Perforyna/granzym B) wyrażane przez komórki efektorowe to tylko niektóre ze sposobów, w jakie można indukować śmierć komórki docelowej. Wraz z eksplozją badań nad immunoterapią nowotworów w ostatnich latach, rośnie zainteresowanie znalezieniem środków zwiększających aktywność cytotoksyczną komórek odpornościowych w celu poprawy wyników leczenia pacjentów. I odwrotnie, niektóre choroby charakteryzują się nadmiernie wybujałą aktywnością cytotoksyczną komórek odpornościowych, co skutkuje wysiłkami na rzecz zidentyfikowania czynników łagodzących te reakcje. W związku z tym posiadanie testu, w którym użytkownik może łatwo zintegrować dowolną liczbę różnych komórek efektorowych, komórek docelowych i/lub modyfikatorów odpowiedzi z projektem eksperymentalnym, może służyć jako cenny sposób szybkiej oceny zdolności cytotoksycznej komórek efektorowych i/lub responsywności komórki docelowej. 
Te testy in vitro{ obejmują mieszanie różnych populacji komórek, a także użycie stosunkowo niewielkiej liczby komórek efektorowych i docelowych. W związku z tym jedną z konieczności testu jest oznakowanie komórek docelowych w sposób, który można łatwo wykryć i określić ilościowo, umożliwiając użytkownikowi określenie "procentowej lizy specyficznej", w której pośredniczą komórki efektorowe. Promieniotwórczość - zwłaszcza chrom 51 (51Cr) w postaci Na251CrO4- jest niedrogim sposobem szybkiego i niespecyficznego znakowania białek komórkowych w komórkach docelowych (1). Krótki czas znakowania i całkowitego czasu oznaczania zmniejsza ryzyko znaczących zmian w liczbie i/lub fenotypie komórek docelowych, które mogą mieć wpływ na wynik testu. Po utracie integralności błony komórek docelowych w wyniku cytotoksycznej aktywności komórek efektorowych, białka komórkowe znakowane 51Cr w komórkach docelowych są uwalniane do supernatantu hodowli, stając się dostępne do oceny ilościowej. Podobnie jak w przypadku każdego testu badającego funkcję komórek odpornościowych in vitro, istnieje kilka ważnych kwestii, które należy rozważyć pod kątem poprawy wydajności eksperymentu. Jedną z najbardziej krytycznych cech jest użycie zdrowych komórek efektorowych (dla maksymalnej aktywności cytotoksycznej) i docelowych (dla maksymalnej reakcji i minimalnego spontanicznego uwalniania/51Cr). Wymagany jest kontakt efektora z komórką docelową (co prowadzi do powszechnego stosowania 96-dołkowych płytek okrągłodennych w celu zachęcenia do kontaktu komórka-komórka) (2). Wreszcie, analiza danych zależy od włączenia populacji komórek docelowych kontroli dodatniej i ujemnej. 
Poniższy protokół nakreśli kroki wykonywania standardowego testu uwalniania 51Cr w celu zmierzenia zdolności cytotoksycznych populacji komórek efektorowych, chociaż niedawno opracowano nieradioaktywną wersję z użyciem europu. 51Cr jest potężnym emiterem promieniowania γ. W związku z tym zastosowanie tego testu wymaga odpowiedniego przeszkolenia w zakresie bezpieczeństwa radiacyjnego, wydzielonej przestrzeni laboratoryjnej, licznika promieniowania gamma i utylizacji próbek radioaktywnych. 
Ogólna sekwencja zdarzeń w tym teście jest następująca: 1) przygotowanie 51Cr znakowanych celami; 2) Przygotuj komórki efektorowe i dodaj do płytki podczas znakowania komórek docelowych; 3) dodaj oznaczone cele do tabliczki; 4) płytka do inkubacji; 5) zebrać supernatanty; oraz 6) Analizuj dane po uruchomieniu próbek na liczniku. Próbki są zwykle przygotowywane w trzech egzemplarzach, a następnie uśredniane w celu uwzględnienia wszelkich subtelnych różnic w pipetowaniu. 
Odpowiednie środki ochrony osobistej są ważne dla tego testu. W szczególności użytkownik powinien nosić fartuch laboratoryjny i rękawice. Okulary ochronne mogą być wymagane w zależności od laboratorium lub instytucji. Powinno być wystarczająco dużo ekranowania ołowiu do bezpiecznego przechowywania i używania 51Cr podczas wszystkich etapów. Wreszcie, powinna być wydzielona przestrzeń laboratoryjna i sprzęt do korzystania z 51Cr, w tym wszystkie odpowiednie oznakowania wskazujące, gdzie przechowywane są próbki z 51Cr oraz licznik Geigera wyposażony w sondę gamma do badania przestrzeni pod kątem ewentualnego zanieczyszczenia. 
W tym ćwiczeniu laboratoryjnym określimy zdolność ludzkich komórek jednojądrzastych krwi obwodowej (PBMC) (stymulowanych CpG vs. niestymulowanych) do zabijania komórek czerniaka, używając ludzkiej linii komórkowej czerniaka WM793 jako modelu i testu uwalniania chromu.

W tym przykładzie komórki efektorowe stymulowane CpG (ryc. 1, czarne kółka) zabijały komórki docelowe skuteczniej, ponieważ wzrastał stosunek komórek efektorowych do komórek docelowych. Wzrost ten nie został zaobserwowany w niestymulowanych PBMC (białe kółka), co wskazuje, że stymulacja CpG jest niezbędna do obserwowanego wzrostu lizy komórek docelowych. 
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_uplo...

Test na śmierć komórki: Test uwalniania chromu o zdolności cytotoksycznej

Source: Frances V. Sjaastad1,2, Whitney Swanson2,3, and Thomas S. Griffith1,2,3,4
1 Microbiology, Immunology, and Cancer Biology Graduate Program, ...

W tym filmie zobaczysz, jak przeprowadzić test uwalniania chromu i określić potencjał cytotoksyczny komórek efektorowych. Komórki odpornościowe są odpowiedzialne za identyfikację i usuwanie potencjalnie szkodliwych komórek, takich jak rak lub komórki zakażone wirusem, z organizmu, co jest integralną częścią odpowiedzi immunologicznej. Kilka komórek odpornościowych, takich jak limfocyty T i komórki NK, posiada właściwość znaną jako potencjał cytotoksyczny, która jest zdolnością do identyfikowania komórek docelowych i wydzielania białek, które indukują degradację białek, lizę i śmierć tych komórek docelowych. Kwantyfikacja potencjału cytotoksycznego ma kluczowe znaczenie dla pomiaru aktywacji i siły działania komórek odpornościowych, a test uwalniania chromu jest powszechnie stosowany w tym celu. Metoda ta umożliwia użytkownikom porównanie cytoksyczności indukowanej przez określone typy komórek odpornościowych w różnych warunkach, co jest cenne dla badania immunoterapii nowotworów i chorób związanych z odpornością. Na początek komórki docelowe, takie jak komórki rakowe, są inkubowane z radioaktywnym izotopem, chromem 51, który jest pobierany przez komórki. Następnie te znakowane radiowo komórki są hodowane wspólnie z izolowanymi komórkami odpornościowymi będącymi przedmiotem zainteresowania, zwanymi również komórkami efektorowymi, na okrągłej, 96-dołkowej płytce, aby ułatwić interakcję między dwoma typami komórek. Ogólna konfiguracja testu obejmuje inkubację określonej liczby komórek docelowych o różnych stężeniach komórek odpornościowych, wraz z odpowiednimi kontrolami. Kokultura pozwala komórkom efektorowym na indukowanie apoptozy i lizy w komórkach docelowych, co powoduje uwolnienie wewnątrzkomórkowego chromu 51 do supernatantu. Następnie, we wstępnie zoptymalizowanym punkcie czasowym, supernatant zawierający uwolniony chrom jest zbierany ze wszystkich studzienek. Chrom 51, będąc radioaktywny, spontanicznie ulega rozpadowi promieniotwórczemu, emitując promieniowanie gamma. Poziomy promieniowania gamma w supernatantach ze wszystkich studzienek na płytce testowej reprezentują wymierny wynik lizy komórek docelowych. Mierzy się to za pomocą licznika gamma, który jest następnie wykorzystywany do określenia potencjału cytotoksycznego komórek odpornościowych. Na początek komórki docelowe, ludzka linia komórkowa czerniaka WM793 w tym przykładzie, są przygotowywane do zawiesiny pojedynczej komórki. Aby to zrobić, najpierw usuń pożywkę z kolby do hodowli tkankowych i umyj komórki pięcioma mililitrami 1X PBS. Zdekantuj PBS, a następnie dodaj jeden mililitr trypsyny do płytki na około dwie minuty. Delikatnie postukać w kolbę, aby poluzować komórki z powierzchni kolby, a następnie dodać do kolby pięć mililitrów pożywki RPMI. Pipetować pożywkę w górę iw dół, aby zebrać komórki i dodać tę zawiesinę do stożkowej probówki o pojemności 15 mililitrów. Umieść probówkę w wirówce na pięć minut przy 1200 obr./min. Następnie wyjmij pożywkę z tuby, uważając, aby nie zakłócić osadu komórkowego. Delikatnie przesuń spód probówki, aby rozbić osad komórkowy i dodaj 10 mililitrów pożywki do probówki. Następnie delikatnie odpipetuj pożywkę w górę i w dół, aby doprowadzić komórki do zawiesiny. Następnie określ stężenie komórek za pomocą hemocytometru i przenieś dwa mililitry oryginalnej zawiesiny komórek do nowej stożkowej rurki o pojemności 15 mililitrów. Umieść probówkę w wirówce i granuluj komórki z prędkością 12 stu obr./min przez pięć minut. Po odwirowaniu wylej nadmiar pożywki z probówki do pojemnika na odpady. Krótko zawirować rurkę, aby ponownie zawiesić osad komórek w małej objętości pozostawionego podłoża. Następnie przygotuj się do użycia Chromu 51, przenosząc się do przestrzeni laboratoryjnej przeznaczonej dla tej konkretnej radioaktywności. Powinna być wystarczająca ilość osłon ołowiowych do bezpiecznego przechowywania i użytkowania Chromium 51 na wszystkich etapach, a także odpowiednie oznakowanie wskazujące, gdzie przechowywane są próbki z Chromium 51. Licznik Geigera wyposażony w sondę naleśnikową jest również niezbędny do obsługi w przestrzeni na ewentualne zanieczyszczenie. Po ustawieniu do prawidłowego wykorzystania radioaktywności dodaj 100 mikrokiurów chromu 51 bezpośrednio do zawiesiny komórki docelowej. Następnie dodaj mały kawałek taśmy radioaktywnej do probówki, aby wskazać, że próbka i probówka są teraz radioaktywne. Umieść probówkę w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza z ołowianą osłoną i inkubuj przez godzinę, przesuwając probówkę co 15 do 20 minut. Podczas znakowania komórek docelowych przygotuj zawiesinę pojedynczych komórek efektorowych. W tym przykładzie ludzkie komórki monojądrowe krwi obwodowej (PDMC) wyizolowano z krwi pełnej przez wirowanie w standardowym gradionym gradimencie gęstości do stężenia 5 razy 10 do 6. Przenieść tę zawiesinę komórek efektorowych do jednorazowego zbiornika odczynnika, a następnie dodać 200 mikrolitrów tej zawiesiny do każdej studzienki rzędu B na 96-dołkowej płytce z okrągłym dnem. Następnie dodaj 100 mikrolitrów RPMI do każdej studzienki w rzędzie od C do G płytki. Teraz zacznij wykonywać seryjne rozcieńczenia PBMC, aby uzyskać zakres numerów komórek efektorowych, najpierw usuwając 100 mikrolitrów komórek w studzienkach w rzędzie B i dodając je do rzędu C. Następnie należy dalej rozcieńczyć komórki efektorowe, przenosząc 100 mikrolitrów komórek z rzędu C do rzędu D. Kontynuować rozcieńczanie szeregowe. Po osiągnięciu rzędu G przesuń 100 mikrolitrów z dołków, aby pozostawić końcową objętość 100 mikrolitrów w każdym dołku w tym rzędzie. Następnie dodaj 100 mikrolitrów pożywki do hodowli tkankowych do studzienek w rzędzie A, aby służyły jako kontrola spontanicznego uwalniania chromu 51 z komórek docelowych, ponieważ do tego rzędu nie należy dodawać żadnych komórek efektorowych. Następnie umieść płytkę w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza, aż komórki docelowe będą gotowe do dodania. Po okresie inkubacji wyjąć komórki docelowe z inkubatora i przemyć 5 mililitrami FBS, aby usunąć nadmiar chromu 51. Następnie umieść probówkę w przeznaczonej do tego wirówce i wiruj z prędkością 1200 obr./min przez 5 minut. Usunąć radioaktywny płyn do płukania FBS do odpowiedniego pojemnika na odpady i powtórzyć etap mycia, ponownie zawieszając granulki w świeżych 5 mililitrach FBS. Umieść probówkę w przeznaczonej do tego wirówce i ponownie wiruj komórki z prędkością 1200 obr./min przez 5 minut. Usunąć drugie płukanie i sprawdzić osad pod kątem wbudowanej radioaktywności za pomocą licznika Geigera. Na koniec ponownie zawiesić osad w 10 mililitrach kompletnego podłoża i wlać zawiesinę komórek docelowych oznaczoną Chromium 51 do jednorazowego zbiornika na odczynnik. Następnie dodaj 100 mikrolitrów tych oznakowanych komórek docelowych do każdego dołka 96-dołkowej płytki komórki efektorowej. Następnie dodaj 100 mikrolitrów 1% NP-40 w wodzie do studzienek w rzędzie H, aby zlizować wszystkie komórki docelowe w każdym rzędzie. Studnie te będą używane jako kontrola do określania całkowitej liczby na minutę lub cpm. Teraz, gdy tabliczka jest przygotowana, zabezpiecz pokrywkę, dodając mały kawałek taśmy z każdej strony płytki i umieść kawałek taśmy radioaktywnej na pokrywce, aby wskazać, że zawiera chrom 51. Następnie umieść płytkę w wirówce oznaczonej do pracy z próbkami radioaktywnymi. Jeśli używana jest tylko jedna płytka doświadczalna, dodaj płytkę równoważącą do wirówki. Ustaw wirówkę na 1200 obr./min i zwiększ prędkość płytki. Po osiągnięciu prędkości zatrzymaj maszynę. Wyjmij płytkę z wirówki. Następnie umieść płytkę w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza z małym kawałkiem ołowianej osłony nad płytką dla dodatkowego bezpieczeństwa. Inkubować przez 16 godzin, aby umożliwić lizie komórek docelowych. Pod koniec okresu inkubacji ostrożnie usuń taśmę wokół krawędzi płytki i zdejmij pokrywkę. Następnie umieść ramę do zbioru na talerzu, upewniając się, że małe krążki filtra są na swoim miejscu dla każdej z bawełnianych zatyczek. Teraz powoli i delikatnie wciśnij bawełniane zatyczki do studzienek. Po około dziesięciu sekundach zwolnij nacisk na bawełniane zatyczki, a następnie przenieś bawełniane zatyczki na paski rurek. Umieść każdą z tych probówek w wtórnej probówce FACS. Na koniec załaduj probówki FACS na licznik gamma i uruchom próbki, aby określić ilościowo ilość chromu 51 uwolnionego w każdym stanie. Dokładnie zapisz kolejność, w jakiej probówki zostały załadowane do lady. W tym przypadku niestymulowane PBMC zostały dodane do pierwszych 3 pasów, a PMBC stymulowane CPG zostały dodane do pasów od 4 do 6. W tym przykładzie liczby na minutę zostały wprowadzone do komórek arkusza kalkulacyjnego w taki sam sposób, w jaki próbki zostały ułożone na oryginalnej płytce i obliczono średnie z trzech próbek. Na przykład w przypadku pierwszego warunku komórki A1, A2 i A3 zostały uśrednione w komórce I3. Po ustaleniu średnich za pomocą tego wzoru można obliczyć procent specyficznej lizy dla każdego stanu. Na przykład, aby obliczyć procentową specyficzną lizę dla niestymulowanych komórek, które miały stosunek 50 do 1 komórek efektorowych do komórek docelowych, spontaniczny CPM, który w tym przykładzie wynosi 1164,67, został odjęty od eksperymentalnego CPM, 1129. 67. Liczbę tę można następnie podzielić przez różnicę między maksymalnym CPM a spontanicznym CPM, a następnie pomnożyć przez 100, aby uzyskać procent specyficznej lizy. Jest to następnie obliczane dla każdego warunku. Dane te można następnie przedstawić na wykresie, aby pokazać porównanie stosunku E do T z procentową lizą swoistą zarówno dla niestymulowanych PBMC, jak i PBMC stymulowanych CPG. W tym przykładzie komórki efektorowe stymulowane CPG skuteczniej zabijały komórki docelowe wraz ze wzrostem stosunku komórek efektorowych do komórek docelowych. Wzrostu tego nie zaobserwowano w niestymulowanych PBMC, co wskazuje, że stymulacja CPG jest niezbędna do obserwowanego wzrostu lizy komórek docelowych.

assay-for-cell-death-chromium-release-assay-of-cytotoxic-ability

Education

JoVE Science Education

Advanced Biology

Biologia zaawansowana

Immunology

Immunologia

chromium release assay for immune cell killing

The chromium release assay measures how well immune cells kill target cells in the lab. It is used to test the cytotoxic ability of T cells, NK cells, and other effector cells against infected cells or tumor cells.

This assay works by labeling target cells with chromium-51, a radioactive tracer called Na2 51CrO4. The label quickly marks cellular proteins inside the target cells. When effector cells damage the target-cell membrane, the labeled proteins are released into the culture supernatant and can be measured.

Researchers use this setup to study antigen-specific and nonspecific killing. It is also useful in tumor immunotherapy research, where scientists may look for agents that boost immune cell killing. In other cases, the assay can help test ways to reduce overly strong immune cytotoxic activity.

Several practical points matter for a good result. Healthy effector cells give stronger killing, and healthy target cells help keep spontaneous death and background chromium release low. Because cell-to-cell contact is needed, round-bottom 96-well plates are often used. Proper data analysis also requires positive and negative control target cell groups.

The standard protocol includes preparing 51Cr-labeled targets, preparing effector cells, adding both cell groups to the plate, incubating, harvesting supernatants, and then analyzing the samples on a counter. Samples are often run in triplicate and averaged to reduce the effect of small pipetting differences. A nonradioactive Europium-based version is also available.

Because 51Cr is a powerful gamma radiation emitter, the assay requires radiation safety training, dedicated lab space, a gamma counter, and proper waste disposal. Users should wear a lab coat and gloves, and safety glasses may also be required. Lead shielding, clear signage, and a Geiger counter with a gamma probe are important for safe handling and contamination checks. In this lab exercise, human peripheral blood mononuclear cells, or PBMCs, are tested as CpG-stimulated or unstimulated effector cells against WM793 human melanoma cells.

Chromium Release Assay for Immune Cell Killing

chromium-release-assay-for-immune-cell-killing

flow cytometry and fluorescence-activated cell sorting (facs): isolation of splenic b lymphocytes

flow-cytometry-fluorescence-activated-cell-sorting-facs-isolation

Sorting B Cells from Spleen with FACS

Flow cytometry and FACS can be used to separate B lymphocytes from a mixed spleen cell sample. The immune system protects the body from infectious organisms and other invaders. White blood cells, also called leukocytes, are the main cells involved in this defense. Leukocytes can be grouped into subpopulations such as myeloid cells, lymphocytes, and dendritic cells. These groups can be distinguished by biological, physical, and functional features. Cell size, granularity, and secretion are...

magnetic activated cell sorting (macs): isolation of thymic t lymphocytes

magnetic-activated-cell-sorting-macs-isolation-of-thymic-t-lymphocytes

Enriching Thymic T Cells with Magnetic Sorting

Thymic T cell enrichment with magnetic sorting helps isolate a targeted immune cell group from a mixed sample. The immune system relies on many cell types, and lymphocytes are a major part of adaptive immunity. B cells usually respond to extracellular infections, such as bacterial infections, while T cells usually respond to intracellular infections, such as viral infections. Magnetic sorting enriches selected cells by using magnetic beads and antibodies against cell surface proteins. First,...

elisa assays: indirect, sandwich, and competitive

elisa-assays-indirect-sandwich-and-competitive

ELISA Methods for Detecting Antigens

ELISA methods detect antigens, antibodies, proteins, hormones, peptides, and other biomolecules in biological samples. Enzyme-linked immunosorbent assay is highly sensitive because it can detect very low antigen levels. It works by using an antigen-antibody interaction, then an enzyme-linked antibody turns a colorless substrate into a colored or fluorescent signal that a plate reader can measure. Different ELISA formats are used for different sample types and antibody setups. Indirect ELISA is...

elispot assay: detection of ifn-&#947; secreting splenocytes

elispot-assay-detection-of-ifn-secreting-splenocytes

ELISPOT Assay for Single-Cell Immune Detection

ELISPOT is a sensitive assay for detecting immune cells that release a specific protein. It is based on an ELISA, or enzyme-linked immunosorbent assay, but it shows single-cell responses as visible spots. The method was first described in 1983 by Czerkinsky to count B cell hybridomas that produce antigen-specific immunoglobulins. The assay was later adapted to measure cytokine-producing T lymphocytes. Because of that, ELISPOT is now a gold standard for measuring antigen-specific T cell...

immunohistochemistry and immunocytochemistry: tissue imaging via light microscopy

immunohistochemistry-immunocytochemistry-tissue-imaging-via-light

Antibody Staining of Tissue and Cells

Antibody staining of tissue and cells lets scientists see where a specific antigen is located. Immunohistochemistry, or IHC, uses thin tissue sections. Immunocytochemistry, or ICC, uses isolated cells or cells grown in culture. Both methods rely on antibodies that carry a chemical or fluorescent tag, such as peroxidase or rhodamine, so the target antigen can be detected under a light microscope. IHC keeps the structure of the whole tissue in place while the sample is stained. That makes it...

antibody generation: producing monoclonal antibodies using hybridomas

antibody-generation-producing-monoclonal-antibodies-using-hybridomas

Hybridoma Cell Culture for Monoclonal Antibodies

Hybridoma cell culture is used to produce monoclonal antibodies, or mAbs, with a known antigen specificity. Monoclonal antibodies come from a single clone of cells, so they recognize one target more precisely than polyclonal antibodies, which are a mixed group of antibodies against different antigenic determinants. That difference matters when similar molecules share epitopes, or antigen sites, that can confuse an antibody test. Polyclonal antisera can react with more than one related antigen.

immunofluorescence microscopy: immunofluorescence staining of paraffin-embedded tissue sections

immunofluorescence-microscopy-immunofluorescence-staining-paraffin

Fluorescent Antibody Staining of Tissue Slides

Fluorescent antibody staining lets scientists see specific proteins in thin tissue sections on glass slides. It is used to study normal tissue structure and to better understand how disease works. In many cases, the tissue comes from patient biopsies or from experimental in vivo models. The tissue is usually fixed in formalin or paraformaldehyde and embedded in paraffin wax before it is cut. This preservation method supports long-term storage and makes sectioning possible. A microtome is used...

confocal fluorescence microscopy: a technique to determine the localization of proteins in mouse fibroblasts

confocal-fluorescence-microscopy-technique-to-determine-localization

Confocal Microscopy for Protein Localization

Confocal fluorescence microscopy is used to show where proteins are located inside cells with better detail than wide-field epifluorescence microscopy. It improves image clarity by scanning the sample with lasers and using a pinhole to block out-of-focus light. This makes it easier to see whether a signal comes from the cell surface or from inside the cell. The method relies on fluorescence, which happens when a molecule absorbs light and then gives off a new photon. A fluorophore is a...

immunoprecipitation-based techniques: purification of endogenous proteins using agarose beads

immunoprecipitation-based-techniques-purification-endogenous-proteins

Protein Pull-Down with Antibodies and Beads

Immunoprecipitation uses antibodies and Protein A/G agarose beads to isolate a specific protein from a cell lysate. It is also called a pull-down assay. The term "immuno" refers to the antibody, and "precipitation" means pulling a substance out of solution. The target protein can be endogenous or recombinant. Recombinant proteins often carry epitope tags such as myc or flag, which makes purification easier because antibodies against these tags are usually strong and effective. Antibodies...

cell cycle analysis: assessing cd4 and cd8 t cell proliferation after stimulation using cfse staining and flow cytometry

cell-cycle-analysis-assessing-cd4-cd8-t-cell-proliferation-after

Tracking T Cell Division with CFSE and Flow Cytometry

Tracking T cell division with CFSE and flow cytometry shows how immune cells respond after stimulation. The cell cycle is a normal process of life. During it, a cell changes step by step and divides into two daughter cells. This happens throughout life when the body needs new cells for growth and repair. Cells that are not cycling are in the G0 phase, which means they are quiet. Once a cell enters the cycle, it moves through G1, S, G2, and M phases. G1 is a checkpoint for the resources needed...

adoptive cell transfer: introducing donor mouse splenocytes to a host mouse and assessing success via facs

adoptive-cell-transfer-introducing-donor-mouse-splenocytes-to-host

Tracking Transferred Mouse Splenocytes by FACS

Adoptive cell transfer is a method for moving cells into a host animal to study biology or help treat disease. Researchers can use it to follow cell movement and distribution, or to test how transferred cells behave in a mouse model. Tracking systems such as cell surface markers and CFSE staining can help show where the cells go after transfer. This approach has several uses in mouse studies. It can support cancer research by transferring specific cell populations as an experimental treatment...

assay for cell death: chromium release assay of cytotoxic ability

The chromium release assay measures how well immune cells kill target cells in the lab. It is used to test the cytotoxic ability of T cells, NK cells, and other effector cells against infected cells or tumor cells. This assay works by labeling target cells with chromium-51, a radioactive tracer called Na2 51CrO4. The label quickly marks cellular proteins inside the target cells. When effector cells damage the target-cell membrane, the labeled proteins are released into the culture supernatant...

immunology

This collection covers many staple techniques of immunology labs, including the labeling and sorting of immune cells. It also demonstrates proliferation methods for immune cells and antibodies, as well as common assays for immune activity including ELISA. Finally, it demonstrates staining and imaging of immune tissue and cell samples.

Measure immune cell killing with the chromium release assay. Learn how 51Cr-labeled target cells, PBMCs, and melanoma cells are used to assess cytotoxicity.

Chromium Release Assay for Immune Cell Killing

Description

Transcript

Tags