Chromatografia kolumnowa

Chromatografia kolumnowa

Istnieje wiele technik oczyszczania i oddzielania związków w laboratorium chemii organicznej. Jedną z najbardziej niezawodnych technik rozdzielania w mikroskali, w której do analizy dostępnych jest mniej niż 10 gramów związku, jest chromatografia kolumnowa. Ta technika rozdziela związki w mieszaninie na podstawie ich właściwości fizycznych, takich jak rozpuszczalność, polarność, hydrofobowość, rozmiar i ładunek.

Podstawy chromatografii

Głównymi składnikami każdego systemu chromatograficznego są faza stacjonarna, faza ruchoma i mieszanina próbek, która ma być analizowana. W chromatografii kolumnowej fazą stacjonarną są zazwyczaj kulki w mikroskali, które są równomiernie upakowane w pionowej kolumnie. Ciągły przepływ fazy ruchomej, znanej również jako rozpuszczalnik, jest dodawany do górnej części kolumny, która przepływa przez fazę stacjonarną grawitacyjnie lub przy kontrolowanym natężeniu przepływu przez pompę.

Próbkę rozpuszcza się w niewielkiej ilości rozpuszczalnika, a następnie dodaje do górnej części kolumny. Dodaje się więcej rozpuszczalnika, aby wymusić przepływ próbki przez fazę stacjonarną. Związki w mieszaninie dzielą się między fazę ruchomą a fazę stacjonarną w oparciu o ich różne właściwości i tworzą dyskretne pasma.

Związki o silnych oddziaływaniach z fazą stacjonarną będą poruszać się wolniej niż związki o słabych oddziaływaniach z fazą stacjonarną. Tak więc związki o słabych oddziaływaniach opuszczą kolumnę lub wymyją się wcześniej niż te o silnych oddziaływaniach. Siła oddziaływania związku z fazą stacjonarną jest określana przez współczynnik opóźnienia (R_f), który jest stosunkiem odległości przebytej przez komponent do odległości przebytej przez fazę ruchomą. Współczynnik opóźnienia określa się, wykonując najpierw chromatografię cienkowarstwową.

Wysoka wartość współczynnika opóźnienia wskazuje, że próbka silnie oddziałuje z fazą stacjonarną i wymywa się przez długi czas. Niska wartość współczynnika opóźnienia wskazuje, że próbka nie oddziałuje bardzo silnie z fazą stacjonarną i szybciej się eluuje. Ponieważ związki rozdzielają się na poszczególne pasma i eluują się z kolumny w różnym czasie ze względu na różne wartości RF, można je izolować indywidualnie, zbierając rozpuszczalnik spod kolumny we frakcjach.

Rozważania dotyczące chromatografii kolumnowej

Kolumna chromatograficzna to pionowo zorientowana szklana lub plastikowa rurka. Rozmiar kolumny może wynosić od kilku centymetrów (w przypadku pipet Pasteura) do metrów (w przypadku kolumn przemysłowych). Średnica kolumny zależy od ilości próbki do oddzielenia, natomiast długość kolumny zależy od trudności separacji. Najbardziej efektywny podział na dyskretne pasma wymaga cienkich warstw próbki; Dlatego określenie odpowiedniej średnicy jest kluczowym krokiem. Załadowanie zbyt dużej objętości próbki w stosunku do średnicy kolumny spowoduje utworzenie szerszych i mniej zdefiniowanych pasm niż ta sama objętość próbki w kolumnie o większej średnicy.

Przy doborze długości kolumny należy wziąć pod uwagę wartości R_f składników. Komponenty o podobnych współczynnikach opóźnienia mogą być trudne do oddzielenia i wymagają dłuższej kolumny do rozdzielenia poszczególnych pasm. Związki o bardzo różnych współczynnikach opóźnienia mogą nie wymagać długiej kolumny, ponieważ powinny łatwo się dzielić. Przy wyborze fazy stacjonarnej ważne jest, aby wybrać taką, która powoduje różne współczynniki opóźnienia dla każdego komponentu.

Przygotowanie kolumny jest najbardziej krytyczną częścią prowadzenia kolumny chromatograficznej. Masa fazy stacjonarnej upakowanej w kolumnie powinna być co najmniej 20 razy większa od masy próbki. Jeśli kolumna nie ma porowatego dysku na dole, należy ją wypełnić bawełną i cienką warstwą piasku. Zapobiega to utracie fazy stacjonarnej przez wyjście kolumny.

Istnieją dwie metody pakowania kolumny: metoda pakowania na sucho i metoda gnojowicy. W metodzie suchej faza stacjonarna jest przenoszona do kolumny w postaci proszku. Kolumna jest następnie kilkakrotnie przemywana fazą ruchomą/rozpuszczalnikiem, aby upewnić się, że rozpuszczalnik przenika do każdej części kolumny z żelem krzemionkowym. Ta metoda, jeśli nie zostanie wykonana prawidłowo, może zwiększyć prawdopodobieństwo tworzenia się suchych plam, kanałów i pęcherzyków powietrza w kolumnie. Wady te wpłyną na zdolność kolumny do dzielenia składników mieszaniny.

Metoda gnojowicy zapewnia bardziej jednolitą wypełnioną kolumnę, która nie zawiera pęcherzyków powietrza, suchych obszarów i kanałów. W przypadku tej metody fazę stacjonarną miesza się z rozpuszczalnikiem w celu uzyskania spójnej zawiesiny. Gnojowica jest następnie przenoszona do kolumny, stukając po bokach, aby pozbyć się powstałych pęcherzyków powietrza. Zawór odcinający kolumny, jeśli taki istnieje, powinien być otwarty na tym etapie, aby umożliwić spuszczenie rozpuszczalnika.

Chromatografia w żelu krzemionkowym

Do oddzielenia mieszaniny związków wykorzystuje się wiele różnych właściwości, takich jak rozmiar, ładunek i hydrofobowość. Jedną z właściwości używanych do rozdzielania związków w chemii organicznej jest polarność. W tym celu najczęściej stosowanymi fazami stacjonarnymi są żel krzemionkowy i żel z tlenku glinu. Żel krzemionkowy jest niezwykle polarny i tworzy silne oddziaływania dipol-dipol ze związkami polarnymi. Ponadto żel krzemionkowy może tworzyć wiązania wodorowe z analitem ze względu na obecność grup -OH na jego powierzchni.

Składniki mieszaniny, które są najbardziej polarne, silnie wiążą się z żelem krzemionkowym i powoli przemieszczają się przez kolumnę, podczas gdy składniki niepolarne są bardziej rozpuszczalne w fazie ruchomej i szybko przemieszczają się przez kolumnę. Dlatego ważne jest, aby składniki mieszaniny miały różne polaryzacje. Składniki, które silnie oddziałują z fazą stacjonarną, są eluowane przez przepływ polarnej fazy ruchomej przez kolumnę.

Odwołania

1. Shuler, M.L., Kargi, K., DeLisa, M. (2017). Inżynieria bioprocesowa, podstawowe pojęcia. Upper Saddle River, NJ: Prentice Hall.
2. Harris, D.C. (2015). Ilościowa analiza chemiczna. Nowy Jork, NY: W.H. Freeman and Company.

Chromatografia kolumnowa to technika, która wykorzystuje wypełnioną kolumnę do oddzielania związków na podstawie ich interakcji z fazą stacjonarną, która zwykle ma postać mikroskopijnych kulek. Przestrzenie między kulkami są wypełnione rozpuszczalnikiem. Otwarcie kolumny umożliwia przepływ rozpuszczalnika przez fazę stacjonarną. Kiedy mieszanina jest nakładana na górną część wypełnionej kolumny, a następnie większa ilość rozpuszczalnika, mieszanina przechodzi do fazy ruchomej i przepływa przez fazę stacjonarną.

Każdy składnik mieszaniny oddziałuje z fazą stacjonarną w inny sposób. Niektóre składniki mają słabe oddziaływania z fazą stacjonarną, a więc szybko poruszają się w kolumnie, podczas gdy inne mają silne oddziaływania z fazą stacjonarną, a zatem poruszają się wolniej. To rozdziela różne związki na pasma, które są zbierane w małych frakcjach. Umożliwia to oczyszczenie każdego związku.

Jakie właściwości można zatem wykorzystać do rozdzielania mieszanin? Jedną z najczęściej stosowanych właściwości jest polaryzacja. W tym celu jako fazę stacjonarną często stosuje się żel krzemionkowy, który jest formą dwutlenku krzemu. Żel krzemionkowy oddziałuje ze związkami poprzez oddziaływania dipol-dipol i wiązanie wodorowe poprzez grupy -OH, które tworzą się na jego powierzchni. Tak więc związki polarne będą oddziaływać silnie z fazą stacjonarną, podczas gdy związki niepolarne będą oddziaływać słabo.

Inne właściwości, które można wykorzystać do separacji, to rozmiar, ładunek i hydrofobowość. Powszechnym sposobem ładowania fazy stacjonarnej do kolumny jest zawiesina fazy stacjonarnej i rozpuszczalnika. Następnie faza stacjonarna jest pakowana poprzez przepuszczenie większej ilości rozpuszczalnika przez kolumnę w celu zagęszczenia zawiesiny. Istotne jest, aby faza stacjonarna była upakowana równomiernie, bez pęcherzyków powietrza, pustych kanałów lub suchych plam. Mogą one zakłócić przepływ i spowodować mieszanie się pasm.

Przy wyborze kolumny średnica zależy od objętości próbki, która ma zostać oddzielona. Próbka powinna pokrywać górną część kolumny cienką, równą warstwą. Grubsza warstwa próbki prowadzi do szerszych pasm. Długość kolumny zależy od tego, jak dobrze związki rozdzielają się w fazie stacjonarnej. Związki o podobnym powinowactwie do fazy stacjonarnej wymagają długiej kolumny w celu odpowiedniego oddzielenia. Jednak mieszaninę związków o bardzo różnym powinowactwie do fazy stacjonarnej można wydzielić na krótszej kolumnie.

W tym laboratorium poznasz chromatografię kolumnową, najpierw pakując i przygotowując kolumnę z żelem krzemionkowym. Następnie użyjesz swojej kolumny, aby oddzielić kolorowe składniki w zielonym barwniku spożywczym.