What is the purpose of the sand layer in column chromatography?

The sand layer, placed 0.5 cm above the cotton plug, prevents silica gel from passing through the plug into your collected fractions. This protective barrier ensures that only the separated dyes are collected in pure fractions, maintaining the integrity of your samples throughout the separation process.

Why does column chromatography use two different eluents for separating food dyes?

Using ethanol first elutes erioglaucine, which has lower affinity for silica gel, while water elutes tartrazine more effectively due to its higher polarity. This two-solvent approach saves time and minimizes solvent waste while maintaining fraction purity, compared to using a single eluent throughout the entire separation.

How do you prepare the silica gel slurry for column chromatography?

Weigh 5 grams of silica gel powder and mix it with 18 mL of 95% ethanol in a beaker. Stir with a glass rod until the texture is consistent and resembles batter with no dry patches or clumps. The slurry should flow easily to avoid clogging the funnel or trapping air bubbles in the column.

What flow rate should you maintain when eluting dyes through the column?

Adjust the stopcock so the solvent level decreases approximately 1 mL every 15 to 20 seconds. Maintain at least 1 cm of solvent above the silica gel at all times by periodically refilling the column. This controlled solvent flow rate ensures proper separation and prevents band broadening during the elution process.

How do you apply the green food dye to the silica gel column?

Use a clean pipette to gently apply 5 to 7 drops of the dye solution evenly across the top of the silica gel. If necessary, add a few drops of ethanol to keep the silica gel covered. Allow the dye to soak in before beginning the elution process with your chosen eluent.

What do the different colors of fractions tell you about dye affinity for silica gel?

The blue erioglaucine elutes with ethanol, indicating lower affinity for silica gel, while yellow tartrazine requires water, indicating higher affinity. This separation demonstrates that tartrazine binds more strongly to silica gel than erioglaucine does, which is why different solvents are needed to elute each dye effectively.

Why is it important to avoid stopping the column chromatography for extended periods?

Stopping for more than 1 minute at a time causes compound bands to start broadening, which reduces separation quality and makes it harder to collect pure fractions. Continuous flow maintains sharp band definition and ensures efficient separation of the dyes throughout the elution process.

Chromatografia kolumnowa

Koncepcje Przygotowanie instruktora Protokół studencki

0 wyświetleń03:07 min

Chromatografia kolumnowa to technika, która wykorzystuje wypełnioną kolumnę do oddzielania związków na podstawie ich interakcji z fazą stacjonarną, która zwykle ma postać mikroskopijnych kulek. Przestrzenie między kulkami są wypełnione rozpuszczalnikiem. Otwarcie kolumny umożliwia przepływ rozpuszczalnika przez fazę stacjonarną. Kiedy mieszanina jest nakładana na górną część wypełnionej kolumny, a następnie większa ilość rozpuszczalnika, mieszanina przechodzi do fazy ruchomej i przepływa przez fazę stacjonarną.

Każdy składnik mieszaniny oddziałuje z fazą stacjonarną w inny sposób. Niektóre składniki mają słabe oddziaływania z fazą stacjonarną, a więc szybko poruszają się w kolumnie, podczas gdy inne mają silne oddziaływania z fazą stacjonarną, a zatem poruszają się wolniej. To rozdziela różne związki na pasma, które są zbierane w małych frakcjach. Umożliwia to oczyszczenie każdego związku.

Jakie właściwości można zatem wykorzystać do rozdzielania mieszanin? Jedną z najczęściej stosowanych właściwości jest polaryzacja. W tym celu jako fazę stacjonarną często stosuje się żel krzemionkowy, który jest formą dwutlenku krzemu. Żel krzemionkowy oddziałuje ze związkami poprzez oddziaływania dipol-dipol i wiązanie wodorowe poprzez grupy -OH, które tworzą się na jego powierzchni. Tak więc związki polarne będą oddziaływać silnie z fazą stacjonarną, podczas gdy związki niepolarne będą oddziaływać słabo.

Inne właściwości, które można wykorzystać do separacji, to rozmiar, ładunek i hydrofobowość. Powszechnym sposobem ładowania fazy stacjonarnej do kolumny jest zawiesina fazy stacjonarnej i rozpuszczalnika. Następnie faza stacjonarna jest pakowana poprzez przepuszczenie większej ilości rozpuszczalnika przez kolumnę w celu zagęszczenia zawiesiny. Istotne jest, aby faza stacjonarna była upakowana równomiernie, bez pęcherzyków powietrza, pustych kanałów lub suchych plam. Mogą one zakłócić przepływ i spowodować mieszanie się pasm.

Przy wyborze kolumny średnica zależy od objętości próbki, która ma zostać oddzielona. Próbka powinna pokrywać górną część kolumny cienką, równą warstwą. Grubsza warstwa próbki prowadzi do szerszych pasm. Długość kolumny zależy od tego, jak dobrze związki rozdzielają się w fazie stacjonarnej. Związki o podobnym powinowactwie do fazy stacjonarnej wymagają długiej kolumny w celu odpowiedniego oddzielenia. Jednak mieszaninę związków o bardzo różnym powinowactwie do fazy stacjonarnej można wydzielić na krótszej kolumnie.

W tym laboratorium poznasz chromatografię kolumnową, najpierw pakując i przygotowując kolumnę z żelem krzemionkowym. Następnie użyjesz swojej kolumny, aby oddzielić kolorowe składniki w zielonym barwniku spożywczym.

Print Procedure Steps

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Źródło: Lara Al Hariri i Ahmed Basabrain z University of Massachusetts Amherst, MA, USA

Chromatografia kolumnowa barwnika spożywczego
W tym eksperymencie użyjesz chromatografii kolumnowej, aby oddzielić zielony barwnik spożywczy na jego składniki niebieskie i żółte barwniki, zwane erioglacjucyną i tartrazyną. Po pierwsze, użyjesz 95% etanolu, aby wymyć barwnik o słabszym powinowactwie do żelu krzemionkowego. Następnie spłucz drugi barwnik z kolumny wodą. Aby odzyskać oczyszczone barwniki, zbierzesz każde pasmo barwnika, gdy opuszcza kolumnę. Te zebrane objętości nazywane są ułamkami.
- Na początek załóż fartuch laboratoryjny, okulary ochronne i parę rękawiczek nitrylowych.
- Przynieś kolumnę lub biuretę do centralnego obszaru zaopatrzenia. Weź kawałek waty lub waty szklanej i wciśnij go w górną część kolumny. Użyj długiego, tępo zakończonego drutu lub pręta, aby popchnąć go w dół, aby zatkać kolumnę tuż nad kurkiem. nuta: Bawełna musi być stabilna, ale nie pakuj jej zbyt gęsto, ponieważ rozpuszczalnik musi przez nią łatwo przejść. Upewnij się, że kran może się swobodnie obracać bez zaczepiania o wtyczkę.
- Przymocuj zacisk biurety do stojaka laboratoryjnego i zaciśnij kolumnę pionowo, mając pod nią około 4 cali wolnej przestrzeni. Upewnij się, że kran jest zamknięty.
- Oznacz zlewkę o pojemności 100 ml jako 'odpad' i umieść ją pod kolumną.
- Następnie odmierz 1 g piasku w tarowanej łodzi do ważenia i przynieś go z powrotem na stół.
- Następnie zaznacz kolumnę około 0,5 cm powyżej górnej części bawełnianej zatyczki.
- Umieść mały lejek w górnej części kolumny i przelej przez niego tyle piasku, aby nad korkiem znajdowała się warstwa o głębokości 0,5 cm. Zapobiegnie to przedostawaniu się żelu krzemionkowego przez korek do twoich frakcji.
- Wyjmij lejek i delikatnie postukaj w kolumnę, aby równomiernie rozprowadzić piasek.
- Teraz przygotuj swoje eluenty. Oznacz zlewkę o pojemności 50 ml i cylinder z podziałką o pojemności 50 ml jako "wodę".
- Odmierz 50 ml wody dejonizowanej za pomocą cylindra z podziałką i wlej ją do zlewki.
- Następnie oznacz kolejną 50-mililitrową zlewkę i 50-mililitrowy cylinder z podziałką jako 'etanol'. Odmierz 50 ml 95% etanolu i wlej go do tej zlewki.
- Teraz zdobądź 4 lub 5 czystych pipet Pasteura i bańkę do pipet. Delikatnie odpipetować 7 – 8 ml etanolu wzdłuż wewnętrznych ścianek kolumny. Ta warstwa rozpuszczalnika pozwoli Ci wlać tę zawiesinę żelu krzemionkowego do kolumny bez naruszania piasku.
- Otwórz kran i spuść ~1 ml etanolu do zlewki na odpady, aby wypłukać powietrze z zaworu odcinającego i upewnić się, że rozpuszczalnik łatwo przepływa przez korek. Upewnij się, że w piasku i korku nie ma suchych plam i delikatnie postukaj w bok kolumny, aby usunąć uwięzione pęcherzyki powietrza.
- Następnie umieść czysty lejek w górnej części kolumny i oznacz trzecią 50-mililitrową zlewkę 'zawiesina z żelu krzemionkowego w etanolu'.
- Ostrożnie zważ 5 g proszku z żelu krzemionkowego i wlej go do oznaczonej zlewki.
- Następnie przynieś żel krzemionkowy, szklany pręt i butlę z podziałką etanolu do okapu dozującego etanol
  .
- Odmierz 18 ml 95% etanolu i wlej go do zlewki. Mieszaj mieszaninę ze szklaną pałeczką, aż konsystencja będzie spójna i nie pozostaną żadne suche plamy ani grudki proszku. Zwykle zajmuje to ~1 min. Uwaga: Gnojowica powinna być gęsta, jak ciasto, ale nadal powinna łatwo płynąć. Jeśli gnojowica jest zbyt sztywna, może zatkać lejek lub uwięzić pęcherzyki powietrza w kolumnie.
- Gdy proszek zostanie całkowicie zawieszony w etanolu, przynieś go na swoją ławkę. Mieszaj gnojowicę, aż jej konsystencja znów będzie spójna i natychmiast wlej ją do kolumny.
- Delikatnie postukaj w boki kolumny, gdy żel krzemionkowy opada, aby pozbyć się pęcherzyków powietrza.
- Przepłucz zlewkę 1 lub 2 ml etanolu i wlej płukanie do kolumny. Następnie wyjmij lejek i odłóż go na bok.
- Pipetuj etanol wzdłuż wewnętrznej strony kolumny, aby zmyć cząsteczki przyklejone do ścianek. Następnie spuść rozpuszczalnik, aż menisk znajdzie się ledwo nad górną częścią żelu krzemionkowego.
- Teraz użyj 5- lub 10-mililitrowego cylindra z podziałką, aby uzyskać około 0,8 ml roztworu zielonego barwnika spożywczego.
- Użyj czystej pipety, aby delikatnie nanieść 5 do 7 kropli roztworu barwnika równomiernie na wierzch żelu krzemionkowego. W razie potrzeby dodaj kilka kropli etanolu, aby żel krzemionkowy był pokryty.
- Czekając, aż barwnik wsiąknie, oznacz dwie czyste zlewki o pojemności 50 ml jako 'frakcja etanolowa' i 'frakcja wodna'. Wymienić zlewkę na odpady znajdujące się pod kolumną ze zlewką na frakcję etanolu.
- Następnie napełnij kolumnę etanolem, pipetując pierwszy ml wzdłuż wewnętrznych ścianek, aby uniknąć naruszenia żelu krzemionkowego.
- Następnie otwórz częściowo zawór odcinający i reguluj go, aż poziom rozpuszczalnika spadnie ~1 ml co 15 – 20 sekund.
- Okresowo uzupełniaj kolumnę, aby utrzymać przepływ etanolu. Upewnij się, że przez cały czas nad żelem krzemionkowym znajduje się co najmniej 1 cm rozpuszczalnika.
- Monitoruj żółte i niebieskie paski, gdy się rozdzielają. nuta: Jeśli musisz się odsunąć, zamknij kurek, aby kolumna nie wyschła, gdy Cię nie będzie. Unikaj zatrzymywania się na dłużej niż 1 minutę na raz, ponieważ pasma złożone zaczną się rozszerzać. Zwykle potrzeba około 20 – 35 minut, aby szybciej rotujący barwnik opuścił kolumnę.
- Gdy już zbierzesz wszystkie szybciej poruszające się barwniki w zlewce frakcji etanolu, zamknij kurek, odłóż frakcję etanolu na bok i umieść zlewkę na odpady pod kolumną.
- Opróżnij rozpuszczalnik, aż menisk znajdzie się tuż nad górną częścią żelu krzemionkowego. Następnie wymień zlewkę na odpady na zlewkę z frakcją wodną.
- Użyj czystej pipety, aby napełnić górną część kolumny wodą dejonizowaną. Następnie otwórz kran na tyle, aby woda przepływała przez kolumnę z szybkością około 1 ml co 15 – 20 s.
- Uzupełnij kolumnę wodą w razie potrzeby, aż drugi pas koloru całkowicie opuści kolumnę. Zwykle zajmuje to kolejne 15 – 25 minut. Następnie zamknij zawór odcinający i wymień zlewkę z frakcją wodną na zlewkę na odpady.
- Teraz całkowicie opróżnij kolumnę i pozostaw otwarty kurek.
- Zapisz kolory frakcji etanolu i wody w swoim notatniku laboratoryjnym.
  Tabela 1: Chromatografia kolumnowa barwnika spożywczego
  
  Kolor Objętość (ml)
  Frakcja etanolowa
  Frakcja wodna
  Kliknij tutaj, aby pobrać tabelę 1
- Wlej frakcje do odpowiednich cylindrów z podziałką 50 ml i zapisz objętość każdej frakcji. Następnie zamknij kran i doprowadź kolumnę do dygestorium.
- Zaciśnij kolumnę pionowo w kapturze, aby żel krzemionkowy mógł wyschnąć. Twój instruktor powie Ci, jak wyczyścić kolumnę lub zajmie się nią po laboratorium.
- Teraz spłucz zebrane frakcje i resztki etanolu, wody i roztworu barwnika do kanalizacji, a resztę szkła wyczyść jak zwykle.
- Wyrzuć zużyte pipety Pasteura do szklanych odpadów. Wyrzuć zużyte ręczniki papierowe i łódkę do wagi do kosza laboratoryjnego i wyczyść blat stołu przed wyjściem.
WynikiRozwiń
W tym eksperymencie zaobserwowałeś, że etanol wymywał niebieską erioglaucynę w odpowiednim czasie, ale nie był skutecznym eluentem dla żółtej tartrazyny. Chromatografia bibułowa zielonego barwnika daje podobne wyniki. W związku z tym wnioskujemy, że erioglaucyna ma mniejsze powinowactwo do żelu krzemionkowego niż tartrazyna.

Teraz rozważ zalety użycia dwóch rozpuszczalników do osobnego eluowania barwnika. Woda jest bardziej polarna niż etanol, więc zakładamy, że wymywałaby oba barwniki szybciej niż sam etanol. Chociaż ogólnie zużyłbyś mniej rozpuszczalnika, gdybyś użył tylko wody, separacja byłaby gorsza, co utrudniłoby zbieranie czystych frakcji.

Alternatywnie, mógłbyś nadal używać etanolu po zebraniu erioglaucyny, ale wymycie tartrazyny w ten sposób zajęłoby dużo czasu i dużo etanolu. Zamiana eluentu na wodę po elucji erioglaucyny zaoszczędziła czas i zminimalizowała straty rozpuszczalnika bez poświęcania czystości.