Chromatografia kolumnowa

Źródło: Lara Al Hariri i Ahmed Basabrain z University of Massachusetts Amherst, MA, USA

1. Chromatografia kolumnowa barwnika spożywczegoRozwiń

   W tym eksperymencie użyjesz chromatografii kolumnowej, aby oddzielić zielony barwnik spożywczy na jego składniki niebieskie i żółte barwniki, zwane erioglacjucyną i tartrazyną. Po pierwsze, użyjesz 95% etanolu, aby wymyć barwnik o słabszym powinowactwie do żelu krzemionkowego. Następnie spłucz drugi barwnik z kolumny wodą. Aby odzyskać oczyszczone barwniki, zbierzesz każde pasmo barwnika, gdy opuszcza kolumnę. Te zebrane objętości nazywane są ułamkami.

   • Na początek załóż fartuch laboratoryjny, okulary ochronne i parę rękawiczek nitrylowych.
   • Przynieś kolumnę lub biuretę do centralnego obszaru zaopatrzenia. Weź kawałek waty lub waty szklanej i wciśnij go w górną część kolumny. Użyj długiego, tępo zakończonego drutu lub pręta, aby popchnąć go w dół, aby zatkać kolumnę tuż nad kurkiem. nuta: Bawełna musi być stabilna, ale nie pakuj jej zbyt gęsto, ponieważ rozpuszczalnik musi przez nią łatwo przejść. Upewnij się, że kran może się swobodnie obracać bez zaczepiania o wtyczkę.
   • Przymocuj zacisk biurety do stojaka laboratoryjnego i zaciśnij kolumnę pionowo, mając pod nią około 4 cali wolnej przestrzeni. Upewnij się, że kran jest zamknięty.
   • Oznacz zlewkę o pojemności 100 ml jako 'odpad' i umieść ją pod kolumną.
   • Następnie odmierz 1 g piasku w tarowanej łodzi do ważenia i przynieś go z powrotem na stół.
   • Następnie zaznacz kolumnę około 0,5 cm powyżej górnej części bawełnianej zatyczki.
   • Umieść mały lejek w górnej części kolumny i przelej przez niego tyle piasku, aby nad korkiem znajdowała się warstwa o głębokości 0,5 cm. Zapobiegnie to przedostawaniu się żelu krzemionkowego przez korek do twoich frakcji.
   • Wyjmij lejek i delikatnie postukaj w kolumnę, aby równomiernie rozprowadzić piasek.
   • Teraz przygotuj swoje eluenty. Oznacz zlewkę o pojemności 50 ml i cylinder z podziałką o pojemności 50 ml jako "wodę".
   • Odmierz 50 ml wody dejonizowanej za pomocą cylindra z podziałką i wlej ją do zlewki.
   • Następnie oznacz kolejną 50-mililitrową zlewkę i 50-mililitrowy cylinder z podziałką jako 'etanol'. Odmierz 50 ml 95% etanolu i wlej go do tej zlewki.
   • Teraz zdobądź 4 lub 5 czystych pipet Pasteura i bańkę do pipet. Delikatnie odpipetować 7 – 8 ml etanolu wzdłuż wewnętrznych ścianek kolumny. Ta warstwa rozpuszczalnika pozwoli Ci wlać tę zawiesinę żelu krzemionkowego do kolumny bez naruszania piasku.
   • Otwórz kran i spuść ~1 ml etanolu do zlewki na odpady, aby wypłukać powietrze z zaworu odcinającego i upewnić się, że rozpuszczalnik łatwo przepływa przez korek. Upewnij się, że w piasku i korku nie ma suchych plam i delikatnie postukaj w bok kolumny, aby usunąć uwięzione pęcherzyki powietrza.
   • Następnie umieść czysty lejek w górnej części kolumny i oznacz trzecią 50-mililitrową zlewkę 'zawiesina z żelu krzemionkowego w etanolu'.
   • Ostrożnie zważ 5 g proszku z żelu krzemionkowego i wlej go do oznaczonej zlewki.
   • Następnie przynieś żel krzemionkowy, szklany pręt i butlę z podziałką etanolu do okapu dozującego etanol
     .
   • Odmierz 18 ml 95% etanolu i wlej go do zlewki. Mieszaj mieszaninę ze szklaną pałeczką, aż konsystencja będzie spójna i nie pozostaną żadne suche plamy ani grudki proszku. Zwykle zajmuje to ~1 min. Uwaga: Gnojowica powinna być gęsta, jak ciasto, ale nadal powinna łatwo płynąć. Jeśli gnojowica jest zbyt sztywna, może zatkać lejek lub uwięzić pęcherzyki powietrza w kolumnie.
   • Gdy proszek zostanie całkowicie zawieszony w etanolu, przynieś go na swoją ławkę. Mieszaj gnojowicę, aż jej konsystencja znów będzie spójna i natychmiast wlej ją do kolumny.
   • Delikatnie postukaj w boki kolumny, gdy żel krzemionkowy opada, aby pozbyć się pęcherzyków powietrza.
   • Przepłucz zlewkę 1 lub 2 ml etanolu i wlej płukanie do kolumny. Następnie wyjmij lejek i odłóż go na bok.
   • Pipetuj etanol wzdłuż wewnętrznej strony kolumny, aby zmyć cząsteczki przyklejone do ścianek. Następnie spuść rozpuszczalnik, aż menisk znajdzie się ledwo nad górną częścią żelu krzemionkowego.
   • Teraz użyj 5- lub 10-mililitrowego cylindra z podziałką, aby uzyskać około 0,8 ml roztworu zielonego barwnika spożywczego.
   • Użyj czystej pipety, aby delikatnie nanieść 5 do 7 kropli roztworu barwnika równomiernie na wierzch żelu krzemionkowego. W razie potrzeby dodaj kilka kropli etanolu, aby żel krzemionkowy był pokryty.
   • Czekając, aż barwnik wsiąknie, oznacz dwie czyste zlewki o pojemności 50 ml jako 'frakcja etanolowa' i 'frakcja wodna'. Wymienić zlewkę na odpady znajdujące się pod kolumną ze zlewką na frakcję etanolu.
   • Następnie napełnij kolumnę etanolem, pipetując pierwszy ml wzdłuż wewnętrznych ścianek, aby uniknąć naruszenia żelu krzemionkowego.
   • Następnie otwórz częściowo zawór odcinający i reguluj go, aż poziom rozpuszczalnika spadnie ~1 ml co 15 – 20 sekund.
   • Okresowo uzupełniaj kolumnę, aby utrzymać przepływ etanolu. Upewnij się, że przez cały czas nad żelem krzemionkowym znajduje się co najmniej 1 cm rozpuszczalnika.
   • Monitoruj żółte i niebieskie paski, gdy się rozdzielają. nuta: Jeśli musisz się odsunąć, zamknij kurek, aby kolumna nie wyschła, gdy Cię nie będzie. Unikaj zatrzymywania się na dłużej niż 1 minutę na raz, ponieważ pasma złożone zaczną się rozszerzać. Zwykle potrzeba około 20 – 35 minut, aby szybciej rotujący barwnik opuścił kolumnę.
   • Gdy już zbierzesz wszystkie szybciej poruszające się barwniki w zlewce frakcji etanolu, zamknij kurek, odłóż frakcję etanolu na bok i umieść zlewkę na odpady pod kolumną.
   • Opróżnij rozpuszczalnik, aż menisk znajdzie się tuż nad górną częścią żelu krzemionkowego. Następnie wymień zlewkę na odpady na zlewkę z frakcją wodną.
   • Użyj czystej pipety, aby napełnić górną część kolumny wodą dejonizowaną. Następnie otwórz kran na tyle, aby woda przepływała przez kolumnę z szybkością około 1 ml co 15 – 20 s.
   • Uzupełnij kolumnę wodą w razie potrzeby, aż drugi pas koloru całkowicie opuści kolumnę. Zwykle zajmuje to kolejne 15 – 25 minut. Następnie zamknij zawór odcinający i wymień zlewkę z frakcją wodną na zlewkę na odpady.
   • Teraz całkowicie opróżnij kolumnę i pozostaw otwarty kurek.
   • Zapisz kolory frakcji etanolu i wody w swoim notatniku laboratoryjnym.

     Tabela 1: Chromatografia kolumnowa barwnika spożywczego

     	Kolor	Objętość (ml)
     Frakcja etanolowa
     Frakcja wodna

     Kliknij tutaj, aby pobrać tabelę 1
   • Wlej frakcje do odpowiednich cylindrów z podziałką 50 ml i zapisz objętość każdej frakcji. Następnie zamknij kran i doprowadź kolumnę do dygestorium.
   • Zaciśnij kolumnę pionowo w kapturze, aby żel krzemionkowy mógł wyschnąć. Twój instruktor powie Ci, jak wyczyścić kolumnę lub zajmie się nią po laboratorium.
   • Teraz spłucz zebrane frakcje i resztki etanolu, wody i roztworu barwnika do kanalizacji, a resztę szkła wyczyść jak zwykle.
   • Wyrzuć zużyte pipety Pasteura do szklanych odpadów. Wyrzuć zużyte ręczniki papierowe i łódkę do wagi do kosza laboratoryjnego i wyczyść blat stołu przed wyjściem.
2. WynikiRozwiń

   W tym eksperymencie zaobserwowałeś, że etanol wymywał niebieską erioglaucynę w odpowiednim czasie, ale nie był skutecznym eluentem dla żółtej tartrazyny. Chromatografia bibułowa zielonego barwnika daje podobne wyniki. W związku z tym wnioskujemy, że erioglaucyna ma mniejsze powinowactwo do żelu krzemionkowego niż tartrazyna.

   Teraz rozważ zalety użycia dwóch rozpuszczalników do osobnego eluowania barwnika. Woda jest bardziej polarna niż etanol, więc zakładamy, że wymywałaby oba barwniki szybciej niż sam etanol. Chociaż ogólnie zużyłbyś mniej rozpuszczalnika, gdybyś użył tylko wody, separacja byłaby gorsza, co utrudniłoby zbieranie czystych frakcji.

   Alternatywnie, mógłbyś nadal używać etanolu po zebraniu erioglaucyny, ale wymycie tartrazyny w ten sposób zajęłoby dużo czasu i dużo etanolu. Zamiana eluentu na wodę po elucji erioglaucyny zaoszczędziła czas i zminimalizowała straty rozpuszczalnika bez poświęcania czystości.

W tym eksperymencie użyjesz chromatografii kolumnowej, aby oddzielić zielony barwnik spożywczy na jego składniki niebieskie i żółte barwniki, zwane erioglacjucyną i tartrazyną. Po pierwsze, użyjesz 95% etanolu, aby wymyć barwnik o słabszym powinowactwie do żelu krzemionkowego. Następnie spłucz drugi barwnik z kolumny wodą.

Aby odzyskać oczyszczone barwniki, zbierzesz każde pasmo barwnika, gdy opuszcza kolumnę. Te zebrane objętości nazywane są ułamkami. A teraz zacznijmy.

Na początek załóż fartuch laboratoryjny, okulary ochronne i parę rękawiczek nitrylowych. Następnie przynieś dostarczoną kolumnę lub biuretę do centralnego obszaru zaopatrzenia. Weź kawałek waty lub waty szklanej i wciśnij go w górną część kolumny.

Użyj długiego, tępo zakończonego drutu lub pręta, aby popchnąć go w dół, aby zatkać kolumnę tuż nad kurkiem. Bawełna musi być stabilna, ale nie pakuj jej zbyt gęsto, ponieważ rozpuszczalnik musi przez nią łatwo przejść. Upewnij się, że kran może się swobodnie obracać bez zaczepiania o wtyczkę.

Teraz przynieś kolumnę z powrotem do miejsca pracy i przymocuj zacisk biurety do stojaka laboratoryjnego. Clamp kolumnę w pozycji pionowej, mając pod nią około czterech cali wolnej przestrzeni. Upewnij się, że kran jest zamknięty.

Oznacz 100-mililitrową zlewkę jako odpad i umieść ją pod kolumną. Następnie odmierz 1 gram piasku w wytarowanej łodzi do ważenia i przynieś go z powrotem na ławkę. Następnie zaznacz kolumnę około pół centymetra nad górną częścią bawełnianej zatyczki.

Umieść mały lejek w górnej części kolumny i wlej przez lejek tyle piasku, aby nad korkiem znajdowała się warstwa o głębokości pół centymetra. Zapobiegnie to przedostawaniu się żelu krzemionkowego przez korek do twoich frakcji. Wyjmij lejek i delikatnie postukaj w kolumnę, aby równomiernie rozprowadzić piasek.

Teraz przygotujmy twoje eluenty. Oznacz 50-mililitrową zlewkę i 50-mililitrowy cylinder z podziałką jako wodę'Odmierz 50 mililitrów dejonizowanej wody za pomocą cylindra z podziałką i wlej ją do zlewki. Następnie oznacz kolejną 50-mililitrową zlewkę i 50-mililitrowy cylinder z podziałką jako etanol"Odmierz 50 mililitrów 95% etanolu i wlej go do tej zlewki.

Teraz zaopatrz się w cztery lub pięć czystych pipet Pasteura i gruszkę do pipet. Delikatnie odpipetować od siedmiu do ośmiu mililitrów etanolu wzdłuż wewnętrznych ścianek kolumny. Ta warstwa rozpuszczalnika pozwoli Ci wlać tę zawiesinę żelu krzemionkowego do kolumny bez naruszania piasku.

Otwórz kran i spuść około mililitra etanolu do zlewki na odpady, aby wypłukać powietrze z zaworu odcinającego i upewnić się, że rozpuszczalnik łatwo przepływa przez korek. Upewnij się, że w piasku i korku nie ma suchych plam i delikatnie postukaj w bok kolumny, aby usunąć uwięzione pęcherzyki powietrza. Następnie umieść czysty lejek w górnej części kolumny i oznacz trzecią 50-mililitrową zawiesinę żelu krzemionkowego w etanolu'Ostrożnie zważ 5 gramów proszku żelu krzemionkowego i wlej go do oznakowanej zlewki.

Następnie przynieś żel krzemionkowy, szklany pręt i cylinder z podziałką etanolu do okapu dozującego etanol. Odmierz 18 mililitrów 95% etanolu i wlej go do zlewki. Mieszaj mieszaninę ze szklaną pałeczką, aż konsystencja będzie spójna i nie pozostaną żadne suche plamy ani grudki proszku.

Zwykle zajmuje to około minuty. Gnojowica powinna być gęsta, jak ciasto, ale nadal powinna łatwo płynąć. Jeśli gnojowica jest zbyt sztywna, może zatkać lejek lub uwięzić pęcherzyki powietrza w kolumnie.

Gdy proszek zostanie całkowicie zawieszony w etanolu, przynieś go na swoją ławkę. Mieszaj gnojowicę, aż jej konsystencja znów będzie spójna i natychmiast wlej ją do kolumny. Delikatnie postukaj w boki kolumny, gdy żel krzemionkowy osiada, aby pozbyć się pęcherzyków powietrza.

Przepłukać zlewkę 1 lub 2 mililitrami etanolu. Wlej płukanie do kolumny, a następnie wyjmij lejek i odłóż go na bok. Pipetować etanol wzdłuż wewnętrznej strony kolumny, aby zmyć cząstki przyklejone do ścianek.

Następnie spuść rozpuszczalnik, aż menisk znajdzie się ledwo nad górną częścią żelu krzemionkowego. Teraz użyj 5- lub 10-mililitrowego cylindra z podziałką, aby uzyskać około 0,8 mililitra roztworu zielonego barwnika spożywczego. Użyj czystej pipety, aby delikatnie nanieść 5 do 7 kropli roztworu barwnika równomiernie na wierzch żelu krzemionkowego.

W razie potrzeby dodaj kilka kropli etanolu, aby żel krzemionkowy był pokryty. Czekając, aż barwnik wsiąknie, oznacz dwie czyste 50-mililitrowe zlewki jako frakcję etanolu"i frakcję wodną"Wymień zlewkę na odpady pod kolumną ze zlewką do frakcji etanolu. Następnie napełnij kolumnę etanolem, pipetując pierwszy mililitr wzdłuż wewnętrznych ścianek, aby uniknąć naruszenia żelu krzemionkowego.

Następnie otwórz częściowo kran i wyreguluj go, aż poziom rozpuszczalnika spadnie o około 1 mililitr co 15 do 20 sekund. Okresowo napełniaj kolumnę, aby utrzymać przepływ etanolu. Upewnij się, że przez cały czas nad żelem krzemionkowym znajduje się co najmniej centymetr rozpuszczalnika.

Monitoruj żółte i niebieskie paski, gdy się rozdzielają. Jeśli musisz się odsunąć, zamknij kurek, aby kolumna nie wyschła, gdy Cię nie będzie. Unikaj zatrzymywania się na dłużej niż minutę na raz, ponieważ pasma złożone zaczną się rozszerzać.

Zwykle potrzeba około 20 do 35 minut, aby szybciej poruszający się barwnik opuścił kolumnę. Po zebraniu całego szybciej poruszającego się barwnika w zlewce frakcji etanolu zamknij zegar zatrzymania, odłóż frakcję etanolu na bok i umieść zlewkę odpadową pod kolumną. Odcedź rozpuszczalnik, aż menisk znajdzie się tuż nad górną częścią żelu krzemionkowego.

Następnie wymień zlewkę na odpady na zlewkę z frakcją wodną. Użyj czystej pipety, aby napełnić górną część kolumny wodą dejonizowaną. Następnie otwórz kran na tyle, aby woda przepływała przez kolumnę z szybkością około 1 mililitra co 15 do 20 sekund.

W razie potrzeby napełnij kolumnę wodą, aż drugie pasmo koloru całkowicie opuści kolumnę. Zwykle zajmuje to kolejne 15 do 25 minut. Następnie zamknij zawór odcinający i wymień zlewkę z frakcją wodną na zlewkę na odpady.

Teraz całkowicie opróżnij kolumnę i pozostaw otwarty kran. Zapisz kolory frakcji etanolu i wody w notatniku laboratoryjnym. Wlej frakcje do odpowiednich 50-mililitrowych cylindrów z podziałką i zapisz objętość każdej frakcji.

Następnie zamknij kran i doprowadź kolumnę do dygestorium. Clamp kolumnę pionowo w okapie, aby żel krzemionkowy mógł wyschnąć. Twój instruktor powie Ci, jak wyczyścić kolumnę lub zajmie się nią po laboratorium.

Teraz spłucz zebrane frakcje i resztki etanolu, wody i roztworu barwnika do odpływu i wyczyść resztę szkła jak zwykle. Wyrzuć zużyte pipety Pasteura do odpadów szklanych. Wyrzuć zużyte ręczniki papierowe i łódkę do wagi do kosza laboratoryjnego i wyczyść blat stołu przed wyjściem.

W tym eksperymencie zaobserwowałeś, że etanol wymywał niebieską erioglaucynę w odpowiednim czasie, ale nie był skutecznym eluentem dla żółtej tartrazyny. Chromatografia bibułowa zielonego barwnika daje podobne wyniki. W związku z tym wnioskujemy, że erioglaucyna ma mniejsze powinowactwo do żelu krzemionkowego niż tartrazyna.

Zastanówmy się teraz nad zaletami stosowania dwóch rozpuszczalników do osobnego eluowania barwnika. Woda jest bardziej polarna niż etanol, więc zakładamy, że wymywałaby oba barwniki szybciej niż sam etanol. Chociaż ogólnie zużyłbyś mniej rozpuszczalnika, gdybyś użył tylko wody, separacja byłaby gorsza, co utrudniłoby zbieranie czystych frakcji.

Alternatywnie, mógłbyś nadal używać etanolu po zebraniu erioglaucyny, ale wymycie tartrazyny w ten sposób zajęłoby dużo czasu i dużo etanolu. Zamiana eluentu na wodę po elucji erioglaucyny zaoszczędziła czas i zminimalizowała straty rozpuszczalnika bez poświęcania czystości.