Artykuł metodologiczny

Protokół niepromiennej hybrydyzacji in situ stosowalny dla świerka pospolitego i szeregu gatunków roślin

21.8K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/1205

⸱

17 kwietnia 2009

 ,  ,  ,  , 
1Department of Evolutionary Functional Genomics, Evolutionary Biology Center, Uppsala University, 2Department of Plant Biology and Forest Genetics, Uppsala BioCenter, Swedish University of Agricultural Sciences

W tym artykule

Podsumowanie

Opisujemy zmodyfikowany protokół hybrydyzacji in situ z użyciem DIG, który jest szybki i możliwy do zastosowania u szerokiego zakresu gatunków roślin, w tym u świerka pospolitego. Dzięki kilku korektom, obejmującym m.in. zmienioną obróbkę RNazą oraz stężenie proteinazy K, protokół ten może być wykorzystywany w badaniach różnych tkanek i gatunków.

Streszczenie

Dostępne obecnie technologie wysokoprzepustowej analizy ekspresji dostarczają naukowcom ogromnej ilości profili ekspresji, jednak ich rozdzielczość w zakresie ekspresji specyficznej dla tkanek jest ograniczona ze względu na problemy z preparatyką poszczególnych tkanek. Dane o ekspresji muszą być potwierdzone i uzupełnione o wzorce ekspresji przy użyciu np. hybrydyzacji in situ, techniki stosowanej do lokalizacji specyficznej dla komórek ekspresji mRNA. Metoda hybrydyzacji in situ jest żmudna, czasochłonna i często wymaga rozległej optymalizacji w zależności od gatunku i tkanki. Eksperymenty in situ są stosunkowo trudniejsze do przeprowadzenia u gatunków drzewiastych, takich jak iglasty świerk pospolity (Picea abies). Przedstawiamy tutaj zmodyfikowany protokół hybrydyzacji DIG in situ, który jest szybki i możliwy do zastosowania u szerokiego zakresu gatunków roślin, w tym P. abies. Dzięki zaledwie kilku korektom, w tym zmienionej obróbce RNazą i stężeniu proteinazy K, mogliśmy zastosować ten protokół do badania ekspresji specyficznej dla tkanek homologicznych genów w męskich organach rozrodczych jednego gatunku gymnospermy i dwóch gatunków angiosperm: P. abies, Arabidopsis thaliana oraz Brassica napus. Protokół działał równie skutecznie dla wszystkich badanych gatunków i genów. AtAP3 oraz BnAP3 zaobserwowano w organach kwiatowych drugiego i trzeciego kręgu u A. thaliana i B. napus, a DAL13 w mikrosporofylach męskich szyszek P. abies. W przypadku P. abies stężenie proteinazy K, stosowanej do permeabilizacji tkanek, musiało zostać zwiększone do 3 g/ml zamiast 1 g/ml, prawdopodobnie ze względu na bardziej zwarte tkanki oraz wyższe poziomy związków fenolowych i polisacharydów. Dla wszystkich gatunków zrezygnowano z obróbki RNazą z powodu zmniejszenia natężenia sygnału bez odpowiadniego wzrostu specyficzności. Porównując wzorce ekspresji specyficznej dla tkanek homologicznych genów zarówno roślin kwiatowych, jak i drzewa iglastego, wykazujemy, że przedstawiony tutaj protokół DIG in situ, przy jedynie niewielkich korektach, może być stosowany u szerokiego zakresu gatunków roślin. Tym samym protokół pozwala uniknąć zarówno rozległej optymalizacji specyficznej dla gatunku, jak i żmudnego wykorzystania sond znakowanych radioaktywnie na rzecz sond znakowanych DIG. W naszym filmie zdecydowaliśmy się zilustrować technicznie wymagające kroki protokołu.

Anna Karlgren i Jenny Carlsson wniosły równy wkład w to badanie.

Autorzy korespondenccyjni: Anna Karlgren pod adresem Anna.Karlgren@ebc.uu.se oraz Jens F. Sundström pod adresem Jens.Sundstrom@vbsg.slu.se

Protokół

Niniejszy protokół niepromiennej hybrydyzacji in situ mRNA został zoptymalizowany dla tkanek świerka pospolitego i opisano go szczegółowo. Opiera się on na protokole hybrydyzacji in situ dla Arabidopsis/rzepaku, który został zoptymalizowany w naszych grupach, a z kolei bazuje na protokołach z laboratoriów Meyerowitza i Irish, zoptymalizowanych m.in. przez Vivian Irish, Cindy Lincoln i Jeffa Longa 1-4.

PROCEDURA

1. FIKSACJA I ZATOPIENIE

Aby zapewnić retencję RNA, tkanki muszą zostać utrwalone i zatopione w wosku przed przeprowadzeniem eksperymentu in situ. Utrwalanie i zatapianie są krytycznymi etapami, ponieważ słabo utrwalone materiały mogą dawać niski lub niewykrywalny sygnał, nawet jeśli mRNA występuje w dużym obfitości. Tkanki są odwadniane, przejrzystowane i zatapiane w wosku poprzez stopniowe zmiany, aby uniknąć uszkodzenia tkanek. Aby dodatkowo zapobiec kurczeniu się i pęcznieniu komórek, do pierwszych etapów odwadniania tkanek świerka pospolitego w etanolu dodaje się 0,85% NaCl. Można pominąć dodatek NaCl do etanolu (np. jest on pomijany w protokole dla Arabidopsis/rzepaku). Etap odwadniania podczas zatapiania można przeprowadzać na lodzie lub w temperaturze +4°C, aby zminimalizować aktywność RNazy. W niniejszym protokole roztwór utrwalający zawierający 4% paraformaldehydu zawiera również 0,25% glutaraldehydu, co ma zapewnić lepszą retencję RNA, mimo że niektórzy twierdzą, iż prawdopodobnie nie ma to znaczenia (np. jest on pomijany w protokole dla Arabidopsis/rzepaku). Najprawdopodobniej można zastosować dowolny standardowy protokół utrwalania i zatapiania. Jak pokazano poniżej, zatapianie świerka pospolitego różni się nieznacznie od protokołu dla Arabidopsis/rzepaku.

1.1 Dzień 1 Pobieranie materiału roślinnego i fiksacja paraformaldehydem

  1. Zebrać interesujący materiał roślinny i w razie potrzeby go rozdzielić. Przechowywać tkanki w lodzie i umieścić je bezpośrednio lub tak szybko, jak to możliwe, w lodowatym roztworze utrwalającym (patrz przepisy poniżej). Uwaga! Przez cały czas przechowywać w lodzie!
  2. Poddać próbki działaniu próżni, aż paraformaldehyd zacznie bąbelkować. Utrzymywać próżnię do trzech godzin (np. 2 x 15 min dla tkanek kwiatowych Arabidopsis i rzepaku lub jedną godzinę dla szyszek męskich świerka pospolitego), a następnie powoli zwolnić próżnię. Po infiltracji utrwalacza metodą próżniową tkanki powinny zatonąć, jednak w przypadku niektórych tkanek zawierających dużo powietrza nie jest to możliwe (np. kwiaty Arabidopsis). Aby utrzymać tkanki w utrwalaczu, można użyć kawałka gazy.
  3. Wymienić utrwalacz i inkubować w temperaturze +4°C przez noc (~12-16 godzin) przy łagodnym wstrząsaniu.

Opcja 1

Uwaga! Wersja z zatapianiem świerka pospolitego znajduje się poniżej (kroki 4-8). Należy upewnić się, że w kroku 5 zastosowano probówki do scyntylacji lub fiolki szklane.

1.2 Dzień 2: Dehydratacja Uwaga! Wersja do zatapiania świerka pospolitego.

  1. 0.85% NaCl30 minna lodzie
    50% EtOH + 0.85% NaCl90 minna lodzie
    70% EtOH + 0.85% NaCl90 minna lodzie
    Przerwa! Na tym etapie można zatrzymać proces i przechowywać tkanki w 70% EtOH + 0.85% NaCl w temperaturze +4°C przez kilka miesięcy.
    85% EtOH + 0.85% NaCl90 min+4°C
    95% EtOH (+ eozyna)90 min+4°C
    Uwaga! Eozynę dodaje się w celu zabarwienia tkanek na różowo, co ułatwia ich lokalizację podczas zatapiania i krojenia, jednak można z niej zrezygnować.
    100% EtOH (+ eozyna)90 min+4°C
    100% EtOH (+ eozyna)na noc+4°C

1.3 Dzień 3: Dehydratacja i zatapianie Uwaga! Wersja dla świerka pospolitego.

  1. 100 % EtOH (+ eozyna)2 htemperatura pokojowa
    50% EtOH + 50% Histoclear II1 htemperatura pokojowa
    100% Histoclear II1 htemperatura pokojowa
    100% Histoclear II1 htemperatura pokojowa
    50% Histoclear II + 50% Histowaxcałą noc+40-50°C
    Uwaga! W ostatnim kroku stężenie Histowax nie jest kluczowe, wystarczy wsypać kilka granulek wosku.

1.4 Dzień 4: Zawieranie w medium Uwaga! Wersja dla świerka pospolitego.

  1. 100 % roztopionego Histowax+60°C(Wymieniać rano i wieczorem)

1.5 Dzień 5: Osadzanie w medium Uwaga! Wersja dla świerka pospolitego.

  1. 100 % roztopionego Histowax+60°C(Wymieniać rano i wieczorem)

1.6 Dzień 6: Osadzanie w medium Uwaga! Wersja dla świerka pospolitego.

  1. 100 % roztopionego Histowax+60°C(Wymiana rano i wieczorem)
    Uwaga! Dopuszczalna jest okazjonalna wymiana wosku raz dziennie, jednak w takim przypadku wykonanie jednego dnia cyklu wymian zajmuje dwa dni. Wymiana wosku może być bez problemu kontynuowana przez dwa dodatkowe dni. Jest to zalecane w przypadku dużych próbek, ponieważ ułatwia infiltrację wosku do centrum tych tkanek.

Opcja 2

Uwaga! Poniżej znajduje się wersja dotycząca zatapiania Arabidopsis/rzepaku (kroki 4-8).

1.2 Dzień 2 Odwodnienie Uwaga! Wersja do zatapiania Arabidopsis/rzepaku.

  1. Uwaga! Wszystkie etapy należy przeprowadzać w temperaturze +4°C przy delikatnym wstrząsaniu, chyba że wskazano inaczej.
    1x PBS30 min
    1x PBS30 min
    30% EtOH60 min
    40% EtOH60 min
    50% EtOH60 min
    60% EtOH60 min
    70% EtOH60 min
    Przerwa! Na tym etapie można zatrzymać proces i przechowywać tkanki w 70% EtOH w temperaturze +4°C przez kilka miesięcy.
    85% EtOH60 min
    95% EtOH (+ eozyna)całą noc
    Uwaga! Eozynę dodaje się w celu zabarwienia tkanek na różowo, co ułatwia ich lokalizację podczas zatapiania i krojenia, jednak można z niej zrezygnować.

1.3 Dzień 3: Odwodnienie i zatapianie Uwaga! Wersja zatapiania dla Arabidopsis/rzepaku.

  1. Uwaga! Wszystkie etapy należy przeprowadzać w temperaturze pokojowej przy delikatnym wstrząsaniu, chyba że wskazano inaczej.
    100% EtOH (+ eozyna)30 min
    100% EtOH (+ eozyna)30 min
    100% EtOH (+ eozyna)60 min
    100% EtOH (+ eozyna)60 min
    Uwaga! Przenieść tkankę do fiolek scyntylacyjnych lub innych fiolek (szklanych).
    75% EtOH + 25% Histoclear II30 min
    50% EtOH + 50% Histoclear II30 min
    25% EtOH + 75% Histoclear II30 min
    100% Histoclear II60 min
    100% Histoclear II60 min
    100% Histoclear II + ¼ objętości granulek Histowaxcałą noc (bez wstrząsania)
    Uwaga! W ostatnim kroku stężenie Histowax nie jest kluczowe, wystarczy wsypać kilka granulek wosku.

1.4 Osadzanie w dniu 4. Uwaga! Wersja osadzania dla Arabidopsis/rzepaku.

  1. Umieścić probówki z tkankami w temperaturze +42°C aż do całkowitego stopienia granulek wosku. Następnie dodać ¼ objętości granulek wosku i pozwolić im całkowicie się stopić. Przenieść próbki do temperatury +60°C i pozostawić w probówkach przez kilka godzin. Na koniec zastąpić mieszaninę wosku/Histoclear II świeżo stopionym woskiem i inkubować przez noc w temperaturze +60°C.

1.5 Dzień 5 Osadzanie w medium Uwaga! Wersja osadzania dla Arabidopsis/rzepaku.

  1. 100% roztopiony Histowax+60°C(Zmieniać rano i wieczorem)

1.6 Osadzanie w dniu 6. Uwaga! Wersja osadzania dla Arabidopsis/rzepaku.

  1. 100 % roztopionego Histowax+60°C(Wymiana rano i wieczorem)
    Uwaga! W protokole dla Arabidopsis/rzepaku (w porównaniu z protokołem dla świerka pospolitego) w dniu 7. następuje zatapianie w ten sam sposób, co w dniach 5-6, tj. 100 % roztopionego Histowax w +60°C z wymianą rano i wieczorem
    Uwaga! Dopuszczalne jest okazjonalne zmienianie wosku raz dziennie, jednak w takim przypadku jeden dzień wymian zajmuje dwa dni kalendarzowe. Wymiana wosku może być również kontynuowana przez dwa dodatkowe dni bez żadnych problemów. Jest to zalecane w przypadku dużych próbek, ponieważ ułatwia infiltrację wosku do wnętrza tych tkanek.

1.7 Osadzanie w 7. dniu (dzień 8 w protokole dla Arabidopsis/rzepaku) (Film! Szczegóły techniczne przedstawiono w filmie)

  1. Podgrzej szalki Petriego i/lub formy do +60°C. Włącz płytkę grzejną (+60°C) i upewnij się, że dostępny jest roztopiony Histowax.
  2. Przelej tkanki i roztopiony Histowax do szalki Petriego (lub formy) umieszczonej na płytce grzejnej. Dodaj więcej Histowaxu, aby tkanki zostały całkowicie przykryte. Rozgrzej pęsetę i równomiernie rozmieść tkanki w szalce. Wypełnij szalkę Petriego (lub formę). Jeśli wosk stwardnieje, zanim tkanki znajdą się w odpowiedniej pozycji, podgrzej go ponownie lub usuń stwardniały wosk za pomocą rozgrzanej pęsety.
  3. Pozostaw blok wosku do stwardnienia w temperaturze pokojowej przed umieszczeniem go w +4°C. Lepiej przygotować kilka bloków woskowych zamiast zbyt ciasno osadzać tkanki, ponieważ blok woskowy może pęknąć podczas wycinania fragmentów w trakcie sekcjonowania.
    Przerwa! Przechowywać w +4°C. Tkanki są stabilne przez lata.
    Uwaga! Od tego kroku i dalej pracować w warunkach wolnych od RNaz. Stosować rękawiczki, wodę MilliQ traktowaną DEPC, bufory, szkło laboratoryjne itp., autoklawować bufory i wypalać szkło laboratoryjne itp., gdy jest to odpowiednie.

2. KROJENIE ( Film! Szczegóły techniczne zostały przedstawione w filmie)

  1. Włączyć dwie płyty grzejne (+60°C i +42°C) i upewnić się, że dostępny jest roztopiony Histowax.
  2. Rozgrzać skalpel i ostrożnie wyciąć blok woskowy z tkanką z szalki Petriego (może on pęknąć przy zbyt gwałtownym działaniu) lub wyjąć go z formy. Po oddzieleniu pojedynczego bloku woskowego, nadać mu odpowiedni rozmiar i kształt, aby ułatwić krojenie w mikrotomie.
  3. Fragment wosku powinien mieć dodatkowy woskowy „piętowy” wspornik pod tkanką, aby można go było przymocować do uchwytu bloku. Rozgrzać uchwyt bloku oraz wspornik na płycie grzejnej (+60°C) i stopić je ze sobą. Może być konieczne nałożenie kropli Histowax II, aby połączenie było stabilne. Pozostawić do stwardnienia w temperaturze +4°C.
  4. Za pomocą mikrotomu wykonać skrawki o grubości 6-8 μm z bloku woskowego, połączone w długą wstęgę.
    Uwaga! Będzie to łatwiejsze, jeśli blok woskowy będzie zimny, tzn. należy przechowywać blok woskowy w temperaturze +4°C i wyjąć go z lodówki bezpośrednio przed rozpoczęciem krojenia. Korzystne może być również utrzymywanie noża w niskiej temperaturze.
  5. Obejrzeć wstęgi skrawków pod lupą i zaznaczyć te, które zostaną wykorzystane.
  6. Nanieść wodę MilliQ wolną od RNaz na szkiełka (Probe-On Plus od Fisher Biotechnology, które są wstępnie oczyszczone i naładowane). Podzielić wstęgę na mniejsze fragmenty i położyć je (stroną „plecami” lub „błyszczącą” do dołu) na szkiełkach. Szkiełka z wstęgami należy umieścić na płycie o temperaturze +42°C. Wstęga powinna rozprostować się w wodzie (jest to ważne!). Pozostawić skrawki na kilka minut, a następnie za pomocą chusteczki Kimwipe/papierowej osuszyć nadmiar wody.
  7. Pozostawić szkiełka na płycie na 1-2 godziny.
  8. Inkubować szkiełka w temperaturze +42°C przez noc, aby tkanki przylgnęły do szkiełek.
    Przerwa! Zaleca się użycie skrawków jak najszybciej, jednak mogą być one przechowywane na sucho w zamkniętych pudełkach z osuszaczem do kilku dni w temperaturze +4°C.

3. PRZYGOTOWANIE SOND

In situ hybridization wykrywa ekspresję przy użyciu znakowanej sondy specyficznej dla danego mRNA. Sonda, która najczęściej jest fragmentem komplementarnego RNA, może być znakowana digoksigeniną, DIG. DIG jest małą cząsteczką, którą można przyłączyć do urydyny, a tym samym włączyć do sondy RNA, a następnie wykryć za pomocą przeciwciał specyficznych dla DIG.

Projektowanie i przygotowanie sondy jest najważniejszym etapem eksperymentu hybrydyzacji RNAin situ. Należy zadbać o to, aby sonda charakteryzowała się wysoką swoistością i była znakowana wysokiej jakości UTP. W przypadku niektórych sond konieczne może być dostosowanie temperatury hybrydyzacji i/lub czasu trwania reakcji. Jak zawsze, należy zachować szczególną ostrożność, aby uniknąć kontaminacji RNazą.

Przed znakowaniem wyizoluj matrycę zgodnie ze standardowymi protokołami, używając np. klonów cDNA lub fragmentów PCR, a następnie zlinearyzuj matrycę. Fragmenty sensowne i antysensowne są izolowane i amplifikowane z matrycy przy użyciu starterów specyficznych dla genu. W przypadku fragmentów amplifikowanych metodą PCR nie należy używać enzymów generujących nawisowe końce 3'. Do wszystkich fragmentów dodaje się nawis T7 (lub SP6 lub T3), wykorzystując startery zawierające sekwencję T7 lub wektor z promotorem T7.

Sonda sensowna (mRNA lub nić (-)) posiada taką samą sekwencję jak docelowe mRNA i nie będzie hybrydyzować z docelowym mRNA, natomiast sonda antysensowna (anty-mRNA lub nić (+)) posiada sekwencję komplementarną, a zatem hybrydyzuje z celem, dając poszukiwany sygnał. Sonda sensowna jest wykorzystywana jako kontrola negatywna i w przypadku prawidłowego przebiegu eksperymentu żaden sygnał nie zostanie uzyskany. Niezbędna jest również kontrola pozytywna, np. sonda wykrywająca gen konstytutywny (house-keeping gene). Większość szkiełek powinna zostać poddana hybrydyzacji z sondami antysensownymi, natomiast tylko kilka szkiełek powinno zostać zhybrydyzowanych z różnymi sondami kontrolnymi.

3.1 Znakowanie sond za pomocą transkrypcji In vitro

Do znakowania sond wykorzystuje się odczynniki z zestawu DIG RNA Labeling Kit (SP6/T7; 11175025910, Roche Applied Science, Mannheim, Niemcy) lub odpowiednika. Opisana tutaj reakcja w objętości 20 μl powinna przynieść ~10 μg RNA znakowanego DIG.

  1. Przeprowadź transkrypcję in vitro w celu wbudowania znakowanych nukleotydów. Do probówki dodaj następujące odczynniki (przechowywać w lodzie):
    Składnikobjętość/ilość
    10 x NTP labeling mixture2 μl
    10 x Transcription buffer2 μl
    Protector RNase inhibitor1 μl (20U)
    RNA T7 polymerase (SP6 or T3)2 μl
    Matryca DNA (500-1000 ng)x μl
    Woda MilliQ wolna od RNazy μl, do końcowej objętości 18 μl
  2. Wymieszaj mieszaninę znakującą NTP, bufor do transkrypcji, inhibitor RNazy ( Uwaga! jeśli sonda jest krótka, np. <500bp, można zwiększyć stężenie inhibitora RNazy do 40U), polimerazę, matrycę DNA oraz wodę, a następnie krótko odwiruj.
  3. Inkubuj mieszaninę reakcyjną w temperaturze +37°C przez 2 godziny ( Uwaga! jeśli sonda jest krótka, np. <500bp, wydłuż czas reakcji do 4-6 godzin).
  4. Dodaj 2 μl DNazy I i inkubuj w +37°C przez 15 min.
  5. Zatrzymaj reakcję, dodając 2 μl 0,2 M EDTA (pH 8.0). Sprawdź produkt na żelu.
  6. Wytrąć sondę, dodając 2,5 μl 4 M LiCl i 75 μl >99,5% etanolu. Wymieszaj dokładnie i inkubuj w -20°C przez noc ( Uwaga! Nie używaj tRNA jako nośnika. Zamiast tego użyj glikogenu lub akryloamidu zgodnie z zaleceniami producentów).
  7. Wiruj (13 000 rpm) przez 30 minut w +4°C i usuń nadsącz. Przemyj osad (przez co najmniej 10 min przy 13 000 rpm) dwukrotnie w 70% etanolu (~150-300 μl).
  8. Usuń nadsącz i pozostaw osad do wyschnięcia. Resuspenduj sondę w 30 μl wody wolnej od RNaz na 1-2 godziny w lodzie.
    Przerwa! Sondę można przechowywać w -20°C przez ponad rok.
    Uwaga! Pobierz próbki o objętości 0,5 μl z kroku 21 (przed transkrypcją in vitro), kroku 23 (przed traktowaniem DNazą), kroku 24 (po traktowaniu DNazą, ale przed wytrącaniem) oraz próbkę 1 μl z kroku 27 (po resuspendowaniu sondy). Rozdziel próbki na niedenaturującym żelu TBE 1%. Jeśli reakcja z DNazą przebiegła prawidłowo, prążek matrycy powinien zniknąć. Transkrypcja in vitro powinna przynieść intensywny prążek RNA o odpowiedniej wielkości. Jeśli widoczne są liczne prążki, zdenaturuj próbki w +80°C przez 5 minut, a następnie schłodź je w lodzie przed nałożeniem. Jeśli odzysk z kroku 27 jest słaby, może to wynikać z niewystarczającej resuspendacji sondy. Inkubuj RNA w +55°C przez 5-10 minut, aby doprowadzić do jego rozpuszczenia.

3.2 Hydroliza długich sond

Uwaga! Jeśli sonda jest dłuższa niż 150 bp, należy ją skrócić do 50-150 bp w celu uzyskania silnego sygnału dzięki lepszej penetracji. Sonda może ulec degradacji chemicznej w buforze węglanowym (pH 10.2). Jeśli sonda ma odpowiednią wielkość, należy pominąć etap hydrolizy, pamiętając jednak o dodaniu jednej objętości formamidyny, tj. 30 μl, do sondy.

  1. Przygotować 0,2 M wodorowęglan sodu (NaHCO3) oraz 0,2 M węglan sodu (Na2CO3). Oba roztwory powinny być świeżo przygotowane.
  2. Przetestować oba bufory, mieszając 5 ml H2O, 2 ml 0,2 M NaHCO3 oraz 3 ml 0,2 M Na2CO3. Wartość pH powinna wynosić ~10,2.
  3. Obliczyć czas inkubacji:
    Czas inkubacji (w minutach) = (L0-Lf) / (K*L0*Lf)
    L0 = długość początkowa sondy w kb
    Lf = długość końcowa sondy w kb = np. 0,100 kb
    K = stała szybkości hydrolizy = 0,11 kb-1min-1
  4. Zhydrolizować połowę sondy, a resztę zachować na później. Rozcieńczyć sondę do 50 μl wodą wolną od RNaz, a następnie dodać 20 μl 0,2 M NaHCO3 (dodać w pierwszej kolejności) i 30 μl 0,2 M Na2CO3. Wymieszać i inkubować w temperaturze +60°C przez obliczony czas inkubacji.
  5. Zatrzymać reakcję poprzez dodanie 10 μl 1 M NaOAc pH 4,7.
  6. Wytrącić sondę, dodając 10 μl 4 M LiCl2 oraz 300 μl etanolu (Uwaga! W razie potrzeby użyć glikogenu lub akryloamidu jako nośnika). Inkubować w temperaturze -20°C przez noc.
  7. Wirować (13 000 rpm) przez 30 minut w temperaturze +4°C i usunąć nadsącz. Przemyć osad dwukrotnie w 70% etanolu (~300 μl). Wirować (13 000 rpm) przez co najmniej 10 min podczas każdego przemywania w temperaturze +4°C.
  8. Usunąć nadsącz i pozostawić osad do wyschnięcia. Resuspender sondę w 30 μl wody MilliQ wolnej od RNaz. Dodać do sondy jedną objętość formamidyny, tj. 30 μl.
    Przerwa! Sondę można przechowywać w temperaturze -20°C przez ponad rok.
    Uwaga! Pobrać 2 μl sondy niezhydrolizowanej oraz 2 μl sondy zhydrolizowanej (przed dodaniem formamidyny) i sprawdzić je na niedenaturującym żelu TBE 1%. Między obiema próbkami powinna wystąpić różnica w wielkości. Przed nałożeniem sondy może być konieczna denaturacja w temperaturze +80°C przez 5 minut, a następnie szybkie schłodzenie na lodzie.

4. HYBRYDYZACJA IN SITU ( Film! Szczegóły techniczne zostały przedstawione w filmie)

Należy upewnić się, że wszystkie roztwory są wolne od RNaz! Nie jest konieczne traktowanie wszystkiego DEPC, jednak należy używać co najmniej autoklawowanej wody MilliQ. Należy upewnić się, że całe szkło laboratoryjne zostało wygrzane w temperaturze +200°C przez noc lub przez co najmniej 5 godzin. Pojemniki plastikowe oraz magnesy do mieszania należy potraktować 0.1 M NaOH z mieszaniem przez noc. Pojemniki plastikowe należy kilkakrotnie wypłukać autoklawowaną wodą MilliQ (~500 ml/pojemnik). Kluczowe jest dokładne wypłukanie pojemników, aby uniknąć śladów NaOH, które mogłyby zakłócić hybrydyzację. Wszystkie roztwory stokowe, z wyjątkiem buforów Tris, należy potraktować DEPC. Przed rozpoczęciem eksperymentu należy sprawdzić wszystkie roztwory i pozostałe materiały, aby upewnić się, że wszystko jest dostępne. Do kroku 61 (z wyjątkiem kroków 51-52) szkiełka przechowujemy w statywie, który można łatwo przenosić między pojemnikami.

4.1 Obróbka wstępna skrawków In situ

  1. Deparafinizacja/odwodnienie skrawków:
    2x 10 min Histoclear II (używać naczyń szklanych)
    2x 1-2 min 100% EtOH
    1-2 min 95% EtOH
    1-2 min 90% EtOH
    1-2 min 80% EtOH
    1-2 min 60% EtOH
    1-2 min 30% EtOH
    1-2 min H2O
  2. Przemywać preparaty przez 15-20 min w 2x SSC w temperaturze pokojowej ( Uwaga! Podczas inkubacji przygotować paraformaldehyd używany w kroku 42).
  3. Traktować tkanki przez 30 min proteinazą K w temperaturze +37°C przy łagodnym mieszaniu (np. 1 μg/ml dla Arabidopsis/rzepaku i 3 μg/ml dla świerka pospolitego). Wymieszać i podgrzać do +37°C 100 mM Tris pH 8 oraz 50 mM EDTA. Proteinazę K dodać bezpośrednio przed traktowaniem preparatów. Uwaga! Traktowanie proteinazą K musi zostać zoptymalizowane w zależności od tkanki, gatunku rośliny i wieku. (Uwaga! Podczas inkubacji przygotować trietanolaminę używaną w kroku 45).
  4. Traktować preparaty przez 2 min 2mg/ml glicyny w 1x PBS w temperaturze pokojowej. ( Uwaga! Glicynę wymieszać z PBS dzień przed użyciem, aby upewnić się, że glicyna jest całkowicie rozpuszczona).
  5. Przemywać preparaty przez 2 minuty w 1x PBS w temperaturze pokojowej.
  6. Przemywać preparaty przez 2 minuty w 1x PBS w temperaturze pokojowej.
  7. Inkubować preparaty przez 10 minut z 4% (w/v) paraformaldehydem (świeżo przygotowanym) w 1x PBS pH 7 w temperaturze pokojowej. Używać naczynia szklanego.
  8. Przemywać preparaty przez 5 minut w 1x PBS w temperaturze pokojowej.
  9. Przemywać preparaty przez 5 minut w 1x PBS w temperaturze pokojowej. (Dodać bezwodnik octowy do roztworu w kroku 45).
  10. Inkubować preparaty przez 10 minut w 0,1M trietanolaminie (świeżo przygotowanej, pH 8) i bezwodniku octowym w temperaturze pokojowej.
  11. Przemywać preparaty przez 5 minut w 1x PBS w temperaturze pokojowej.
  12. Przemywać preparaty przez 5 minut w 1x PBS w temperaturze pokojowej.
  13. Odwodnienie:
    30 sek 30% EtOH
    30 sek 60% EtOH
    30 sek 80% EtOH
    30 sek 90% EtOH
    30 sek 95% EtOH
    2x 30 sek 100% EtOH
    Przerwa! Na tym etapie można przerwać pracę i przechowywać preparaty w pojemniku z niewielką ilością EtOH na dnie w temperaturze +4°C przez kilka godzin.

4.2 Hybrydyzacja in situ ( Film! Szczegóły techniczne przedstawiono w filmie)

Należy zdecydować, które szkiełka wykorzystać z odpowiednimi sondami, pamiętając o zastosowaniu sond sensu i antysensu oraz kontroli pozytywnej. (Uwaga! Szkiełka ProbeOn Plus od Fisher Biotechnology posiadają biały matowy nalot, który umożliwia ich łączenie w pary podczas etapów hybrydyzacji i detekcji w protokole.) Ta sama sonda o tym samym stężeniu powinna być stosowana do konkretnej pary szkiełek. Należy określić ilość roztworu do hybrydyzacji na podstawie całkowitej liczby par szkiełek. Siarczan dekstranu należy wstępnie podgrzać do +60°C. Ze względu na zawartość siarczanu dekstranu roztwór do hybrydyzacji jest bardzo lepki. Umieszczenie go w temperaturze +60°C ułatwi jego dozowanie. Przed naniesieniem sondy szkiełka należy wysuszyć na czystych ręcznikach papierowych lub chusteczkach Kimwipe. Szkiełka muszą być całkowicie suche. Do każdej pary szkiełek należy dodać sondę. Przed przeprowadzeniem właściwego eksperymentu ważne jest przetestowanie różnych stężeń sondy (np. 0,5, 2 i 4 μl) w celu znalezienia stężenia optymalnego.

Roztwór do hybrydyzacji5 par szkiełek10 par szkiełek15 par szkiełek20 par szkiełek
10x sole in situ100 μl200 μl300 μl400 μl
dejonizowany formamid400 μl800 μl1200 μl1600 μl
50 % siarczan dekstranu (+60 °C)200 μl400 μl600 μl800 μl
50x roztwór Denhardta20 μl40 μl60 μl80 μl
tRNA (100mg/ml)10 μl20 μl30 μl40 μl
H2O (traktowana DEPC)70 μl140 μl210 μl280 μl
Objętość całkowita800 μl1600 μl2400 μl3200 μl
  1. Rozcieńczyć sondę w wodzie MilliQ wolnej od RNaz do końcowej objętości 20 μl. Do sondy dodać jedną objętość (tj. 20 μl) formamidu, tak aby uzyskać objętość całkowitą 40 μl. Podgrzać sondę do 80°C przez 2 minuty. Umieścić na lodzie na 2 minuty. Wirować. Przechowywać sondę na lodzie. Ta mieszanina sondy jest wystarczająca dla jednej pary szkiełek. Pomnożyć objętość zgodnie z całkowitą liczbą par szkiełek dla danej sondy.
  2. Dodać 160 μl roztworu do hybrydyzacji dla każdej pary szkiełek, tak aby uzyskać końcową objętość 200 μl (tj. 160 μl roztworu do hybrydyzacji + 40 μl sondy) dla każdej pary szkiełek. Wymieszać, unikając tworzenia pęcherzyków powietrza.
  3. Nanieść sondę na jedno szkiełko i powoli złożyć dwa szkiełka razem. (N.B.! Metoda kanapkowa jest możliwa do zastosowania wyłącznie przy użyciu szkiełek Probe-On Plus lub szkiełek równoważnych. W przypadku użycia szkiełek bez matowego wykończenia, zamiast metody kanapkowej należy zastosować szkiełka nakrywkowe.)
  4. Unieść szkiełka nad mokre ręczniki papierowe w plastikowym pojemniku (szczelnie zamykanym) za pomocą plastikowych pipet. Inkubować w celu hybrydyzacji w temperaturze +50-55°C przez noc (12-16 godzin).

4.3 In situ po hybrydyzacji (Film! Szczegóły techniczne przedstawiono w filmie)

  1. Przygotuj etap powybrydyzacyjny in situ, podgrzewając przez noc ok. 2 L 0.2x SSC (+55°C) oraz ok. 2 L 1x NTE (+37°C). Większa ilość SSC i NTE będzie potrzebna, jeśli zostanie przeprowadzona obróbka RNazą (kroki 57-59 poniżej).
  2. Zanurz każdą parę slajdów w ciepłym 0.2x SSC (patrz wyżej), aby je rozdzielić i wypłukać. Następnie umieść je w statywie w pojemniku z ciepłym 0.2x SSC.
  3. Przemywaj slajdy przez 60 min w 0.2x SSC przy łagodnym mieszaniu w temperaturze +55°C. ( Uwaga! W czasie inkubacji przygotuj roztwór blokujący Boehringera używany w kroku 63.)
  4. Powtórz przemywanie w 0.2x SSC przez 60 min. ( Uwaga! Jeśli przeprowadzany jest etap z RNazą, pozwól RNazie odmarznąć podczas tej inkubacji; w przeciwnym razie przejdź do kroku 60.)
  5. Opcjonalnie: Przemywaj slajdy przez 5 min w ciepłym 1x NTE (patrz wyżej) w temperaturze +37°C przy łagodnym mieszaniu.
  6. Opcjonalnie: Powtórz przemywanie w ciepłym 1x NTE przez 5 min w temperaturze +37°C przy łagodnym mieszaniu.
  7. Opcjonalnie: Poddaj slajdy działaniu RNazy (20 μg/ml RNazy A w 1x NTE) przez 30 min w temperaturze +37°C przy łagodnym mieszaniu. Następnie przemywaj przez 5 min w 1x NTE w temperaturze +37°C przy łagodnym mieszaniu. Powtórz przemywanie w 1x NTE.
  8. Przemywaj slajdy przez 60 min w 0.2x SSC w temperaturze +55°C przy łagodnym mieszaniu. ( Uwaga! W czasie inkubacji przygotuj roztwór blokujący używany w krokach 64-65 i 67.)
  9. Przemywaj slajdy przez 5 min w 1x PBS w temperaturze pokojowej (Przerwa! Slajdy można przechowywać w 1x PBS w temperaturze +4°C przez noc, jeśli chcesz kontynuować pracę następnego dnia.)
  10. Umieść slajdy na dnie dużego plastikowego pojemnika stroną z próbką do góry.
  11. Inkubuj slajdy z 1% blokiem Boehringera w 100 mM Tris pH 7.5, 150 mM NaCl przez 45 min w temperaturze pokojowej przy łagodnym mieszaniu. Przykryj slajdy roztworem blokującym. Odlej roztwór blokujący, gdy slajdy wciąż znajdują się w plastikowym pojemniku, lub przełóż slajdy do nowego pojemnika. Podczas odlewania roztworu slajdy zazwyczaj przylegają do plastikowego pojemnika, ale upewnij się, że nie wypadną z niego.
  12. Zastąp roztwór blokujący Boehringera roztworem 1.0% BSA w 100 mM Tris pH 7.5, 150 mM NaCl, 0.3% Triton X-100. Przeprowadź inkubację tak jak w kroku 63.
  13. Rozcieńcz przeciwciała anty-dig (1:1250, tj. 8 μl przeciwciał w 10 ml BSA) w roztworze BSA/Tris/NaCl/Triton z kroku 64. Przygotuj kroplę roztworu przeciwciał w plastikowej szalce wagowej. Złóż slajdy razem, aby siły kapilarne wciągnęły roztwór. Osusz na ręczniku papierowym Kimwipe/chusteczce i powtórz, starając się unikać pęcherzyków powietrza.
  14. Unieś slajdy nad mokrymi ręcznikami papierowymi w plastikowym pojemniku i pozostaw je w temperaturze pokojowej na 2 godziny.
  15. Osusz slajdy na ręczniku papierowym Kimwipe/chusteczce i rozdziel je. Umieść na dnie plastikowego pojemnika jak w kroku 63. Przemywaj 4 razy w roztworze BSA/Tris/NaCl/Triton po 15 min za razem, przy łagodnym mieszaniu w temperaturze pokojowej.
  16. 10 min w 100 mM Tris pH 9.5, 100 mM NaCl, 50 mM MgCl2. Umieść na dnie plastikowego pojemnika jak w kroku 63.
  17. Zanurz slajd w roztworze Tris pH 9.5/NaCl/MgCl2, aby upewnić się, że cały detergent został wypłukany.
  18. Złóż slajdy razem i wciągnij roztwór Western blue tak jak w kroku 65. Powtórz raz.
  19. Umieść slajdy w plastikowym pojemniku nad mokrymi ręcznikami papierowymi w całkowitej ciemności (owiń folią aluminiową) na 1-5 dni w temperaturze pokojowej. Sprawdzaj po 6, 12 i 24 godzinach, a następnie raz dziennie.
  20. Osusz slajdy, wypłucz w 1x TE, aby zatrzymać reakcję. Nałóż szkiełka nakrywkowe przed badaniem slajdów pod mikroskopem. Slajdy można przechowywać w 1x TE przez kilka miesięcy, ale zdjęcia należy wykonać jak najszybciej.

PRZEPISY/ROZTWOR़Y ZAPASOWE

Uwaga! W miarę możliwości należy stosować wodę MilliQ wolną od RNaz, np. wodę MilliQ traktowaną DEPC (dodać 0,1% DEPC, pozostawić na noc, autoklawować (20 minut przy 15 psi, tj. 1,05 kg/cm2, w cyklu dla cieczy) lub użyć co najmniej autoklawowanej wody MilliQ. Podczas przygotowywania buforów i roztworów stokowych możliwe jest również rozpuszczanie soli wolnych od RNaz itp. w wodzie traktowanej DEPC, zamiast traktowania DEPC samych buforów i roztworów stokowych. Jeśli woda, bufory i roztwory stokowe nie są traktowane DEPC, należy je przynajmniej autoklawować lub sterylizować przez filtrację.
Przerwa! Bufory i roztwory stokowe przechowywać w temperaturze pokojowej, chyba że wskazano inaczej.
Uwaga! Wiele buforów oraz wskazówki dotyczące ich przygotowania można znaleźć w Molecular Cloning (Sambrook, J., and D.W. Russell. 2001. Molecular Cloning A Laboratory Manual. 3 ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, USA).

Bezwodnik octowy w 0,1M trietanolaminie (pH 8, objętość: 800 ml).

Składnikobjętość/ilośćstężenie końcowe
Trietanolamina10.4 ml0.1 M trietanolaminy
Woda MilliQ786.4 mlobjętość końcowa 800 ml
HCl3.2 mldo uzyskania pH 8.0
Bezwodnik octowy4.8 ml0.6%
  • Aby przygotować bufor trietanolaminowy 0,1 M o pH 8,0, należy rozcieńczyć 10,4 ml trietanolaminy w 786,4 ml H2O i dodać 3,2 ml HCl w celu dostosowania pH do 8,0 (sprawdzić za pomocą wskaźnika pH).
  • Unieść statyw z preparatami, używając połamanych plastikowych pipet 10 ml lub podobnych elementów, w pojemniku z trietanolaminą z mieszadłem magnetycznym na dnie.
  • Wlać 4,8 ml bezwodnika octowego do trietanolaminy na kilka minut przed włożeniem preparatów, aby roztwór został dobrze wymieszany.

Uwaga! Roztwór trietanoloaminy 0,1M należy przygotować na świeżo, a bezwodnik octowy dodać bezpośrednio przed inkubacją.
Uwaga! Należy użyć szklanego naczynia. Konieczne jest zastosowanie buforu trietanoloaminowego, ponieważ bezwodnik octowy jest niestabilny w wodzie.

Żel agarozowy (1%) w 1 x TBE (objętość: 100 ml)

Składnikobjętość/ilośćstężenie końcowe
Agaroza1 g1%
1 x TBEdo 100 ml

Wymieszaj agarozę z 1 x TBE. Podgrzewaj/gotuj, aż agaroza się rozpuści. Odlej żel. Prowadź elektroforezę w buforze 1 x TBE.

Siarczan dekstranu

Rozpuścić 5 g siarczanu dekstranu w wodzie MilliQ traktowanej DEPC do objętości 10 ml (tj. 50% (w/v)) i rozpuścić w temperaturze 60°C.
Przerwa! Przechowywać w temperaturze -20°C.

0,5 M EDTA pH 8,0 (titriplex III, objętość 500 ml)

Składnikobjętość/ilośćstężenie końcowe
EDTA (372,24 g/mol)93,06 g0,5 M EDTA
woda Milli-Qdo 500 ml
NaOH~ 10 g osaduo pH 8,0
DEPC0,5 ml0,1% DEPC

Rozpuścić EDTA w wodzie (zachodzi przy pH 8.0), doprowadzić do końcowej objętości 500 ml. Dodać 0.1% DEPC. Pozostawić przez noc. Autoklawować.

Roztwór utrwalający/utrwalacz (kroki 1-3, 42) - 4% (w/v) paraformaldehyd w 1x PBS, pH 7.0 (650 ml)

Składnikobjętość/ilośćstężenie końcowe
woda Milli-Q585 ml
10x PBS65 ml1x PBS
10M NaOH520 μldające pH ~11
Paraformaldehyd26 g4%
Stężony HCl449 μlprzy pH ~7
  • Wymieszać wodę, PBS i NaOH, a następnie podgrzać do +60-70°C (temperatura i wysokie pH ułatwią rozpuszczenie paraformaldehydu).
  • Dodać (w dygestorium) paraformaldehyd.
  • Gdy roztwór stanie się klarowny, umieścić go w lodzie i dostosować pH do 7,0, dodając 449 μl stężonego HCl.

Uwaga! Przygotować świeżą porcję.
Uwaga! W protokole dla świerka glutaraldehyd dodano do stężenia końcowego 0,25%, tzn. 6,5 ml 25% glutaraldehydu do całkowitej objętości 650 ml lub 10 ml 25% glutaraldehydu do całkowitej objętości 1000 ml (należy pamiętać o zmniejszeniu ilości wody o równą objętość).
Uwaga! Po skorygowaniu pH dodać kilka kropli Tween 20 i/lub Triton X-100, aby zmniejszyć napięcie powierzchniowe i ułatwić utrwalanie w krokach 1-3. NIE STOSOWAĆ W KROKU 42!
Uwaga! Podczas utrwalania tkanek roślinnych zazwyczaj wymagana jest mniejsza objętość (np. 100 - 200 ml) utrwalacza.

10x sole in situ (objętość 100 ml)

Składnikobjętość/ilośćstężenie końcowe
5 M NaCl60 ml3M NaCl
1 M Tris-Cl pH 8,010 ml0,100 M Tris
1 M fosforan sodu pH 6,810 ml0,100 M fosforan sodu
0,5 M EDTA10 ml0,050 M EDTA
woda MilliQdo 100 ml

Przygotować bufor fosforanowy sodu o pH 6.8 (46.3 ml 1 M Na2HPO4 + 53.7 ml 1 M NaH2PO4). Wymieszać NaCl, Tris, bufor fosforanowy sodu, EDTA i wodę. Przesterylizować w autoklawie. Przerwa! Przechowywać w temperaturze -20°C.

4 M LiCl2 (chlorek litu, objętość: 100 ml)

Składnikobjętość/ilośćstężenie końcowe
LiCl2 (42,39 g/mol)16,956 g4M LiCl2
woda Milli-Qdo 100 ml
DEPC0,1 ml0,1% DEPC

Rozpuścić LiCl2 w wodzie, doprowadzić do końcowej objętości 100 ml. Dodać 0,1% DEPC. Pozostawić przez noc. Zautoklawować.
Przerwa! Przechowywać w temperaturze +4°C.

1 M MgCl2 · H2O (chlorek magnezu, objętość: 100 ml)

Składnikobjętość/ilośćstężenie końcowe
MgCl2 · H2O (203.30 g/mol)20.33 g1 M MgCl2 · H2O
Woda MilliQdo 100 ml
DEPC0.1 ml0.1% DEPC

Rozpuścić MgCl2 w wodzie i doprowadzić do końcowej objętości 100 ml. Dodać 0,1% DEPC. Pozostawić na noc. Autoklawować.
Uwaga! MgCl2 jest bardzo higroskopijny. Nie przechowywać otwartych butelek przez dłuższy czas.

5 M NaCl (chlorek sodu, objętość: 1 l)

Składnikobjętość/ilośćstężenie końcowe
NaCl (58,44 g/mol)292,2 g5 M NaCl
woda Milli-Qdo 1 l
DEPC1 ml0,1% DEPC

Rozpuścić NaCl w wodzie, doprowadzić do końcowej objętości 1 l. Dodać 0,1% DEPC. Pozostawić przez noc. Zautoklawować.

1 M NaOAc pH 4.7 (octan sodu, objętość: 100 ml)

Składnikobjętość/ilośćstężenie końcowe
NaOAc (82,03 g/mol)0,8203 g1 M NaOAc
woda Milli-Qdo 100 ml
Kwas octowyo pH 4,7
DEPC0,1 ml0,1% DEPC

Rozpuścić NaOAc w wodzie. Dostosować pH do wartości 4.7. Uzupełnić objętość do 100 ml. Dodać 0,1% DEPC. Pozostawić na noc. Autoklawować.

0,2 M Na2CO3 pH11,4 (węglan sodu, objętość: 10 ml)

Składnikobjętość/ilośćstężenie końcowe
Na2CO30.21198 g0.2 M Na2CO3 pH=11.4
Woda MilliQdo 10 ml

Rozpuścić Na2CO3 w wodzie; dopełnić do końcowej objętości 10 ml. pH powinno wynosić 11,4.
Uwaga! Przygotować świeży roztwór.

0,2 M NaHCO3 pH8,2 (wodorowęglan sodu, objętość: 10 ml)

Składnikobjętość/ilośćstężenie końcowe
NaHCO330,16802 g0,2 M NaHCO33pH=8,2
woda Milli-Qdo 10 ml

Rozpuścić NaHCO3 w wodzie; doprowadzić do końcowej objętości 10 ml. pH powinno wynosić 8,2.
N.B.! Przygotować bezpośrednio przed użyciem.

1 M Na2HPO4 · 2 H2O (objętość 500 ml)

Składnikobjętość/ilośćstężenie końcowe
Na2HPO4 · 2 h2O (177,99 g/mol)88,995 g1 M Na2HPO4
woda Milli-Qdo 500 ml
DEPC0,5 ml0,1% DEPC

Rozpuścić Na2HPO4 w wodzie i uzupełnić do końcowej objętości 500 ml. Dodać 0,1% DEPC. Pozostawić przez noc. Autoklawować.

1 M NaH2PO4 · H2O (objętość 500 ml)

Składnikobjętość/ilośćstężenie końcowe
NaH2PO4 · H2O (137.99 g/mol)68.995 g1 M NaH2PO4
Woda MilliQdo 500 ml
DEPC0.5 ml0.1% DEPC

Rozpuścić NaH2PO4 w wodzie i doprowadzić do końcowej objętości 500 ml. Dodać 0,1% DEPC. Pozostawić przez noc. Zautoklawować.

5x NTE (objętość całkowita: 1l)

Składnikobjętość/ilośćstężenie końcowe
5 M NaCl500 ml2.5 M NaCl
1 M Tris-Cl pH 825 ml50 mM Tris-Cl pH 8
0.5 M EDTA5 ml5 mM EDTA
Woda MilliQ470 mlobjętość końcowa 1l

Wymieszaj NaCl, Tris, EDTA i wodę. Nie traktuj preparatu DEPC. Autoklawuj.

10 x PBS (bufor fosforanowo-solny) pH 7.0 (objętość całkowita: 1l)

Składnikobjętość/ilośćstężenie końcowe
5 M NaCl260 ml1.3 M NaCl
1 M Na2HPO470 ml70 mM Na2HPO4
1 M NaH2PO430 ml30 mM NaH2PO4
Woda MilliQ640 mlobjętość końcowa 1l
DEPC1 ml0.1% DEPC

Wymieszać NaCl, Na2HPO4, NaH2PO4 oraz wodę. Dostosować pH do pH 7.0 za pomocą HCl. Dodać 0,1% DEPC. Pozostawić przez noc. Autoklawować.

20x SSC pH 7.0 (objętość całkowita: 1l)

Składnikobjętość/ilośćstężenie końcowe
NaCl (58.44 g/mol)175.32 g3 M NaCl
Cytrynian sodu (294.1 g/mol)88.23 g0.300 M Na Citrate
Woda MilliQdo 1 l
HCldo uzyskania pH 7.5
DEPC1 ml0.1% DEPC

Rozpuścić NaCl oraz cytrynian sodu w ~ 800 ml wody. Dostosować pH do pH 7.0 za pomocą HCl. Uzupełnić objętość wodą do 1 l. Dodać 0,1% DEPC. Pozostawić przez noc. Zautoklawować.

5 x TBE (objętość: 1l)

Składnikobjętość/ilośćstężenie końcowe
Tris (121,14 g/mol)54 g~ 0,45 M Tris
Kwas borowy (61,83 g/mol)27,5 g~ 0,45 M kwas borowy
EDTA (372,24 g/mol)3,7 g~ 0,01 M EDTA
woda MilliQdo 1 l

Wymieszać Tris, kwas borowy, EDTA i wodę. pH powinno wynosić ~ 8.3. Przed użyciem rozcieńczyć do stężenia 1 x TBE.

10 x TE pH 8.0 (Tris EDTA, objętość: 1l)

Składnikobjętość/ilośćstężenie końcowe
1 M Tris-Cl, pH 8,0100 ml0,100 M Tris-Cl
0,5 M EDTA pH 8,0100 ml0,050 M EDTA
woda Milli-Qdo 1 l

Wymieszać Tris, EDTA i wodę. Nie traktować DEPC. Autoklawować.
Uwaga! Tris nie powinien być traktowany DEPC! Należy użyć proszku wolnego od RNaz i rozpuścić go w wodzie MilliQ traktowanej DEPC/wolnej od RNaz.

1 M Tris-HCl pH 7,5 - 9,5 (objętość 500 ml)

Składnikobjętość/ilośćstężenie końcowe
Tris (121,14 g/mol)60,57 g1 M Tris
woda Milli-Qdo 500 ml
HClprzy pH 7,5
HClo pH 8,0
NaOHo pH 9,5

Rozpuścić Tris w wodzie traktowanej DEPC. Dostosować do pożądanego pH. Uzupełnić do końcowej objętości 500 ml. Zautoklawować.
Uwaga! Tris nie powinien być traktowany DEPC! Należy użyć proszku wolnego od RNaz i rozcieńczyć go wodą MilliQ traktowaną DEPC/wolną od RNaz.
Uwaga! W sekcji Klonowanie Molekularne (patrz wyżej) znajduje się tabela opisująca, ile stężonego HCl jest potrzebne do uzyskania właściwego pH.

MATERIAŁY I METODY

Protokół in situ został przedstawiony powyżej oraz w filmie. Poniżej opisano dodatkowe informacje dotyczące materiału roślinnego i sond wykorzystanych w tym konkretnym przykładzie.

Materiał roślinny i plan eksperymentu

Męskie szyszki Picea abies [L.] Karst. (świerk pospolity) zebrano w Uppsali w Szwecji jesienią 2007 roku. Rozcięto osiem szyszek, a przekroje z każdej z nich wykorzystano w każdej z prób. Przetestowano trzy stężenia proteinazy K: 1, 3 i 5 μg/μl, a każdą z tych prób poddano działaniu RNazy lub nie. Preparaty niepoddane działaniu RNazy pozostawiono w PBS podczas czasu trwania inkubacji z RNazą. Arabidopsis thaliana [L.] Heynh. oraz Brassica napus L. hodowano w kontrolowanych warunkach w komorze hodowlanej przy temperaturze 22°C/18°C w cyklu dzień/noc i fotoperiodzie 16 h. Badano młode kwiatostany zawierające pąki kwiatowe w stadiach 0-10 (stadia według Smitha 5).

sondy cRNA

Całkowite RNA wyizolowano z P. abies szyszki męskie, zgodnie z wcześniejszym opisem 6 i z A. thaliana i B. napus z wykorzystaniem odpowiednio TRIzol (Gibco BRL, Frederick, Maryland, USA) oraz zestawu Qiagen RNeasy Plant Mini Kit (Qiagen, Hilden, Niemcy), zgodnie z zaleceniami producentów. cDNA zsyntetyzowano z 0,5-1 μg całkowite RNA, w zależności od gatunku, przy użyciu odwrotnej transkryptazy Superscript III (Invitrogen, Carlsbad, Kalifornia, USA) zgodnie z instrukcjami producenta. AtAP3 i BnAP3 fragmenty sensowne i antysensowne oraz P. abies fragmenty sensowne zostały wyizolowane i namnożone przy użyciu starterów specyficznych dla genu (Tabela 1). DAL13 fragmenty antysensowne wyizolowano i namnożono przy użyciu starterów opisanych w punkcie 7. Do fragmentów z A. thaliana i P. abies przy użyciu zmodyfikowanych starterów odwrotnych zawierających sekwencję T7 (Tabela 1). Fragment o długości 500 bp wyizolowano za pomocą BnAP3 specyficzne startery (Tabela 1) i sklonowane do wektora pGEM-T z promotorem T7. W przypadku fragmentów P. abies wszystkie reakcje PCR przeprowadzono w końcowej objętości 20 μl zawierający 0,2 j. polimerazy DNA Phusion High-Fidelity (Finnzymes, Espoo, Finlandia), 1x bufor Phusion HF, 200 μM każdego dNTP, 0.3 μM każdego startera oraz 25-50 ng cDNA, a następnie zastosowano standardowy program PCR z temperaturą przyłączania 60-55°C (dotknięcie -1°C/cykl), a następnie 55°CSondy cRNA sens i antysens dla wszystkich trzech gatunków zsyntetyzowano za pomocą in vitro transkrypcję z wykorzystaniem zestawu DIG RNA Labeling Kit (SP6/T7; Roche Applied Science, Mannheim, Niemcy) zgodnie z zaleceniami producenta, a długie sondy poddano trawieniu do fragmentów o długości około 100–150 bp przy użyciu Na2Tlenek węgla3 bufor zgodnie z 3.

WYNIKI

W niniejszej sekcji z wynikami opisujemy trzy różne przykłady typowych rezultatów eksperymentów in situ.

Mechanizm genetyczny regulujący rozwój rozrodczy u roślin nasiennych gołych i krytych poprzez określanie tożsamości organów męskich i żeńskich wydaje się być konserwatywny ewolucyjnie7-9, mimo że te dwie linie roślin nasiennych rozdzieliły się 285 milionów lat temu 10. U A. thaliana kwiatowe geny homeotyczne APETALA3 (AP3 11) i PISTILLATA (PI 12) są niezbędne i wystarczające do określenia męskiego rozwoju rozrodczego w obrębie kwiatu, a funkcja ta wydaje się być konserwatywna w linii roślin krytonasiennych 13. U roślin nasiennych gołych, które nie posiadają kwiatów, a ich organy rozrodcze są rozmieszczone w oddzielnych szyszkach męskich i żeńskich (Rys. 1A-C), geny homologiczne do AP3 i PI są specyficznie eksprymowane w organach wytwarzających pyłek w szyszce męskiej, czyli w mikrosporofilach 7,14. Zatem podobny zestaw genów homologicznych zarówno u roślin krytonasiennych, jak i nasiennych gołych definiuje organy wytwarzające pyłek.

Sondy specyficzne dla genów skierowane odpowiednio przeciwko AtAP3 i BnAP3 dawały sygnały od stadium 3 w młodych pąkach kwiatowych w regionie odpowiadającym drugiemu i trzeciemu kręgowi w A. thaliana i B. napus. W pąkach na późniejszych stadiach sygnały były ograniczone do rozwijających się płatków i pręcików (Rys. 2A i B). Wyniki te są zgodne z wcześniejszymi badaniami 11,15,16. Sondy skierowane przeciwko homologowi AP3 u P. abies, DAL13, generowały sygnały w mikrosporofilach męskich szyszek P. abies zarówno przed, jak i po zakończeniu wzrostu merystemu wierzchołkowego (Rys. 2C i D), co było oczekiwane na podstawie wcześniejszych badań 7,14. Sondy sensowne nie dawały sygnału powyżej tła (Rys. 3A-B oraz dane niepokazane). Wspólnie wyniki te wykazują ekspresję A. thaliana AP3 oraz jego ortologów u B. napus i P. abies w rozwijających się męskich organach rozrodczych.

Schemat porównawczy morfologii kwiatów; gatunki Arabidopsis, Brassica oraz sosny.

Rysunek 1. Kwiaty A.thaliana i B. napus oraz produkujące pyłek męskie szyszki iglaka P. abies. Zdjęcia przedstawiają kwiatostany z pąkami kwiatowymi i otwartymi kwiatami A.thaliana w A oraz B.napus w B. Należy zauważyć, że kwiaty roślin okrytonasiennych, poza sterylnym okwiatem, zawierają zarówno męskie, jak i żeńskie organy rozrodcze: pręciki i słupki. Na zdjęciu C przedstawiono gałązkę rośliny nagonasiennej P. abies z zielonymi igłami wegetatywnymi i czerwonymi rozrodczymi szyszkami męskimi.

Mikroskopia tkanek roślinnych; schemat struktur komórkowych i etapów wzrostu do analizy badawczej.

Rysunek 2. Ekspresja genu A. thaliana AP3 oraz genów homologicznych u B. napus i P. abies. Mikrografie przedstawiają przekroje podłużne kwiatostanów A. thaliana w A oraz B. napus w B, a także męskich szyszek P. abies w C i D. Przekroje hybrydyzowane z sondami antysensownymi skierowanymi przeciwko AtAP3 w A oraz BnAP3 w B wykazują sygnał w organach kwiatowych drugiego i trzeciego kręgu. Numery wskazują stadia rozwojowe kwiatu zgodnie z klasyfikacją Smitha 5. Sonda antysensowna skierowana przeciwko genowi DAL13 dała sygnał w mikrosporofilach wytwarzających pyłek w męskich szyszkach P. abies, co pokazano w C-D. Przykłady mikrosporofili zaznaczono strzałkami. Groty strzałek w A-D wskazują sygnał hybrydyzacji, który ma kolor fioletowy. W C i D związki fenolowe nadają brązowy, niespecyficzny kolor pojedynczym komórkom w centralnym rdzeniu. s, działo; p, płatek; st, pręcik; c, słupek; ms, mikrosporofil; pi, rdzeń; pp, komórki prepyłkowe. Skala: 100 μm.

Przekroje histologiczne porównujące efekt RNazy w różnych warunkach stężenia proteiny K, obraz mikroskopowy.

Rysunek 3. Ekspresja DAL13 w szyszkach męskich P. abies. Wszystkie mikrofotografie (A-H) przedstawiają przekroje podłużne szyszek męskich po zakończeniu wzrostu merystemu wierzchołkowego. Groty strzałek wskazują typy komórek, w których wykazano ekspresję DAL13. Przekroje na zdjęciach A i B zostały zhybrydyzowane z sondą kontrolną sensowną (sense) w celu określenia poziomu tła. Mikrofotografie od C do H zostały zhybrydyzowane z sondą antysensowną (antisense) DAL13. Na zdjęciach D, F, H oraz C, E, G odpowiednio przedstawiono przekroje z eksperymentów z zastosowaniem i bez zastosowania RNazy. Mikrofotografie z eksperymentów z użyciem 1 μg/ml proteinazy K przedstawiono w C i D, 3 μg/ml w E i F oraz 5 μg/ml w G i H. Skala: 100 μm.

Dyskusja

W porównaniu z protokołem dla A. thaliana/B. napus zoptymalizowano dwa aspekty protokołu dla P. abies: traktowanie RNazą oraz stężenie proteinazy K. RNaza usuwa sygnały tła, zwiększając tym samym specyficzność sygnału 17. Traktowanie proteinazą K jest konieczne do permeabilizacji tkanek, aby sonda mogła wniknąć i zhybrydyzować z docelową pulą RNA. Sonda antysensowna DAL13 dawała silniejszy sygnał bez traktowania RNazą (Ryc. 3C, E, G) w porównaniu do sekcji traktowanych RNazą przez 30 min (Ryc. 2D, F i H). Ponieważ traktowanie RNazą nie poprawiło sygnału, zostało ono usunięte z protokołu. Traktowanie proteinazą K testowano przy trzech różnych stężeniach: 1, 3 i 5 µg/ml. W przypadku P. abies przy zastosowaniu 1 µg/ml proteinazy K zaobserwowano słaby lub brak sygnału (Ryc. 3C-D). Silny sygnał uzyskano zarówno przy 3 µg/ml (Ryc. 3E-F), jak i 5 µg/ml (Ryc. 3G-H) proteinazy K. Ponieważ nie stwierdzono wyraźnej różnicy w sile sygnału przy użyciu 5 µg/ml proteinazy K w porównaniu do 3 µg/ml, w naszym protokole zdecydowaliśmy się na użycie 3 µg/ml. Prawdopodobnie potrzeba wyższego stężenia proteinazy K w męskich szyszkach P. abies w porównaniu do pąków kwiatowych A. thaliana i B. napus wynika z bardziej zwartej struktury tkanki o wyższej zawartości związków fenolowych i polisacharydów.

Podczas utrwalania i zatapiania widoczne są pewne różnice między protokołem dla A. thaliana/B. napus a protokołem dla P. abies. Badaną tkankę utrwala się w celu zapewnienia retencji RNA; jest to krok krytyczny, ponieważ słabo utrwalone materiały mogą dawać niski lub niewykrywalny sygnał, mimo wysokiej obfitości mRNA. Tkankę odwadża się, klaruje i zatapia w wosku w stopniowych etapach, aby uniknąć uszkodzeń tkanki, a w niektórych protokołach do etanolu stosowanego podczas odwadniania dodaje się 0,85% NaCl, aby dodatkowo zapobiec kurczeniu się i pęcznieniu komórek 3. Etap odwadniania podczas zatapiania można przeprowadzać w lodzie, aby zminimalizować aktywność RNaz. W protokole dla P. abies roztwór utrwalający zawierający 4% paraformaldehydu zawiera również 0,25% glutaraldehydu, co ma zapewnić lepszą retencję RNA 17, choć niektórzy twierdzą, że prawdopodobnie nie ma to znaczenia 3. Po wykonaniu skrawków materiał jest mocowany na szkiełkach i poddawany obróbce wstępnej (tj. odparafinowaniu, rehydratacji, permeabilizacji, traktowaniu w celu zmniejszenia nieswoistego wiązania sondy i na koniec odwadnianiu) przed hybrydyzacją.

W prezentowanym protokole całą procedurę detekcji można przeprowadzić w zwykłych laboratoriach, sygnał rozwija się zazwyczaj w ciągu 1-3 dni, a stosunek sygnału do tła można stale monitorować. Sondy znakowane DIG zazwyczaj dają wyraźniejszy sygnał w porównaniu z sondami znakowanymi radioaktywnie, są bardziej stabilne i mogą być ponownie wykorzystywane w kolejnych eksperymentach. Z drugiej strony, ich czułość jest mniejsza w porównaniu z sondami radioaktywnymi 17. Hybrydyzacja in situ wykrywa ekspresję przy użyciu znakowanej sondy specyficznej dla danego mRNA. Znakowanie radioaktywne jest solidną i czułą metodą znakowania, ale wymaga pracy z materiałami promieniotwórczymi i trwa kilka tygodni, zanim wyniki zostaną wykryte. Sondi znakowane antygenowo są natomiast bardziej stabilne, mniej niebezpieczne i wymagają ekspozycji na medium detekcyjne zaledwie przez kilka dni 17. W związku z tym obecnie dominują metody znakowania antygenowego. Najbardziej krytycznym krokiem, niezależnie od protokołu, jest projektowanie sondy. Należy zadbać o to, aby sonda charakteryzowała się wysoką specyficznością i była znakowana wysokiej jakości UTP. Czasami temperatura hybrydyzacji i/lub czas trwania reakcji muszą zostać dostosowane do konkretnych sond.

Nasz zmodyfikowany protokół oparty na sondach znakowanych DIG ułatwi jednoczesną lokalizację ekspresji mRNA w gatunkach od A. thaliana do P. abies i po niewielkich korektach powinien być możliwy do zastosowania w innych gatunkach roślin. Protokół, poza szyszkami męskimi, został również przetestowany z dobrymi wynikami na różnych stadiach pędów wegetatywnych oraz w embrionach zygotycznych i somatycznych P. abies (wyniki niepublikowane; Karlgren et al.).

Oświadczenia

Autorzy nie mają żadnych konfliktów interesów do ujawnienia.

Podziękowania

Jesteśmy bardzo wdzięczni Andersowi Bovinowi za dostarczenie muzyki do naszego filmu oraz Michaelowi Elliotowi Stocksowi za zgodę na bycie lektorem. Wsparcie zapewniły Fundacja Carla Tryggera, strategiczny program badawczy Agricultural Functional Genomics (AgriFunGen) na Szwedzkim Uniwersytecie Nauk Rolniczych, Szwedzka Rada Badawcza (VR) oraz Szwedzka Rada Badawcza ds. Środowiska, Nauk Rolniczych i Planowania Przestrzennego (FORMAS).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Bezwodnik octowySigma-AldrichA6404-200mlminimum 98%
Akrylamid, liniowyAmbion9520
przeciwciała anty-DIGGrupa Roche
Odczyn blokującyGrupa Roche11 175 041 910 lub 11 096 176 001
Seryjna albumina bydlęcaSigma-AldrichA7030-50gminimum 98%
Dejonizowany formamidSigma-Aldrich
roztwór DenhardtaSigma-AldrichD2532-5ml
DEPC, węglan dwuetylowySigma-Aldrich
Siarczan dekstranuSigma-Aldrich
Zestaw do znakowania RNA digoksygeniną (SP6/T7)Grupa Roche11175025910
Glutaraldehyd (25%)Histolab
GlikogenAmbion9510G
Histoclear IIHistolabPodczas zatapiania tkanki można użyć Tissue-clear, Histoclear II, ksylenu lub innego podobnego preparatu.
HistowaxHistolabDo zatapiania można użyć preparatów Histowax lub Paraplast.
ParaformaldehydSigma-AldrichP6148-500g
Paraplast plusSigma-AldrichP3683-1kgDo zatopienia próbek można użyć Histowax lub Paraplast.
Phusion™ Polimeraza DNA o wysokiej wiernościFinnzymes
laminki Probe-on PlusFisher Scientific22-230-900
Proteinaza KSigma-AldrichP2308-5mg
RNaza ASigma-AldrichR5503-100mg
Przejrzystość tkanekSakura FinetekPodczas zatapiania tkanek można stosować Tissue-clear, Histoclear II, ksylen lub podobny preparat.
TrietanoloaminaSigma-AldrichT1377-100mlminimum 98%
Triton X-100użyj standardowego produktu w laboratoriumNależy użyć Tritonu X-100, Tween-20 lub obu tych substancji.
tRNASigma-Aldrich83853-100mg
Tween-20użyj swojego standardowego produktu w laboratoriumNależy użyć Tritonu X-100 i/lub Tween-20.
Western BluePromega Corp.

Bibliografia

  1. Carr, S. M., Irish, V. F. Floral homeotic gene expression defines developmental arrest stages in Brassica oleracea L. vars. botrytis and italica. Planta. 201 (2), 179-188 (1997).
  2. Coen, E. S., Meyerowitz, E. M. The war of the whorls: genetic interactions controlling flower development. Nature. 353 (6339), 31-37 (1991).
  3. Jackson, D. In situ hybridization in plants. Molecular Plant Patology: a practical approach. Gurr, S. J., McPherson, M. J., Bowles, D. J. , University Press. Oxford. (1991).
  4. Leitch, A. R., Schwarzacher, T., Jackson, D., Leitch, I. J. In situ hybridization: a practical guide. , BIOS Scientific Publishers Limited. Oxford. (1994).
  5. Smyth, D. R., Bowman, J. L., Meyerowitz, E. M. Early flower development in Arabidopsis. Plant Cell. 2 (8), 755-767 (1990).
  6. Azevedo, H., Lino-Neto, T., Tavares, R. M. An improved method for high-quality RNA isolation from needles of adult maritime pine trees. Plant Molecular Biology Reporter. , 333-338 (2003).
  7. Sundstrom, J., et al. MADS-box genes active in developing pollen cones of Norway spruce (Picea abies) are homologous to the B-class floral homeotic genes in angiosperms. Dev Genet. 25 (3), 253-266 (1999).
  8. Tandre, K., Svenson, M., Svensson, M. E., Engstrom, P. Conservation of gene structure and activity in the regulation of reproductive organ development of conifers and angiosperms. Plant J. 15 (5), 615-623 (1998).
  9. Winter, K. U., et al. MADS-box genes reveal that gnetophytes are more closely related to conifers than to flowering plants. Proc Natl Acad Sci U S A. 96 (13), 7342-7347 (1999).
  10. Savard, L., et al. Chloroplast and nuclear gene sequences indicate late Pennsylvanian time for the last common ancestor of extant seed plants. Proc Natl Acad Sci U S A. 91 (11), 5163-5167 (1994).
  11. Jack, T., Brockman, L. L., Meyerowitz, E. M. The homeotic gene APETALA3 of Arabidopsis thaliana encodes a MADS box and is expressed in petals and stamens. Cell. 68 (4), 683-697 (1992).
  12. Bowman, J. L., Smyth, D. R., Meyerowitz, E. M. Genes directing flower development in Arabidopsis. Plant Cell. 1 (1), 37-52 (1989).
  13. Kramer, E. M., Irish, V. F. Evolution of genetic mechanisms controlling petal development. Nature. 399 (6732), 144-148 (1999).
  14. Sundstrom, J., Engstrom, P. Conifer reproductive development involves B-type MADS-box genes with distinct and different activities in male organ primordia. Plant J. 31 (2), 161-169 (2002).
  15. Carlsson, J., et al. Microarray analysis reveals altered expression of a large number of nuclear genes in developing cytoplasmic male sterile Brassica napus flowers. Plant J. 49 (3), 452-462 (2007).
  16. Teixeira, R. T., Farbos, I., Glimelius, K. Expression levels of meristem identity and homeotic genes are modified by nuclear-mitochondrial interactions in alloplasmic male-sterile lines of Brassica napus. Plant J. 42 (5), 731-742 (2005).
  17. Ying, S., Kay, A. B. The technique of in situ hybridization. Methods in Molecular Medicine. 56, 263-283 (2001).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Protok nieradioaktywnyanaliza gatunk w ro linekspresja tkankowo swoistaArabidopsis thalianaBrassica napustraktowanie proteinaz Kpomini cie RNazysondy znakowane DIG

Powiązane artykuły