Praktyczne podejście do genetycznego indukowalnego mapowania losów: wizualny przewodnik po znakowaniu i śledzeniu komórek in vivo

Podsumowanie

Genetyczne mapowanie losu indukowalne (GIFM) pozwala na znakowanie i śledzenie komórek z precyzyjną kontrolą przestrzenną i czasową in vivo oraz wyjaśnia, w jaki sposób komórki z konkretnej linii genetycznej przyczyniają się do tworzenia tkanek w rozwoju i u dorosłych osobników. Przedstawione tutaj techniki umożliwiają mapowanie losu zarodków myszy w stadium E12.5 na potrzeby analizy epifluorescencyjnej i analizy eksplantatów.

Streszczenie

Mapy losów komórek są tworzone poprzez znakowanie i śledzenie komórek in vivo w celu określenia, w jaki sposób komórki progenitorowe przyczyniają się do powstania konkretnych struktur i typów komórek w tkankach rozwijających się i dorosłych. Rozwinięciem tej koncepcji jest genetyczne indukowalne mapowanie losów komórek (Genetic Inducible Fate Mapping, GIFM), które łączy ekspresję genów, los komórki i zachowania komórkowe in vivo, aby tworzyć mapy losów w oparciu o linię genetyczną.

wykorzystuje GIFM X-CreER linie, w których X jest genem lub zestawem elementów regulacyjnych genu, które zapewniają przestrzenną ekspresję zmodyfikowanego białka bakteriofagowego, rekombinazy Cre (CreER^T). CreER^T zawiera zmodyfikowany eestrogen rdomena wiążąca ligand receptora, co sprawia, że CreER^T zatrzymane w cytoplazmie w przypadku braku leku tamoksyfen. Wiązanie tamoksyfenu powoduje uwolnienie CreER^T, który przemieszcza się do jądra komórkowego i pośredniczy w rekombinacji między sekwencjami DNA flankowanymi przez miejsca loxP. W GIFM rekombinacja zazwyczaj zachodzi między flankowaną przez loxP kasetą Stop poprzedzającą gen reporterowy, taki jak GFP.

Myszy są hodowane tak, aby posiadały albo specyficzny dla regionu, albo specyficzny dla typu komórek CreER oraz warunkowy allel reporterowy. Myszy niepoddane działaniu leku nie będą posiadały markerów, ponieważ kaseta Stop w reporterze zapobiega dalszej transkrypcji genu reporterowego. Podajemy tamoksyfen drogą zgłębnika do samic w określonym czasie ciąży, co zapewnia kontrolę czasową uwalniania CreER^T i jego późniejszą translokację do jądra komórkowego, co usuwa kasetę Stop z reportera. Po rekombinacji allel reporterowy jest wyrażany konstytutywnie i dziedzicznie. Ten ciąg zdarzeń znakuje komórki w taki sposób, że ich historia genetyczna zostaje trwale zapisana. Zrekombinowany reporter służy zatem jako wysokiej wierności genetyczny śledzik linii komórkowych, który po aktywacji staje się niezależny od ekspresji genu pierwotnie wykorzystywanego do napędzania CreER^T.

Stosujemy GIFM u myszy, aby badać prawidłowy rozwój oraz określić wkład linii genetycznych w typy komórek i tkanki dorosłych osobników. Wykorzystujemy również GIFM do śledzenia komórek w mutantach genetycznych, aby lepiej zrozumieć złożone fenotypy naśladujące istotne cechy ludzkich zaburzeń genetycznych.

Niniejszy artykuł wideo przeprowadza badaczy przez metody doświadczalne pozwalające na skuteczne zastosowanie GIFM. Prezentujemy tę metodę na dobrze scharakteryzowanych myszach Wnt1-CreER^T;mGFP, podając tamoksyfen w 8,5 dniu embrionalnym (E8.5) drogą zgłębnika do żołądka, po czym w dniu E12.5 przeprowadzono sekcję i analizę za pomocą stereomikroskopii epifluorescencyjnej. Demonstrujemy również, jak przeprowadzić mikrosekcję domen z mapowaniem linii komórkowych w celu przygotowania eksplantów lub analizy FACS, a także jak sekcjonować mózgi dorosłych osobników z mapowaniem linii komórkowych do fluorescencyjnego obrazowania całych preparatów. Wspólnie procedury te pozwalają badaczom na rozstrzyganie kluczowych pytań w biologii rozwoju oraz w modelach chorób.

Protokół

Przygotowanie tamoksyfenu i procedura gavage'u doustnego (E8.5)

• Przygotuj roztwór zapasowy tamoksyfenu o stężeniu 20 mg/ml, rozpuszczając tamoksyfen w uprzednio ogrzanym oleju kukurydzianym.
• Inkubuj roztwór w temperaturze 37° C przez 2 godziny na nutatorze, okresowo mieszając w wortexie.
• Chroń roztwór zapasowy tamoksyfenu przed światłem, przechowuj w temperaturze 4°C i zużyj w ciągu maksymalnie jednego miesiąca.
• W eksperymentach mapowania losów komórek (fate mapping) utwórz parę hodowlaną składającą się z samicy Swiss Webster (typ dziki; zakupionej w Taconic) oraz samca niosącego zarówno allel CreER^T specyficzny dla genu, jak i allel reporterowy. W celach demonstracyjnych używamy samców Wnt1-CreER^T;mGFP (Ellisor 2009).
• Każdego ranka sprawdzaj u samic Swiss Webster obecność czopa pochwowego. Poranek (godz. 09:00) dnia zauważenia czopa pochwowego wyznacz jako 0,5 dnia po kopulacji i na podstawie tego punktu wyjściowego oblicz datę podania tamoksyfenu. (W tym eksperymencie zastosowano dzień embrionalny 8,5).
• Użyj strzykawki 1 ml z igłą do karmienia zwierząt (20G x 1-1/2), aby pobrać 200 μl roztworu zapasowego tamoksyfenu (4 mg tamoksyfenu).
• Mocno unieruchom ciążną samicę Swiss Webster, chwytając ją za kark i plecy, aby ustabilizować głowę, a następnie odwróć ją brzuchiem do góry.
• Przytrzymaj ogon wolnymi palcami, aby utrzymać ciało w linii prostej.
• Wprowadź igłę do karmienia w kącik ust i delikatnie prowadź ją wzdłuż podniebienia.
• Obróć igłę tak, aby była równoległa do ciała, jednocześnie odchylając głowę do tyłu, aby szyja pozostała wyprostowana.
• Wprowadź igłę w dół przełyku, w stronę żołądka. Należy uważać, aby nie wprowadzić igły do tchawicy. Jeśli poczujesz opór, zwierzę wykaże odruch wymiotny lub zacznie się szamotać, natychmiast wyjmij igłę i spróbuj ponownie przeprowadzić zgłębnikowanie.
• Po wprowadzeniu igły do żołądka podaj tamoksyfen dożylnie do żołądka i przenieś samicę z powrotem do klatki aż do dnia sekcji.

Kraniektomia:

• Przeprowadzić perfuzję wewnątrzsercową dorosłej myszy z mapowaniem losów komórek przy użyciu 4% PFA, a następnie odciąć głowę nożyczkami, przecinając kręgosłup tuż nad barkami.
• Przesunąć skalpelem wzdłuż linii środkowej grzbietowej głowy (od strony rostralnej do kaudalnej), aby przeciąć skórę głowy i odsłonić czaszkę.
• Za pomocą skalpela usunąć nadmiar tkanki lub mięśni z bocznych i tylnych części czaszki.
• Pincetą przebić czaszkę w linii środkowej, tuż przed opuszka węchowe, tworząc mały otwór, w który można wprowadzić końcówki cienkich nożyczek.
• Wprowadzić cienkie nożyczki w ten otwór i wykonać nacięcie od strony przyśrodkowej do bocznej na długość odpowiadającą mniej więcej długości opuszek węchowych. Cięcie to spowoduje złamanie czaszki na styku kości nosowej i kości czołowej, zapewniając dobry dostęp dla nożyczek.
• Przeciąć wzdłuż szwów strzałkowych w czaszce (linia środkowa grzbietowa), upewniając się, że końcówki nożyczek są skierowane w stronę przeciwną do mózgu, aby uniknąć uszkodzenia tkanki podległej.
• Ostrożnie chwycić czaszkę pincetą i oddzielić kość wzdłuż nacięcia przyśrodkowego, aby odsłonić mózg. Czaszka może odpryskiwać w małych kawałkach lub łamać się w większych sekcjach. Kontynuować usuwanie wszystkich kości czołowych, ciemieniowych, międzyciemieniowych i potylicznych za pomocą pincety.
• Rozłamać kości otaczające paraflocculi (znajdujące się wzdłuż bocznych krawędzi mózgu na poziomie móżdżku), ściskając kuliste kości po każdej stronie. Ostrożnie usunąć kości.
• Odwrócić głowę do góry dnem (stroną grzbietową w dół) i za pomocą pincety przeciąć nerwy czaszkowe, aby uwolnić mózg z czaszki.

Mikroskopia całego preparatu: mózg dorosłego osobnika

• Oceń mózg dorosłego osobnika pod kątem oznakowania GFP za pomocą fluorescencyjnego stereomikroskopu.
• Przenieś mózg do szalki Petriego zawierającej PBS i wykonaj zdjęcie przy użyciu oprogramowania PictureFrame lub innego odpowiedniego programu.

Mikroskopia całego preparatu: zarodki w stadium E12.5

• Oceń zarodki w całości pod kątem oznakowania GFP, używając fluorescencyjnego mikroskopu dissectingowego.
• Przenieś osobniki wykazujące pozytywny sygnał GFP w całej objętości do szalki Petriego zawierającej PBS i wykonaj dokumentację fotograficzną przy użyciu oprogramowania PictureFrame lub innego odpowiedniego programu.
• Za pomocą pęsety odetnij mały fragment ogona z każdego zarodka, umieść każdy fragment w probówce PCR i przeprowadź genotypowanie tkanki metodą PCR (Ellisor 2009) dla obu alleli, aby potwierdzić wyniki uzyskane w analizie całego zarodka.

Mikrodysekcja i przygotowanie eksplantatów brzusznej części śródmózgowia z embrionów w stadium E12.5

• Po wyjęciu z łańcucha macicznego i zidentyfikowaniu embrionów z mapowaniem losu komórek za pomocą fluorescencji całego preparatu, przenieś embriony do sterylnego, lodowatego PBS w naczyniu do hodowli komórkowej.
• Za pomocą precyzyjnych nożyczek usuń część głowy embrionu, wykonując cięcie poprzeczne w kierunku ogonowym względem rombomeru 1.
• Następnie usuń przednią część głowy, wykonując cięcie wieńcowe przez częścią przedmózgowia. Odsłoni to strukturę rurkowatą, w której czwarta komora oraz pęcherzyk śródmózgowia tworzą kanał między tkankami grzbietowymi a brzusznymi.
• Ostrożnie wprowadź końce nożyczek do czwartej komory i przetnij wzdłuż linii środkowej grzbietowej, od strony ogonowej do przedniej, całkowicie otwierając rurkę i tworząc preparat typu „otwartej książki”. Brzuszna część śródmózgowia będzie teraz odsłonięta przyśrodkowo, natomiast dwie grzbietowe połowy śródmózgowia znajdą się bocznie.
• Usuń wszelkie pozostałe tkanki nie-neuronalne znajdujące się pod brzuszną częścią śródmózgowia, aby tkanka mogła leżeć bardziej płasko. W razie potrzeby wykonaj nacięcia w częściach przedniej i ogonowej, tak aby grzbietowe „skrzydła” eksplantu również leżały płasko. Eksplant powinien teraz przypominać „motyla”, w którym grzbietowa część śródmózgowia reprezentuje skrzydła, a rombomer 1 ogon.
• Aby dodatkowo wyizolować brzuszną część śródmózgowia do analizy FACS lub eksperymentów z hodowlą komórkową, usuń boczne (grzbietowe) części tkanki.

Reprezentatywne wyniki:

W tym eksperymencie GIFM komórki wykazujące ekspresję Wnt1 są trwale i dziedzicznie znakowane podczas embriogenezy poprzez podanie tamoksyfenu w dniu E8.5 zarodkom Wnt1-CreERT;mGFP. Następnie znakowane komórki są wizualizowane za pomocą fluorescencji całych preparatów oraz immunohistochemii na skrawkach, aby określić, w jaki sposób komórki pochodzące z Wnt1 przyczyniają się do tworzenia struktur neuronalnych w trakcie rozwoju. Fluorescencja całych preparatów opiera się na związanej z błoną komponent GFP reportera mGFP, a zatem dostarcza informacji komórkowych, jak i ogólnego obrazu projekcji neuronalnych pochodzących z Wnt1. Na przykład przy podaniu tamoksyfenu w dniu E8.5, zarodki Wnt1-CreERTmGFP w dniu E12.5 wykazują fluorescencję GFP głównie w śródmózgowiu, tylnej części rąbca i rdzeniu kręgowym (Rysunek 1A). Przy dużym powiększeniu widoczne są cienkie projekcje neuronalne unerwiające śródmózgowie, ścianę ciała, kończynę i region kraniofacjalny. Na tym etapie rozwoju zarodek jest przeźroczysty, a wewnętrzne znakowanie GFP jest łatwo dostrzegalne. Jednak w miarę rozwoju mózgu gęstość dojrzałej tkanki przesłania fluorescencję GFP emitowaną przez wewnętrzne struktury mózgu. W związku z tym, przy podaniu tamoksyfenu w dniu E8.5, w badaniu fluorescencyjnym całych preparatów u osobników dorosłych obserwuje się jedynie niewielkie znakowanie GFP w wzgórzkach górnych (Rysunek 1C, wstawka). Dodatkowo widoczne są niektóre projekcje aksonalne przebiegające wzdłuż brzusznej powierzchni rąbca (nie pokazano). W przeciwieństwie do tego, gdy tamoksyfen jest podawany w dniu E9.5, występuje znaczne znakowanie GFP w całym obszarze wzgórzków dolnych (Rysunek 1B, wstawka). Ten wzrost fluorescencji w całych preparatach może wskazywać, że komórki wykazujące ekspresję Wnt1 w dniu E9.5 w większym stopniu przyczyniają się do tworzenia powierzchownych regionów grzbietowego śródmózgowia lub emitują więcej wypustek w tym regionie niż komórki wykazujące ekspresję Wnt1 z dnia E8.5. Niezależnie od tego, różnica w fluorescencji całych preparatów odzwierciedla dynamiczny charakter ekspresji Wnt1 podczas rozwoju i demonstruje, jak GIFM może być wykorzystane do śledzenia odrębnych populacji komórek od stadium embrionalnego aż do dojrzałego osobnika.

Za pomocą immunohistochemii wykonano analizę przekrojów tkanek z mapowaniem losów komórek z Wnt1-CreERT;mGFP Zwierzęta analizuje się na poziomie komórkowym. Przeciwciała przeciwko GFP i β-galaktozydazie (β-gal) stosuje się wraz z różnymi swoistymi dla tkanek biomarkerami, aby określić szczegółowy wkład komórkowy Wnt1 linia komórkowa prowadząca do struktur i typów komórek neuronalnych. Przy podaniu tamoksyfenu w E8.5 i analizie tkanek w E12.5, komórki podwójnie dodatnie (GFP+ i β-gal+) obserwuje się w całym śródmózgowiu i rąbmózgowiu, z projekcjami przebiegającymi przez brzuszną część śródmózgowia (Rycina 1B). W mózgu dorosłym, Wnt1linia komórkowa znakowana w dniu E8.5 daje początek wielu strukturom śródmózgowia, w tym wzgórzkom górnym i dolnym, a także obszarom w pobliżu populacji komórek dopaminergicznych pola brzusznego nakrywki oraz istoty czarnej (Rycina 1D) (patrz również Zervas 2004). W przeciwieństwie do tego, Wnt1linia komórkowa znakowana w dniu E9.5 daje początek wzgórkom dolnym, a także neuronom w sąsiedztwie populacji komórek dopaminergicznych (Rysunek 1F).

Rycina 1. Reprezentatywne wyniki mapowania losów Wnt1-:

Przykłady wyników barwienia całego preparatu oraz immunocytochemii w embrionach Wnt1-CreERT;mGFP i dorosłych mózgach z mapowaniem losów (oznaczeniem) w E8.5 (A-D) i E9.5 (E-F). A. Embriony Wnt1-CreER;mGFP w E12.5 wykazują fluorescencję GFP głównie w śródmózgowiu (Mb), tylnej części rąbca (Hb) i rdzeniu kręgowym (Sp). B. Oznaczone komórki zwizualizowane i przeanalizowane na poziomie komórkowym za pomocą immunohistochemii, co pokazano na tym przekroju optycznym o grubości 1-μm (obiektyw 40x, akwizycja serii z). Przeciwciała przeciwko nuklearnej β-galaktوزydazie (nβ-gal) (czerwone) i przeciwciała przeciwko GFP (zielone) wskazują na komórki z mapowaniem losów widoczne w brzusznej części śródmózgowia. Tutaj komórki rekombinowane są podwójnie dodatnie (nβ-gal+/GFP+) ze względu na naturę warunkowego reportera mGFP. C. Mikroskopia fluorescencyjna całego preparatu ujawnia słabą fluorescencję GFP w wzgórzkach górnych (SC) osobnika dorosłego (wstawka). Ocena linii Wnt1 oznaczonej w E8.5 na przekrojach dorosłych przy użyciu mikroskopii o niskim powiększeniu (5X) wykazuje, że linia Wnt1 daje początek strukturom śródmózgowia, w tym wzgórkom górnym (SC) i dolnym (IC) (C). D. Przekrój optyczny 40x, 1 mm pobrany z brzusznej części śródmózgowia w sąsiedztwie neuronów dopaminergicznych z komórkami nβ-gal+ i bogatym splotem aksonalnym GFP+. E. Oznaczenie w E9.5 skutkuje znacznym znakowaniem GFP, które jest łatwo widoczne we wzgórku dolnym śródmózgowia podczas fluorescencji całego preparatu (wstawka). Linia Wnt1 oznaczona w E9.5 na przekrojach dorosłych (β-gal+, czerwone) jest skoncentrowana we wzgórku dolnym (grzbietowo-tylna część śródmózgowia), co widać w mikroskopii o niskim powiększeniu (5X) (E). F. Przekrój optyczny 40x, 1 mm pobrany z brzusznej części śródmózgowia w sąsiedztwie neuronów dopaminergicznych z komórkami nβ-gal+ i bogatym splotem aksonalnym GFP+. Wnt1-pochodne neurony oznaczone w E8.5 w porównaniu do E9.5 wykazują progresywne ograniczenie wkładu w grzbietową część śródmózgowia, podczas gdy linia Wnt1 nadal przyczynia się do budowy brzusznej części śródmózgowia.

Dyskusja

Zaprezentowany przez nas system GIFM może być wykorzystany do udzielenia odpowiedzi na szeroki zakres pytań dotyczących różnorodnych procesów komórkowych. Na przykład myszy zmodyfikowane za pomocą różnych driverów Cre mogą służyć do celowania w dowolny typ komórek, tkankę lub interesującą linię genetyczną. Ponadto, ponieważ tamoksyfen może być podawany w dowolnym punkcie czasowym w okresie embrionalnym lub postnatalnym, rekombinację można skierować na dowolny istotny etap rozwoju. Przestrzenna i czasowa kontrola tego sys...