Praktyczne podejście do genetycznego indukowalnego mapowania losów: wizualny przewodnik po znakowaniu i śledzeniu komórek in vivo

Podsumowanie

Genetyczne mapowanie losu indukowalne (GIFM) pozwala na znakowanie i śledzenie komórek z precyzyjną kontrolą przestrzenną i czasową in vivo oraz wyjaśnia, w jaki sposób komórki z konkretnej linii genetycznej przyczyniają się do tworzenia tkanek w rozwoju i u dorosłych osobników. Przedstawione tutaj techniki umożliwiają mapowanie losu zarodków myszy w stadium E12.5 na potrzeby analizy epifluorescencyjnej i analizy eksplantatów.

Streszczenie

Mapy losów komórek są tworzone poprzez znakowanie i śledzenie komórek in vivo w celu określenia, w jaki sposób komórki progenitorowe przyczyniają się do powstania konkretnych struktur i typów komórek w tkankach rozwijających się i dorosłych. Rozwinięciem tej koncepcji jest genetyczne indukowalne mapowanie losów komórek (Genetic Inducible Fate Mapping, GIFM), które łączy ekspresję genów, los komórki i zachowania komórkowe in vivo, aby tworzyć mapy losów w oparciu o linię genetyczną.

wykorzystuje GIFM X-CreER linie, w których X jest genem lub zestawem elementów regulacyjnych genu, które zapewniają przestrzenną ekspresję zmodyfikowanego białka bakteriofagowego, rekombinazy Cre (CreER^T). CreER^T zawiera zmodyfikowany eestrogen rdomena wiążąca ligand receptora, co sprawia, że CreER^T zatrzymane w cytoplazmie w przypadku braku leku tamoksyfen. Wiązanie tamoksyfenu powoduje uwolnienie CreER^T, który przemieszcza się do jądra komórkowego i pośredniczy w rekombinacji między sekwencjami DNA flankowanymi przez miejsca loxP. W GIFM rekombinacja zazwyczaj zachodzi między flankowaną przez loxP kasetą Stop poprzedzającą gen reporterowy, taki jak GFP.

Myszy są hodowane tak, aby posiadały albo specyficzny dla regionu, albo specyficzny dla typu komórek CreER oraz warunkowy allel reporterowy. Myszy niepoddane działaniu leku nie będą posiadały markerów, ponieważ kaseta Stop w reporterze zapobiega dalszej transkrypcji genu reporterowego. Podajemy tamoksyfen drogą zgłębnika do samic w określonym czasie ciąży, co zapewnia kontrolę czasową uwalniania CreER^T i jego późniejszą translokację do jądra komórkowego, co usuwa kasetę Stop z reportera. Po rekombinacji allel reporterowy jest wyrażany konstytutywnie i dziedzicznie. Ten ciąg zdarzeń znakuje komórki w taki sposób, że ich historia genetyczna zostaje trwale zapisana. Zrekombinowany reporter służy zatem jako wysokiej wierności genetyczny śledzik linii komórkowych, który po aktywacji staje się niezależny od ekspresji genu pierwotnie wykorzystywanego do napędzania CreER^T.

Stosujemy GIFM u myszy, aby badać prawidłowy rozwój oraz określić wkład linii genetycznych w typy komórek i tkanki dorosłych osobników. Wykorzystujemy również GIFM do śledzenia komórek w mutantach genetycznych, aby lepiej zrozumieć złożone fenotypy naśladujące istotne cechy ludzkich zaburzeń genetycznych.

Niniejszy artykuł wideo przeprowadza badaczy przez metody doświadczalne pozwalające na skuteczne zastosowanie GIFM. Prezentujemy tę metodę na dobrze scharakteryzowanych myszach Wnt1-CreER^T;mGFP, podając tamoksyfen w 8,5 dniu embrionalnym (E8.5) drogą zgłębnika do żołądka, po czym w dniu E12.5 przeprowadzono sekcję i analizę za pomocą stereomikroskopii epifluorescencyjnej. Demonstrujemy również, jak przeprowadzić mikrosekcję domen z mapowaniem linii komórkowych w celu przygotowania eksplantów lub analizy FACS, a także jak sekcjonować mózgi dorosłych osobników z mapowaniem linii komórkowych do fluorescencyjnego obrazowania całych preparatów. Wspólnie procedury te pozwalają badaczom na rozstrzyganie kluczowych pytań w biologii rozwoju oraz w modelach chorób.

Protokół

Przygotowanie tamoksyfenu i procedura zgłębnikowania doustnego (E8.5)

• Przygotować roztwór zapasowy tamoksyfenu o stężeniu 20 mg/ml, rozpuszczając tamoksyfen w uprzednio ogrzanym oleju kukurydzianym.
• Inkubować roztwór w temperaturze 37° C przez 2 godziny na nutatorze, okresowo mieszając go w wortexie.
• Chronić roztwór zapasowy tamoksyfenu przed światłem, przechowywać w temperaturze 4°C i zużyć w ciągu jednego miesiąca.
• W eksperymentach z mapowaniem losów komórek (fate mapping) utworzyć parę hodowlaną składającą się z samicy Swiss Webster (typ dziki; zakupionej z Taconic) oraz samca niosącego zarówno allel CreER^T specyficzny dla genu, jak i allel reporterowy. W celach demonstracyjnych stosujemy samców Wnt1-CreER^T;mGFP (Ellisor 2009).
• Każdego ranka sprawdzać samice Swiss Webster pod kątem obecności czopa pochwowego. Poranek (09:00) dnia, w którym zaobserwowano czop pochwowy, wyznaczyć jako 0,5 dnia po kopulacji i na tej podstawie obliczyć datę podania tamoksyfenu. (W tym eksperymencie wykorzystano 8,5 dzień embrionalny).
• Za pomocą strzykawki 1 ml z igłą do karmienia zwierząt (20G x 1-1/2) pobrać 200 μl roztworu zapasowego tamoksyfenu (4 mg tamoksyfenu).
• Mocno unieruchomić ciężarną samicę Swiss Webster, chwytając ją za kark i plecy, aby ustabilizować głowę, a następnie odwrócić ją grzbietem do dołu.
• Przytrzymać ogon wolnymi palcami, aby utrzymać ciało w linii prostej.
• Umieścić igłę do karmienia w kąciku pyska i delikatnie prowadzić ją wzdłuż podniebienia.
• Obrócić igłę tak, aby była równoległa do ciała, jednocześnie odchylając głowę do tyłu, aby utrzymać szyję w linii prostej.
• Prowadzić igłę w dół przełyku, w stronę żołądka. Należy uważać, aby nie wprowadzić igły do tchawicy. W przypadku wystąpienia oporu przy przesuwaniu igły, zaangażowania odruchu wymiotnego zwierzęcia lub gdy mysz zacznie się szamotać, natychmiast wyjąć igłę i powtórzyć gavage.
• Po wprowadzeniu igły do żołądka podać tamoksyfen dożołądkowo i umieścić samicę z powrotem w klatce aż do dnia sekcji.

Kraniotomia:

• Przeprowadź perfuzję wewnątrzsercową dorosłej myszy z mapowaniem losu komórek przy użyciu 4% PFA, a następnie odetnij głowę nożyczkami, przecinając kręgosłup tuż powyżej barków.
• Przesuń skalpelem wzdłuż linii środkowej grzbietowej głowy (od strony rostralnej do kaudalnej), aby przeciąć skórę i odsłonić czaszkę.
• Za pomocą skalpela zeskrob nadmiar tkanki lub mięśni z bocznych i tylnych części czaszki.
• Za pomocą pęsety przebij czaszkę w linii środkowej, tuż przed cebulkami węchowymi, tworząc niewielki otwór, który pomieści końcówki cienkich nożyczek.
• Wprowadź cienkie nożyczki do otworu i wykonaj nacięcie od strony przyśrodkowej do bocznej na długości odpowiadającej wielkości cebulek węchowych. Cięcie to przerwie ciągłość czaszki na styku kości nosowej i czołowej, zapewniając odpowiedni dostęp dla nożyczek.
• Przetnij czaszkę wzdłuż szwów strzałkowych (linia środkowa grzbietowa), upewniając się, że końcówki nożyczek są skierowane w stronę przeciwną do mózgu, aby uniknąć uszkodzenia tkanki pod spodem.
• Delikatnie uchwyć czaszkę pęsetą i odwarstw kość wzdłuż nacięcia przyśrodkowego, aby odsłonić mózg. Czaszka może odpryskiwać w małych fragmentach lub odrywać się w większych sekcjach. Kontynuuj używanie pęsety, aby usunąć wszystkie kości czołowe, ciemieniowe, międzyciemieniowe i potyliczne.
• Rozbij kości otaczające paraflocculi (znajdujące się wzdłuż bocznych krawędzi mózgu na poziomie móżdżku), ściskając kuliste kości po każdej stronie. Delikatnie odsuń kości.
• Odwróć głowę do góry dnem (stroną grzbietową do dołu) i za pomocą pęsety przetnij nerwy czaszkowe, aby uwolnić mózg z czaszki.

Mikroskopia całego preparatu: mózg dorosły

• Oceń obecność znakowania GFP w mózgu dorosłego osobnika, korzystając z fluorescencyjnego mikroskopu stereoskopowego.
• Przenieś mózg do szalki Petriego zawierającej PBS i wykonaj zdjęcie za pomocą programu PictureFrame lub innego odpowiedniego oprogramowania.

Mikroskopia całego preparatu: zarodki E12.5

• Ocenić embriony w całości pod kątem oznakowania GFP, używając fluorescencyjnego mikroskopu stereoskopowego.
• Przenieść embriony wykazujące pozytywny sygnał GFP w całej objętości do szalki Petriego z PBS i sfotografować je przy użyciu oprogramowania PictureFrame lub innego odpowiedniego programu.
• Za pomocą pęsety odciąć mały fragment ogona z każdego embrionu, umieścić każdy fragment w probówce PCR i przeprowadzić genotypowanie tkanki metodą PCR (Ellisor 2009) dla obu alleli, aby potwierdzić wyniki uzyskane w analizie całego preparatu.

Mikrodysekcja i przygotowanie eksplantu brzusznej części śródmózgowia z embrionów w stadium E12.5

• Po wypreparowaniu z łańcucha macicznego i zidentyfikowaniu embrionów poddanych mapowaniu losów za pomocą fluorescencji całego preparatu, przenieś embriony do sterylnego, schłodzonego PBS w naczyniu do hodowli komórkowej.
• Za pomocą precyzyjnych nożyczek usuń część głowy embrionu, wykonując cięcie poprzeczne gudałowo w stosunku do rombomeru 1.
• Następnie usuń rostralną część głowy, wykonując cięcie koronarne przez diencephalon. Odsłoni to strukturę rurkowatą, w której IV komora i pęcherzyk śródmózgowia tworzą kanał między tkankami grzbietowymi a brzusznymi.
• Ostrożnie wprowadź końcówki nożyczek do IV komory i przetnij wzdłuż linii środkowej grzbietowej, od strony gudałowej do rostralnej, całkowicie otwierając rurkę i tworząc preparat typu „otwartej książki”. Brzuszna część śródmózłowia zostanie teraz odsłonięta pośrodku, podczas gdy dwie grzbietowe połowy śródmózłowia znajdą się bocznie.
• Usuń wszelkie pozostałe tkanki pozaneuronalne znajdujące się pod brzuszną częścią śródmózłowia, aby tkanka mogła bardziej płasko przylegać do podłoża. W razie potrzeby wykonaj nacięcia w częściach rostralnych i gudałowych, tak aby „skrzydła” grzbietowe eksplantu również leżały płasko. Eksplant powinien teraz przypominać „motyla”, w którym grzbietowa część śródmózłowia stanowi skrzydła, a rombomer 1 ogon.
• Aby dodatkowo wyizolować brzuszną część śródmózłowia do analizy FACS lub eksperymentów z hodowlą komórkową, usuń boczne (grzbietowe) części tkanki.

Reprezentatywne wyniki:

W niniejszym eksperymencie GIFM komórki wykazujące ekspresję Wnt1 są trwale i dziedzicznie znakowane podczas embriogenezy poprzez podanie tamoksyfenu w E8.5 zarodom Wnt1-CreERT;mGFP. Następnie znakowane komórki są wizualizowane za pomocą fluorescencji całego preparatu oraz immunohistochemii w przekrojach, aby określić, w jaki sposób komórki pochodzące z Wnt1 przyczyniają się do budowy struktur neuronalnych w trakcie rozwoju. Fluorescencja całego preparatu opiera się na związanej z błoną składnikowej GFP reportera mGFP, a zatem dostarcza informacji komórkowych oraz ogólnego obrazu projekcji neuronalnych pochodzących z Wnt1. Na przykład, przy podaniu tamoksyfenu w E8.5, zarody Wnt1-CreERTmGFP w E12.5 wykazują fluorescencję GFP głównie w śródmózgowiu, tylnej części rdzenia przedniego i rdzeniu kręgowym (Rycina 1A). Przy dużym powiększeniu widoczne są cienkie projekcje neuronalne unerwiające śródmózgowie, ścianę ciała, kończynę oraz obszar kraniofacialny. Na tym etapie rozwoju zarodek jest przezroczysty, a wewnętrzne znakowanie GFP jest łatwo dostrzegalne. Jednak w miarę rozwoju mózgu gęstość dojrzałej tkanki przesłania fluorescencję GFP emitowaną przez wewnętrzne struktury mózgu. W związku z tym, przy podaniu tamoksyfenu w E8.5, w badaniu fluorescencyjnym całego preparatu u dorosłych osobników obserwuje się jedynie niewielkie znakowanie GFP w wzgórzkach górnych (Rycina 1C, wstawka). Ponadto widoczne są niektóre projekcje aksonalne biegnące wzdłuż brzusznej powierzchni rdzenia przedniego (nie pokazano). W przeciwieństwie do tego, gdy tamoksyfen jest podawany w E9.5, występuje znaczne znakowanie GFP w całym obszarze wzgórzków dolnych (Rycina 1B, wstawka). Ten wzrost fluorescencji całego preparatu może wskazywać, że komórki wykazujące ekspresję Wnt1 w E9.5 w większym stopniu przyczyniają się do budowy powierzchownych regionów grzbietowego śródmózgowia lub tworzą w tym regionie więcej wypustek niż komórki wykazujące ekspresję Wnt1 w E8.5. Bez względu na to, różnica w fluorescencji całego preparatu odzwierciedla dynamiczny charakter ekspresji Wnt1 podczas rozwoju i demonstruje, jak GIFM może być wykorzystane do śledzenia odrębnych populacji komórek od etapu zarodkowego aż do dojrzałego osobnika.

Za pomocą immunohistochemii analizowane są na poziomie komórkowym przekroje tkanek poddanych mapowaniu losów z organizmów Wnt1-CreERT;mGFP. Przeciwciała przeciwko GFP i β-galaktozydazie (β-gal) są stosowane wraz z różnorodnymi biomarkerami specyficznymi dla tkanek, aby określić szczegółowy wkład komórkowy linii Wnt1 w struktury i typy komórek nerwowych. Przy podaniu tamoksyfenu w E8.5 i analizie tkanek w E12.5, komórki podwójnie dodatnie (GFP+ i β-gal+) obserwuje się w całym śródmózgowiu i rąbmózgowiu, z projekcjami przebiegającymi przez brzuszny śródmózgowie (Rycina 1B). W dorosłym mózgu linia Wnt1 oznakowana w E8.5 daje początek wielu strukturom śródmózgowia, w tym wzgórzom górnym i dolnym, a także pojawia się w sąsiedztwie populacji komórek dopaminergicznych pola brzusznego nakrywki i istoty czarnej (Rycina 1D) (patrz również Zervas 2004). W przeciwieństwie do tego, linia Wnt1 oznakowana w E9.5 daje początek wzgórzom dolnym, a także neuronom w sąsiedztwie populacji komórek dopaminergicznych (Rycina 1F).

Rycina 1. Reprezentatywne wyniki mapowania losów Wnt1-:

Przykłady wyników obrazowania całego preparatu (whole-mount) oraz immunocytochemii w embrionach Wnt1-CreERT;mGFP i dorosłych mózgach, w których mapowanie linii komórkowych (znakowanie) przeprowadzono w dniu E8.5 (A-D) oraz E9.5 (E-F). A. Embriony Wnt1-CreER;mGFP w dniu E12.5 wykazują fluorescencję GFP głównie w śródmózgowiu (Mb), tylnej części rąbka (Hb) i rdzeniu kręgowym (Sp). B. Znakowane komórki zwizualizowane i przeanalizowane na poziomie komórkowym za pomocą immunohistochemii, co pokazano na tym przekroju optycznym o grubości 1-μm (obiektyw 40x, akwizycja serii z). Markowanie przeciwciałami przeciwko jądrowej β-galaktوزydazie (nβ-gal) (czerwone) oraz przeciwciałami przeciwko GFP (zielone) wskazuje na komórki zmapowane w brzusznej części śródmózgowia. Tutaj komórki rekombinowane są podwójnie dodatnie (nβ-gal+/GFP+) ze względu na charakter warunkowego reportera mGFP. C. Mikroskopia fluorescencyjna całego preparatu ujawnia słabą fluorescencję GFP w wzgórzkach górnych (SC) u osobnika dorosłego (wstawka). Ocena linii Wnt1 znakowanej w dniu E8.5 na przekrojach dorosłych przy użyciu mikroskopii o niskim powiększeniu (5X) wykazuje, że linia Wnt1 daje początek strukturom śródmózgowia, w tym wzgórkom górnym (SC) i dolnym (IC) (C). D. Przekrój optyczny 40x, 1 mm wykonany z brzusznej części śródmózgowia w pobliżu neuronów dopaminergicznych z komórkami nβ-gal+ i bogatym splotem aksonalnym GFP+. E. Znakowanie w dniu E9.5 skutkuje znacznym etykietowaniem GFP, które jest łatwo widoczne we wzgórzku dolnym śródmózgowia w obrazowaniu fluorescencyjnym całego preparatu (wstawka). Linia Wnt1 znakowana w dniu E9.5 na przekrojach dorosłych (β-gal+, czerwone) jest skoncentrowana we wzgórzku dolnym (grzbietowo-tylna część śródmózgowia), co widać w mikroskopii o niskim powiększeniu (5X) (E). F. Przekrój optyczny 40x, 1 mm wykonany z brzusznej części śródmózgowia w pobliżu neuronów dopaminergicznych z komórkami nβ-gal+ i bogatym splotem aksonalnym GFP+. Neurony pochodzące z Wnt1- znakowane w dniu E8.5 w porównaniu z E9.5 wykazują progresywne ograniczenie udziału w tworzeniu grzbietowej części śródmózgowia, podczas gdy linia Wnt1 nadal przyczynia się do tworzenia brzusznej części śródmózgowia.

Dyskusja

Zaprezentowany przez nas system GIFM może być wykorzystany do udzielenia odpowiedzi na szeroki zakres pytań dotyczących różnorodnych procesów komórkowych. Na przykład myszy zmodyfikowane za pomocą różnych driverów Cre mogą służyć do celowania w dowolny typ komórek, tkankę lub interesującą linię genetyczną. Ponadto, ponieważ tamoksyfen może być podawany w dowolnym punkcie czasowym w okresie embrionalnym lub postnatalnym, rekombinację można skierować na dowolny istotny etap rozwoju. Przestrzenna i czasowa kontrola tego sys...