System błonowego dwuhybrydowego badania drożdży (MYTH) oparty na rozszczepionej ubikwitynie: potężne narzędzie do identyfikacji oddziaływań białko-białko

Podsumowanie

Metoda MYTH umożliwia czułą detekcję przejściowych i trwałych oddziaływań między białkami ekspresowanymi w organizmie modelowym Saccharomyces cerevisiae. Została ona z powodzeniem zastosowana do badania egzogennych oraz drożdżowych białek błonowych w celu wysokoprzepustowej identyfikacji ich partnerów interakcji.

Streszczenie

Fundamentalne znaczenie biologiczne i kliniczne integralnych białek błonowych skłoniło do opracowania systemu opartego na drożdżach do wysokoprzepustowej identyfikacji oddziaływań białko-białko (PPI) dla pełnowymiarowych białek transbłonowych. W tym celu nasze laboratorium opracowało system Membrane Yeast Two-Hybrid (MYTH) oparty na rozszczepionej ubikwitynie. Technologia ta pozwala na czułą detekcję przejściowych i trwałych oddziaływań białkowych przy użyciuSaccharomyces cerevisiaejako organizm gospodarza. MYTH wykorzystuje obserwację, że ubikwitynę można podzielić na dwie stabilne części: połowę C-końcową ubikwityny drożdżowej (C_ub) oraz północną część domeny ubikwityny (N_ub). W metodzie MYTH zasada ta została zaadaptowana do roli „sensora” oddziaływań białko-białko. W skrócie, integralne białko przynęty w błonie jest połączone z C_ubktóry jest połączony ze sztucznym czynnikiem transkrypcyjnym. Białka ofiary (prey), w formie pojedynczej lub bibliotecznej, są łączone z N_ubczęści. Interakcja białkowa między przynętą (bait) a białkiem chwytanym (prey) prowadzi do rekonstytucji części ubikwityny, tworząc pełnowymiarową cząsteczkę „pseudo-ubikwityny”. Cząsteczka ta jest z kolei rozpoznawana przez cytozolowe enzymy deubikwitynujące, co skutkuje rozszczepieniem czynnika transkrypcyjnego i następującą indukcją ekspresji genu reporterowego. System ten jest wysoce adaptowalny i szczególnie dobrze nadaje się do przesiewania wysokoprzepustowego. Został on z powodzeniem zastosowany do badania interakcji z wykorzystaniem integralnych białek błonowych pochodzących zarówno z drożdży, jak i innych organizmów.

Protokół

1. Informacje wstępne

Oddziaływania białko-białko (PPI) stanowią fundamentalne elementy sterujące wszystkimi procesami komórkowymi. W związku z tym niezbędna jest ścisła regulacja wszystkich interakcji w celu utrzymania homeostazy komórkowej, ponieważ zaburzenie tej biologicznej równowagi często odgrywa rolę w rozwoju chorób i transformacji komórek nowotworowych. Białka związane z błoną należą do jednych z najważniejszych biologicznie klas białek, ponieważ mogą one inicjować złożone kaskady sygnałowe oraz pośredniczyć w imporcie i eksporcie różnych cząsteczek, w tym leków, co zyskało ostatnio na znaczeniu w ochronie zdrowia ze względu na coraz powszechniejsze problemy z lekoopornością. Zrozumienie złożoności tej klasy białek wymaga zidentyfikowania ich partnerów interakcyjnych. Poszukiwanie takich partnerów okazało się trudne, gdyż często wymaga stosowania drastycznych warunków, które muszą być optymalizowane dla każdego białka błonowego [1].

Fundamentalne znaczenie biologiczne i kliniczne białek błon integralnych skłoniło do opracowania systemu opartego na drożdżach do wysokoprzepustowej identyfikacji PPI dla pełnowymiarowych białek transbłonowych. W tym celu opracowaliśmy system Membrane Yeast Two-Hybrid (MYTH) oparty na rozszczepionej ubikwitynie [2-4]. Narzędzie to umożliwia czułe wykrywanie przejściowych i trwałych oddziaływań białkowych. Zostało ono z powodzeniem zastosowane do badania białek egzogennych i endogennych eksprymowanych w organizmie modelowym Saccharomyces cerevisiae [3-7]. System MYTH wykorzystuje obserwację, że ubikwityna może zostać rozdzielona na dwie części: połowę C-końcową (C_ub) i połowę N-końcową (NubI). Badania in vivo wykazały, że części te spontanicznie się rekonstytuują ze względu na swoje wysokie powinowactwo względem siebie (Ryc. 1a). Jednakże wprowadzenie mutacji punktowej izoleucyny 13 na glicynę w części N-końcowej ubikwityny (powodując powstanie fragmentu określanego jako N_ubG) zapobiega tej spontanicznej reasocjacji [8] (Ryc. 1b).

Zasadę tę wykorzystujemy w systemie MYTH (Ryc. 1c i 2). W skrócie, integralne białko przynęty (bait) jest połączone z fragmentem C_ub, który jest sprzężony ze sztucznym czynnikiem transkrypcyjnym składającym się z białka wiążącego DNA LexA z Escherichia coli oraz domeny aktywacyjnej VP16 wirusa opryszczki pospolitej. Białka łup (prey) generuje się poprzez fuzję fragmentów cDNA lub DNA genomowego z fragmentem NubG. Interakcja między białkami przynęty i łupu w gospodarzu drożdżowym prowadzi do rekonstrukcji pełnej cząsteczki „pseudo-ubikwityny”, z następującym rozpoznaniem przez cytozolowe enzymy deubikwitynizujące (DUB) i proteolitycznym uwolnieniem czynnika transkrypcyjnego. Czynnik transkrypcyjny może następnie wniknąć do jądra komórkowego i aktywować system genów reporterowych (zazwyczaj obejmujący ekspresję genów HIS3, lacZ i ADE2), co umożliwia wzrost szczepów drożdży na pożywkach selekcyjnych, co świadczy o interakcji przynęty i łupu [2-4].

Identyfikacja i charakterystyka oddziaływań białek błonowych integralnych dostarczy informacji pomagających w pełnym zrozumieniu ich funkcji. Dzięki dokładniejszemu zrozumieniu i analizie roli białek oddziałujących z białkami błonowymi integralnymi możemy poznać dynamiczne zależności zaangażowane w regulację tych białek oraz odkryć nowe cele o potencjale terapeutycznym.

2. Wybór przynęty i odpowiedniego systemu MYTH

1. Przed przeprowadzeniem analizy MYTH należy upewnić się, że białko posiada swój koniec N- i/lub C w cytosolu komórki. Niezbędne jest, aby znacznik C_ub-LexA-VP16 był przyłączony do białka na takim końcu, ponieważ enzymy deubikwitynizujące, konieczne do uwolnienia czynnika transkrypcyjnego, znajdują się w cytosolu [4].
2. Następnie należy zdecydować, który z dwóch głównych wariantów MYTH jest odpowiedni. W przypadku nienatywnych białek drożdżowych można zastosować tradycyjny MYTH (tMYTH), w którym przynęty są nadekspresowane ektopowo z plazmidu. Dla natywnych białek drożdżowych metodą z wyboru jest zintegrowany MYTH (iMYTH). W iMYTH przynęty są znakowane endogennie znacznikiem C_ub-LexA-VP16, co pozostawia je pod kontrolą ich natywnego promotora. Jest to korzystne, ponieważ poziom ekspresji przynęt typu dzikiego pomaga wyeliminować problemy związane z nadekspresją białek, takie jak zwiększona liczba wyników fałszywie dodatnich [3]. Z wyjątkiem początkowej konstrukcji przynęty i stosowanych pożywek selekcyjnych, obie formy MYTH są przeprowadzane w zasadniczo identyczny sposób. Dla przejrzystości w niniejszym raporcie skupimy się głównie na zastosowaniu tMYTH, ponieważ wariant ten może w zasadzie być stosowany z białkami błonowymi niemal każdego organizmu i jest zatem szerszy w zastosowaniu.

3. Generowanie i walidacja przynęty

1. Wymagane pożywki i roztwory
   1. Sterylna ddH₂O przygotowana poprzez autoklawowanie w 121°C, 15 psi przez 30 minut.
   2. Roztwór 3-amino-1,2,4-triazolu (3-AT) przygotowany jako 1M roztwór zapasowy w ddH₂O. Sterylizować poprzez przepuszczanie przez filtr 0,2 μm.
   3. Pożywka wzrostowa YPAD składająca się z 1% w/v ekstraktu drożdżowego, 2% w/v peptonu, 2% w/v glukozy i 100 μM adeniny przygotowanej w ddH₂O. Sterylizować poprzez autoklawowanie w 121°C, 15 psi przez 30 minut.
   4. 10x mieszanina aminokwasów/zasad nukleotydowych: Pełna mieszanina zawiera 1,0 mM adeniny, 1,8 mM uracylu, 1,0 mM argininy, 1,0 mM histydyny, 2,3 mM izoleucyny, 7,6 mM leucyny, 1,6 mM lizyny, 10,1 mM metioniny, 3,0 mM fenyloalaniny, 16,8 mM treoniny, 2,0 mM tryptofanu, 1,7 mM tyrozyny i 12,8 mM waliny, przygotowana w ddH₂O. W przypadku pożywek typu drop-out należy pominąć odpowiedni aminokwas(y) i/lub zasadę nukleotydową(e). Sterylizować poprzez autoklawowanie w 121°C, 15 psi przez 30 minut.
   5. Syntetyczna pożywka wzrostowa Drop-Out (SD) składająca się z 0,67% w/v azotowej bazy drożdżowej (bez aminokwasów, ale z siarczanem amonu), 2% w/v glukozy, 2% w/v agaru i 1x mieszaniny aminokwasów/nukleotydów, przygotowana w ddH₂O. Przygotować pożywki SD-Leucyna w formie płynnej i stałej (zawierającej 2% agaru). Przygotować również stałe pożywki SD-Tryptofan-Leucyna oraz SD-Tryptofan-Leucyna-Adenina-Histydyna. Sterylizować poprzez autoklawowanie w 121°C, 15 psi przez 30 minut. Wlać stałe pożywki do szalek Petriego 100x15 mm.
   6. Syntetyczna pożywka wzrostowa Drop-Out (SD) zawierająca 3-AT. Przygotować pożywkę SD-Tryptofan-Leucyna-Adenina-Histydyna zgodnie z opisem, ale zawierającą 3-AT w stężeniach 25, 50, 75 i 100 mM. Odpowiednią ilość 3-AT z 1M sterylnego roztworu zapasowego dodać do pożywki po autoklawowaniu i schłodzeniu (przed zastygnięciem). Wlać do szalek Petriego 100x15 mm.
   7. Mieszanina PEG/acetynu litu składająca się z 40% w/v PEG-3350, 120 mM octanu litu i 167 μg/mL DNA z plemników łososia (sól sodowa typu III) przygotowana w ddH₂O. Aby zapewnić sterylność mieszaniny, przygotować ją ze sterylnej wody i roztworów (tj. autoklawowanego 50% PEG-3350, autoklawowanego 1M octanu litu i 2 mg/mL soli sodowej DNA z plemników łososia typu III przygotowanej w sterylnej ddH₂O).
   8. Enzymy i odczynniki do przeprowadzania PCR.
   9. Komercyjny zestaw do miniprepu.
   10. Szklane kuleczki sodowo-wapienne (0,5 mm).
   11. Kompetentne komórki Escherichia coli odpowiednie do propagacji plazmidów (np. DH5α, XL10 gold) oraz standardowe pożywki odpowiednie do namnażania bakterii i selekcji plazmidów.
   12. Specyficzne szczepy drożdży, plazmidy i primery opisane w protokole.
2. Generowanie przynęt tMYTH metodą Gap Repair
   1. Przynęta musi zostać sklonowana do odpowiedniego wektora w celu tagowania i ekspresji. Obecnie dostępnych jest wiele wektorów tMYTH do konstruowania przynęt. Wektory takie jak pCMBV4, pAMBV4 i pTMBV4 umożliwiają konstrukcję przynęt z tagiem na C-końcu (BAIT-C_ub-LexA-VP16) pod kontrolą promotorów odpowiednio CYC1 (słabego), ADH1 (silnego) i TEF1 (bardzo silnego). Przynęty z tagiem na N-końcu (LexA-VP16-C_ub-BAIT) można generować przy użyciu wektorów takich jak pTLB-1 i pBT3-N, pod kontrolą promotorów odpowiednio TEF1 i CYC1. Wybór wektora zależy od przynęty i musi zostać ustalony empirycznie. W niektórych przypadkach konieczna jest wyższa ekspresja przynęty w celu wykrycia interakcji, podczas gdy w innych nadmierna ekspresja przynęty może być szkodliwa, prowadząc do zwiększonej liczby wyników fałszywie dodatnich.
   2. Przeprowadzić trawienie restrykcyjne wybranego plazmidu w odpowiednich miejscach restrykcyjnych. Cięcie powinno nastąpić tylko w bezpośrednim sąsiedztwie tagu C_ub-LexA-VP16 (powyżej tagu dla tagowania C-końcowego lub poniżej dla tagowania N-końcowego). Na przykład, przy użyciu wektora pAMBV4 idealnym wyborem jest SfiI. Przetrawiony plazmid przechowywać w -20°C do momentu użycia.
   3. Zaprojektować primery do amplifikacji i klonowania genu zainteresowania. Koniec 5' primera Forward musi odpowiadać około 35-40 nukleotydom powyżej miejsca restrykcyjnego, natomiast koniec 3' musi odpowiadać pierwszym 18-20 nukleotydom genu docelowego. Koniec 5' primera Reverse musi odpowiadać rewersyjnemu dopełnieniu około 35-40 nukleotydów poniżej miejsca restrykcyjnego, a koniec 3' musi odpowiadać rewersyjnemu dopełnieniu ostatnich 18-20 nukleotydów genu docelowego (pomijając kodon stop, jeśli tag C_ub-LexA-LexA-VP16 jest umieszczany na C-końcu). W zależności od tego, czy wykonywane jest tagowanie N- czy C-końcowe, należy dobrać 35-40 nukleotydów primera Forward lub Reverse w taki sposób, aby gen docelowy został sklonowany w odpowiedniej ramce odczytu z tagiem C_ub-LexA-VP16.
   4. Amplifikować gen zainteresowania metodą PCR przy użyciu powyższych primerów. Parametry PCR będą zależeć od konkretnego enzymu i zastosowanych specyficznych primerów.
   5. Transformować produkt PCR wraz z przetrawionym plazmidem do odpowiedniego laboratoryjnego szczepu drożdży posiadającego mutację leu2 (np. BY4741). Można użyć szczepu reporterowego MYTH (np. THY.AP4 lub L40), ale nie jest to konieczne, ponieważ celem użycia drożdży na tym etapie jest jedynie zapewnienie środowiska, w którym może zajść homologiczna rekombinacja typu gap repair. Transformację należy przeprowadzić w następujący sposób:
      1. Zaszczepić pojedynczą kolonię wybranego szczepu drożdży do 5 mL sterylnej pożywki YPAD i inkubować przez noc w 30°C przy stałym wytrząsaniu (200 rpm).
      2. Rozcieńczyć kulturę nocną w 50 mL świeżej pożywki YPAD do OD600 ≈ 0,15 i inkubować w 30°C z wytrząsaniem (200 rpm). Hodować przez około 3-4 godziny, aż do osiągnięcia OD600 ≈ 0,6.
      3. Wirować komórki przy 700xg przez 5 minut i usunąć nadsącz.
      4. Resuspendować osad komórkowy w 25 mL sterylnej ddH₂O i wirować przy 700xg przez 5 minut.
      5. Usunąć nadsącz i resuspendować osad komórkowy w 1 mL sterylnej ddH₂O.
      6. Do probówki do mikrocentryfugi dodać 100 μL komórek, 300 μL mieszaniny PEG/acetynu litu, przetrawiony plazmid (50 fmol) oraz produkt PCR (250-500 fmol).
      7. Inkubować w 30°C przez 30 minut.
      8. Przeprowadzić szok termiczny w 42°C przez 1 godzinę.
      9. Wirować przy 3000xg przez 5 min i usunąć nadsącz.
      10. Resuspendować osad komórkowy w 200 μL sterylnej ddH₂O i wysiać całą objętość na stałe, selektywne pożywce SD-Leucyna. Hodować w 30°C przez 2-4 dni.
      11. Namnożyć pojedynczą kolonię transformowanego szczepu w 5 mL płynnej pożywki SD-Leucyna w 30°C przez noc.
      12. Wirować komórki przy 700xg przez 5 minut i usunąć nadsącz.
      13. Wyizolować DNA plazmidu przynęty z osadów komórkowych przy użyciu dowolnego komercyjnego zestawu do miniprepu. Postępować zgodnie ze standardowym protokołem z jedną modyfikacją. Aby zapewnić wystarczającą lizę komórek drożdży, dodać niewielką objętość szklanych kuleczek sodowo-wapiennych 0,5 mm do osadu po wstępnej resuspensji i intensywnie wierzgać przez 5 minut. Następnie kontynuować standardowy protokół komercyjny.
      14. Transformować wyizolowane DNA drożdży do kompetentnego szczepu E. coli odpowiedniego do propagacji plazmidów (np. DH5α, XL10 Gold) o wydajności transformacji co najmniej 1x10⁷ komórek/μg DNA. Należy pamiętać, że do selekcji plazmidów przynęty można użyć kanamycyny.
      15. Wyizolować DNA plazmidowe z transformowanych E. coli przy użyciu standardowej metody izolacji DNA lub zestawu komercyjnego.
      16. Zweryfikować prawidłową konstrukcję plazmidu przynęty poprzez sekwencjonowanie.
      17. Transformować zweryfikowany konstrukt przynęty do odpowiedniego szczepu reporterowego MYTH (np. THY.AP4, L40). Można zastosować opisany wcześniej protokół transformacji drożdży, zastępując przetrawiony plazmid i produkt PCR DNA plazmidu przynęty.
3. Walidacja przynęty – prawidłowa lokalizacja
   1. Przed użyciem szczepy z przynętami są analizowane w celu upewnienia się, że są one prawidłowo zlokalizowane w błonie drożdży. W przypadku iMYTH lokalizacja ta zależy konkretnie od właściwości tagowanej przynęty. W tMYTH plazmidy przynęt zazwyczaj zawierają sekwencję sygnałową (np. Matα), która kieruje ekspresowane białko do błony plazmatycznej. Lokalizację określa się za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. Włączenie cząsteczki YFP do sekwencji tagu przynęty (tj. C_ub-YFP-LexA-VP16) jest najprostszym i najbardziej bezpośrednim podejściem, umożliwiającym bezpośrednią wizualizację żywych komórek i jest powszechnie stosowane w iMYTH. Alternatywnie można zastosować standardowe podejście immunofluorescencyjne z użyciem przeciwciał przeciwko komponentom LexA lub VP16 tagu.
4. Walidacja przynęty – test kontrolny N_ubG/I
   1. Po ustaleniu prawidłowej lokalizacji przynęty należy upewnić się, że przynęta nie aktywuje systemu reporterowego samodzielnie lub w obecności nieoddziałujących „ofiar” (tj. sprawdzić, czy przynęta nie jest samoaktywująca). Osiąga się to za pomocą testu N_ubG/I, w którym przynęta jest transformowana oddziałującymi (pozytywnymi) i nieoddziałującymi (negatywnymi) kontrolnymi „ofiarami”, a wzrost jest oceniany na pożywkach selektywnych. Aby nadawała się do użycia w MYTH, przynęta musi rosnąć na pożywkach selektywnych w obecności kontroli pozytywnej i nie rosnąć w obecności kontroli negatywnej.
   2. Zacząć od transformacji testowanego szczepu z przynętą 100-200 ng plazmidu kontrolnej „ofiary”. Można zastosować opisany wcześniej protokół transformacji drożdży, zastępując pożywkę YPAD pożywką SD-Leucyna i używając pożywki SD-Tryptofan-Leucyna w końcowym etapie wysiewania. Powszechnie stosuje się następujące konstrukty kontrolnych „ofiar”:
      1. pOST1-N_ubI (kontrola pozytywna)
      2. pOST1-N_ubG (kontrola negatywna)
      3. pFUR4-N_ubI (kontrola pozytywna)
      4. pFUR4-N_ubG (kontrola negatywna)
   3. OST1 jest komponentem kompleksu oligosacharylowego i jest zlokalizowany w błonie retikulum endoplazmatycznego [9], natomiast FUR4 jest permeazą uracylu i jest zlokalizowany w błonie plazmatycznej [10]. Chociaż białka te są zazwyczaj naszym pierwszym wyborem jako nieoddziałujące „ofiary”, ich przydatność może się różnić w zależności od przypadku. W mało prawdopodobnym zdarzeniu, gdy przewiduje się, że przynęta rzeczywiście będzie oddziaływać z obiema tymi kontrolami, konieczny będzie wybór alternatywnych „ofiar”. Przypomnijmy, że N_ubI jest formą typu dzikiego N-końca ubikwityny i spontanicznie oddziałuje z C_ub niezależnie od oddziaływania między białkami, do których zfuzowane są C_ub i N_ub. Zatem „ofiary” N_ubI stanowią kontrole pozytywne, natomiast „ofiary” N_ubG (zawierające mutację izoleucyny 13 na glicynę, która zapobiega spontanicznemu asocjowaniu N_ub i C_ub) służą jako kontrole negatywne.
   4. Resuspendować pojedyncze kolonie każdej transformowanej przynęty w 100 μL sterylnej ddH₂O.
   5. Wykonać rozcieńczenia seryjne resuspendowanych komórek w sterylnej ddH₂O, aby uzyskać rozcieńczenia 1/10, 1/100 i 1/1000.
   6. Nanieść objętości 5 μL nierozcieńczonych i rozcieńczonych komórek na pożywki SD-Tryptofan-Leucyna oraz SD-Tryptofan-Leucyna-Adenina-Histydyna z i bez 3-AT w różnych stężeniach. 3-AT działa jako konkurencyjny inhibitor genu reporterowego HIS3 i służy do zwiększenia rygorystyczności procesu selekcji. W niektórych przypadkach może być przydatny do hamowania nieswoistego wzrostu słabo lub umiarkowanie samoaktywujących się przynęt.
   7. Pozostawić kropelki do wyschnięcia, a następnie inkubować płytki w 30°C przez 2-4 dni.
   8. Wszystkie transformanty powinny rosnąć na płytkach SD-Tryptofan-Leucyna, co wskazuje, że zostały pomyślnie transformowane plazmidem „ofiary”. Przynęty, które nie samoaktywują się, będą rosnąć na pożywce SD-Tryptofan-Leucyna-Adenina-Histydyna tylko po transformacji konstruktami „ofiary” N_ubI, a nie N_ubG. Odnotować, jakie stężenie 3-AT jest wymagane w pożywce (jeśli w ogóle), ponieważ będzie ono konieczne podczas screeningu.

4. Przesiewanie

1. Wymagane pożywki i roztwory
   1. Sterylna ddH₂O przygotowana przez autoklawowanie w 121°C, 15 psi przez 30 minut.
   2. 0,9% roztwór NaCl przygotowany w ddH₂O i wysterylizowany przez autoklawowanie w 121°C, 15 psi przez 30 minut.
   3. Roztwór fosforanu sodu składający się z 493 mM fosforanu sodu dwuzasadowego i 250 mM fosforanu sodu jednozasadowego w ddH₂O. Sterylizować przez autoklawowanie w 121°C, 15 psi przez 30 minut.
   4. Roztwór X-Gal (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galaktopiranozyd) przygotowany jako roztwór zapasowy o stężeniu 100 mg/mL w N,N-dimetyloformamidzie.
   5. Pożywka wzrostowa 2xYPAD zawierająca 2% w/v ekstraktu drożdżowego, 4% w/v peptonu, 4% w/v glukozy i 100 μM adeniny, przygotowana w ddH₂O. Sterylizować przez autoklawowanie w 121°C, 15 psi przez 30 minut.
   6. Syntetyczna pożywka z pominięciem składników (SD), przygotowana zgodnie z wcześniejszym opisem. Przygotować płynną pożywkę SD-leucyna oraz stałą SD-tryptofan-leucyna. Wlać pożywkę stałą do szalek Petriego 100x15 mm. Przygotować stałą pożywkę SD-tryptofan-leucyna-adenina-histydyna w okrągłych szalkach 150 mm (16 szalek na każdy screening), zawierającą w razie potrzeby 3-AT w stężeniu określonym na podstawie testu kontrolnego N_ubG/I.
   7. Pożywka syntetyczna z pominięciem składników (SD) + 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galaktopiranozyd (X-Gal). Przygotować pożywkę SD-tryptofan-leucyna-adenina-histydyna zawierającą agar zgodnie z wcześniejszym opisem. Po autoklawowaniu odstawić do ostygnięcia, dodać 3-AT (jeśli jest wymagany), a następnie 1/10 objętości sterylnego roztworu fosforanu sodu. Następnie dodać roztwór X-Gal do stężenia końcowego 80 μg/mL. Dokładnie wymieszać i wlać do okrągłych szalek 150 mm.
   8. Roztwór PEG/octanu litu II zawierający 40% PEG-3350, 100 mM octanu litu, 1 mM EDTA i 10 mM Tris pH 7,5. Przygotować ten roztwór, używając sterylnej ddH₂O i roztworów (np. autoklawowanego 50% PEG-3350, 1 M octanu litu, 100 mM Tris pH 7,5 i 500 mM EDTA pH 8,0).
   9. Roztwór octanu litu / Tris EDTA zawierający 110 mM octanu litu, 11 mM Tris pH 7,5 i 1,1 mM EDTA. Przygotować ten roztwór, używając sterylnej ddH₂O i roztworów (np. autoklawowanego 1 M octanu litu, 100 mM Tris pH 7,5 i 500 mM EDTA pH 8,0).
   10. 10x roztwór Tris EDTA składający się z 100 mM Tris pH 7,5 i 10 mM EDTA przygotowany w ddH₂O. Sterylizować przez autoklawowanie w 121°C, 15 psi przez 30 minut.
   11. Roztwór jednoniciowego DNA nośnikowego (ssDNA) zawierający 2 mg/mL soli sodowej DNA z plemni łososia typu III, przygotowany w sterylnej ddH₂O.
   12. Komercyjny zestaw do miniprepu.
   13. Szklane kuleczki sodowo-wapniowe (0,5 mm).
   14. Kompetentne komórki Escherichia coli odpowiednie do propagacji plazmidów (np. DH5α, XL10 gold) oraz standardowe pożywki odpowiednie do namnażania bakterii i selekcji plazmidów.
   15. Specyficzne szczepy drożdży i plazmidy opisane w protokole.
2. Transformacja na dużą skalę
   1. Zaszczepić pojedynczą kolonię szczepu reporterowego MYTH zawierającego białko przynętę (bait) do 5 mL pożywki SD-leucyna i inkubować przez noc w 30°C z wytrząsaniem (200 obr./min).
   2. Rozcieńczyć kulturę nocną w 200 mL pożywki SD-leucyna do OD600 = 0,15 i inkubować w 30°C z wytrząsaniem (200 obr./min). Hodować do osiągnięcia OD600 = 0,6 - 0,7 (około 4-5 godzin).
   3. Krótko przed osiągnięciem docelowej wartości OD600 rozmrozić alykwot roztworu ssDNA. Gotować w 100°C przez 5 minut, a następnie schłodzić na lodzie. Powtórzyć raz.
   4. Po osiągnięciu docelowej wartości OD600 zebrać komórki poprzez wirowanie przy 700xg przez 5 minut (podzielić 200 mL kultury do 4 probówek wirówkowych z zakrętką o pojemności 50 mL).
   5. Przemyć każdy osad 30 mL sterylnej ddH₂O i krótko wymieszać próbkę na wirówce typu vortex. Wirować przy 700xg przez 5 minut.
   6. Odlać nadsącz i zawiesić każdy osad w 1 mL roztworu octanu litu / Tris EDTA. Przenieść do sterylnej probówki mikrowirówkowej 1,5 mL i wirować przy 700xg przez 5 minut.
   7. Odlać nadsącz i zawiesić każdy osad w 600 μL roztworu octanu litu / Tris EDTA.
   8. Do 4 probówek wirówkowych z zakrętką o pojemności 15 mL dodać:
      1. 2,5 mL roztworu PEG/octanu litu II
      2. 600 μL zawiesiny komórek
      3. 100 μL roztworu ssDNA
      4. 7 μg DNA biblioteki białek ofiar (prey)
   9. Biblioteki zawierające ofiary znakowane N_ubG na N- lub C-końcu, przygotowane z różnych źródeł cDNA lub genomowych, są dostępne komercyjnie (www.dualsystems.com). Wybór konkretnej biblioteki musi być ustalany indywidualnie, w zależności od wybranej przynęty i celów eksperymentalnych.
   10. Mieszać probówki na vortexie przez 1 minutę, aby zapewnić dokładne wymieszanie, a następnie inkubować w kąpieli wodnej w 30°C przez 45 minut. Krótko mieszać co 15 minut.
   11. Do każdej probówki dodać 160 μL dimetylosulfotlenku (DMSO) i natychmiast wymieszać poprzez odwracanie probówek.
   12. Inkubować w kąpieli wodnej w 42°C przez 20 minut.
   13. Zebrać transformanty przez wirowanie przy 700xg przez 5 minut.
   14. Odlać nadsącz. Odzyskać transformanty poprzez zawieszenie każdego osadu w 3 mL 2xYPAD. Połączyć wszystkie próbki w jednej probówce wirówkowej z zakrętką o pojemności 50 mL.
   15. Inkubować w 30°C przez 90 minut w celu regeneracji komórek.
   16. Wirować przy 700xg przez 5 minut i odlać nadsącz.
   17. Zawiesić osady komórkowe w 4,9 mL sterylnego 0,9% NaCl.
   18. Używając 100 μL zawiesiny komórek, przygotować 10-krotne rozcieńczenia seryjne w sterylnym 0,9% NaCl w zakresie od 10x do 1000x.
   19. Wylać 100 μL rozcieńczeń 100x i 1000x na pożywkę SD-tryptofan-leucyna i inkubować w 30°C przez 2-3 dni. Szalki te służą jako kontrola i są używane do obliczenia wydajności transformacji.
   20. Równomiernie podzielić pozostałe 4,8 mL zawiesiny komórek i wylać na duże (150 mm) szalki z pożywką SD-tryptofan-leucyna-adenina-histydyna, zawierające niezbędną ilość 3-AT określoną w teście N_ubG/I, i inkubować w 30°C przez 3-4 dni.
   21. Zawiesić pojedyncze kolonie (każda reprezentuje komórki zawierające potencjalną oddziałującą parę przynęta-ofiara) w 100 μL 0,9% NaCl i nanieść alykwozy 5 μL na pożywkę SD-tryptofan-leucyna-adenina-histydyna + X-Gal (wraz z 3-AT, jeśli jest wymagany). Hodować przez 2-4 dni. Krok ten służy jako druga runda selektywnego screeningu i pomaga w eliminacji wyników fałszywie dodatnich uzyskanych w pierwszej rundzie. Do dalszych analiz wybierane są tylko kolonie wykazujące silny wzrost i niebieski kolor.
3. Izolacja i sekwencjonowanie DNA ofiar
   1. Wyizolować plazmidowe DNA z niebieskich kolonii drożdży, stosując protokół miniprepu z modyfikacjami opisanymi wcześniej. Należy pamiętać o hodowaniu komórek wyłącznie na pożywce SD-tryptofan, aby wyselekcjonować plazmidy ofiar, a nie przynęty. W przypadku screeningów dających bardzo dużą liczbę trafień, na tym etapie korzystne może być użycie komercyjnego zestawu do miniprepu wysokoprzepustowego.
   2. Transformować wyizolowane plazmidowe DNA drożdży do kompetentnego szczepu E. coli odpowiedniego do propagacji plazmidów (np. DH5α, XL10 Gold) o wydajności transformacji co najmniej 1x10⁷ komórek/μg DNA. Należy pamiętać, że plazmidy ofiar można selekcjonować za pomocą ampicyliny.
   3. Wyizolować plazmidowe DNA z transformowanych E. coli za pomocą standardowej metody izolacji DNA lub zestawu komercyjnego. Ponownie, zestaw do miniprepu wysokoprzepustowego może być przydatny, jeśli liczba próbek jest duża. Amplifikacja DNA w E. coli znacznie zwiększa wydajność plazmidów i zapewnia obecność wystarczającej ilości DNA zarówno do sekwencjonowania, jak i dalszych analiz.
   4. Przeprowadzić sekwencjonowanie wyizolowanych plazmidów przy użyciu startera komplementarnego do sekwencji w obrębie N_ubG.
   5. Zestawić i przeanalizować wszystkie dane z sekwencjonowania, aby stworzyć wstępną listę interaktorów. Można to zrobić ręcznie lub automatycznie przy użyciu odpowiedniego oprogramowania.
4. Test zależności od przynęty
   1. Po stworzeniu wstępnej listy interaktorów ważne jest ponowne sprawdzenie oddziaływań i wyeliminowanie „promiskuitywnych” ofiar, które oddziałują/aktywują system reporterowy w sposób niezależny od tożsamości przynęty. Osiąga się to za pomocą Testu Zależności od Przynęty. W teście tym wszystkie zidentyfikowane interaktory są transformowane z powrotem do oryginalnego szczepu z przynętą, a także do szczepu zawierającego kontrolną sztuczną przynętę, składającą się z pojedynczej domeny transbłonowej połączonej ze znacznikiem C_ub-LexA-VP16. Transformację przeprowadza się zgodnie ze standardowym protokołem opisanym wcześniej, stosując pożywkę SD-leucyna zamiast YPAD oraz stałą pożywkę SD-tryptofan-leucyna w końcowym etapie wysiewu.
   2. Zawiesić pojedyncze kolonie z powyższych transformacji w 100 μL sterylnej ddH₂O i nanieść objętości 5 μL na pożywkę SD-tryptofan-leucyna-adenina-histydyna + X-Gal (wraz z 3-AT, jeśli jest wymagany). Szalki inkubuje się następnie przez 2-4 dni w 30°C. Idealnie należy wybrać wiele transformantów dla każdej ofiary, a zarówno oryginalną przynętę, jak i sztuczną przynętę należy nanieść na tę samą szalkę.
   3. Drożdże niosące sztuczną przynętę i ofiarę, które powodują aktywację systemu reporterowego (tj. wzrost i niebieski kolor), są uznawane za promiskuitywne, a tę konkretną ofiarę usuwa się z listy interaktorów.
   4. Ofiary, które powodują wzrost i niebieskie zabarwienie w drożdżach z badaną przynętą, ale nie ze sztuczną przynętą, potwierdzają to konkretne oddziaływanie. Jeśli jednak drożdże niosące ofiarę i badaną przynętę nie rosną, ofiara ta jest usuwana z listy interaktorów.
   5. Pozostałe ofiary stanowią kompletną listę interaktorów zidentyfikowanych w screeningu MYTH.

5. Dalsze badania

Po zakończeniu przesiewu MYTH należy przeprowadzić dalsze analizy w celu walidacji i określenia znaczenia biologicznego wykrytych oddziaływań. Konkretne badania do przeprowadzenia będą różnić się w zależności od przypadku i muszą zostać określone przez poszczególnych badaczy. Typowe przykłady prac kontynuacyjnych obejmują eksperymenty z ko-immunoprecypitacji oraz badania delecyjne w organizmie natywnym. Dodatkowo analiza obliczeniowa uzyskanych danych może być użyteczna w wykrywaniu wzorców oraz pomagać w identyfikacji potencjalnej istotności i roli, jaką mogą odgrywać poszczególne oddziaływania. W ten sposób technologia MYTH służy jako potężny „pierwszy krok” w kierunku identyfikacji i zrozumienia krytycznych oddziaływań funkcjonalnych białek błonowych. W połączeniu ze szczegółowymi badaniami kontynuacyjnymi oraz innymi ostatnio opracowanymi i nowymi technologiami, zapowiada się ona jako wartościowe narzędzie w odkrywaniu tajemnic komórki.

Rycina 1. Zasada działania rozszczepionej ubikwityny. a. Ubikwitynę można podzielić na dwie części: połowę C-końcową (C_ub) oraz połowę N-końcową (N_ubI). Części te ulegają spontanicznej rekonstytucji ze względu na wysokie powinowactwo do siebie. b. Punktowa mutacja N_ubI w pozycji 13, polegająca na zamianie izoleucyny na glicynę (N_ubG), zapobiega tej spontanicznej reasocjacji. c. W systemie MYTH białko C_ub jest połączone z białkiem przynętą (B), a białko ofiara jest połączone z N_ubG (A). Oddziaływanie białek A-B prowadzi do rekonstytucji pseudo-ubikwityny.

Rysunek 2. System błonowego dwuhybrydowego badania interakcji białek u drożdży (MYTH) oparty na rozszczepionej ubikwitynie.
Białko błonowe będące przedmiotem zainteresowania (przynęta) jest połączone z częścią C-końcową ubikwityny drożdżowej (C_Ub), która jest sprzężona z czynnikiem transkrypcyjnym. Wykorzystując bibliotekę cDNA lub gDNA, każde białko zakodowane w bibliotece (ofiara) jest połączone z odpowiadającym mu N-końcem fragmentu ubikwityny (N_UbG). Jeśli dwa białka nie oddziałują ze sobą, czynnik transkrypcyjny pozostaje na powierzchni błony (panel lewy). Jeśli jednak białka oddziałują, dwa fragmenty ubikwityny łączą się, co prowadzi do ich rozszczepienia przez proteazy specyficzne dla ubikwityny. Rozszczepienie uwalnia czynnik transkrypcyjny, co skutkuje ekspresją genów reporterowych (panel prawy)

Rysunek 3. Procedura MYTH.

Dyskusja

MYTH to pierwszy system wysokoprzepustowy umożliwiający identyfikację interakcji między pełnowymiarowymi białkami błonowymi a partnerami cytozolowymi lub związanymi z błoną. Był on wykorzystywany do badania białek błonowych z szerokiego zakresu organizmów [3-7]. Istnieją jednak szczegóły, które mogą wymagać dokładnego przeanalizowania, aby upewnić się, że badane białko nadaje się do analizy za pomocą systemu MYTH.

Wiele białek związanych z błoną jest kierowanych do błony plazmatycznej za pomo...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Glikol polietylenowy (PEG3350)	BioShop Canada	PEG335
Octan litu dwuwodny	BioShop Canada	LIA001
X-Gal (5-bromo-4-chloro-3-indolilo-β-D-galaktopyranosyd)	BioShop Canada	XGA001
N,N-dimetyloformamid	BioShop Canada	DMF 451
3-amino-1,2,4-triazol (3-AT)	BioShop Canada	ATT124
Fosforan sodu dwuzasadowy	BioShop Canada	SPD307
Wodorofosforan sodu	Fisher Scientific	BP329-500
DNA z plemników łososia	VWR international	CA80601-120
D-glukoza	BioShop Canada	GLU501
Bulion LB LENOX	BioShop Canada	LBL405
Podłoże azotowe dla drożdży (Yeast Nitrogen Base)	BioShop Canada	YNB406
Ekstrakt drożdżowy	BioShop Canada	YEX401
Pepton	BD Biosciences	211677
Bio-Tryptone	BioShop Canada	TRP402
Siarczan adeniny	BioShop Canada	ADS201
L-uracyl	BioShop Canada	URA241
L-treonina	BioShop Canada	THR002
L-histydyna	BioShop Canada	HIS200
L-metionina	BioShop Canada	MET222
L-walina	BioShop Canada	VAL201
L-fenyloalanina	BioShop Canada	PHA302
L-izoleucyna	BioShop Canada	ISO910
L-tyrozyna	BioShop Canada	TYR333
L-leucyna	BioShop Canada	LEU222
L-arginina	BioShop Canada	ARG006
L-tryptofan	Fisher Scientific	BP395-100
L-lizyna	BioShop Canada	LYS101
L-alanina	Fisher Scientific	BP369-100
Agar	BioShop Canada	AGR001
Szklane kuleczki sodowo-wapniowe	Produkty Biospec	11079105
Chlorek sodu	BioShop Canada	SLD002