Analiza typu pulse-chase łańcuchów cukrowych wiązanych glikozydowo do azotu (N-glikanów) w glikoproteinach komórek ssaków

Podsumowanie

Opisujemy metodę analizy zmian w glikanach typu N w początkowej fazie życia glikoprotein po ich biosyntezie w komórkach ssaków. Jest to realizowane poprzez analizę pulse-chase metabolicznie znakowanych glikanów, ich enzymatyczne uwalnianie z glikoprotein oraz badanie za pomocą HPLC.

Streszczenie

Przyłączanie Glc₃Man₉GlcNAc₂prekursor oligosacharydu do nowo powstających polipeptydów w ER jest powszechną modyfikacją białek wydzielniczych. Choć modyfikacja ta była wiązana z kilkoma procesami biologicznymi, wyłaniają się kolejne aspekty jej funkcji, a niedawne dowody wskazują na jej rolę w produkcji sygnałów dla kontroli jakości i transportu glikoprotein. W związku z tym zjawiska związane z glikanami N-zależnymi i ich przetwarzaniem są intensywnie badane. Metody opracowane niedawno do analiz proteomicznych znacznie poprawiły charakterystykę glikanów N-zależnych w glikoproteinach. Niemniej jednak nie dają one wglądu w dynamikę zaangażowanego przetwarzania łańcucha cukrowego. W tym celu stosuje się protokoły znakowania i analizy pulse-chase, które są zazwyczaj złożone i dają bardzo niskie wydajności. Opisujemy tutaj prostą metodę izolacji i analizy metabolicznie znakowanych oligosacharydów N-zależnych. Protokół opiera się na znakowaniu komórek za pomocą [2-³mannozą, denaturującą lizę i enzymatyczne uwalnianie oligosacharydów albo z konkretnie immunoprecypitowanego białka docelowego, albo z ogólnej puli glikoprotein poprzez sekwencyjne traktowanie endo H i N-glikozydazą F, a następnie filtrację molekularną (Amicon). W tej metodzie wyizolowane oligosacharydy służą jako materiał do analizy HPLC, która pozwala na rozróżnienie różnych struktur glikanów w zależności od liczby składających je jednostek monosacharydowych, z rozdzielczością pojedynczego monosacharydu. Stosując tę metodę, byliśmy w stanie zbadać profile N-glikanów bogatych w mannozę w całkowitych glikoproteinach komórkowych po eksperymencie pulse-chase w warunkach normalnych oraz w warunkach inhibicji proteasomów. Profile te porównano z profilami uzyskanymi z immunoprecypitowanego substratu degradacji związanej z ER (ERAD). Nasze wyniki sugerują, że większość glikoprotein komórkowych NIH 3T3 jest stosunkowo stabilna i że większość ich oligosacharydów jest przycinana do Man_9-8GlcNAc₂W przeciwieństwie do nich, niestabilne substraty ERAD są przycinane do Man_6-5GlcNAc₂a glikoproteiny zawierające te gatunki kumulują się po zahamowaniu degradacji proteasomalnej.

Protokół

Niniejszy protokół przeznaczony jest do analizy łańcuchów cukrowych całkowitych glikoprotein lub konkretnej, interesującej glikoproteiny. Procedura jest w zasadzie taka sama w obu przypadkach, z kilkoma modyfikacjami, o których mowa w całym protokole.

1. Do etykietowania metabolicznego glikanów wiązanych N potrzebne są podkonfluentne hodowle komórek ssaczych, hodowane przez noc w szalkach o średnicy 90 mm dla każdego próbnika (próbki mogą odpowiadać różnym punktom czasowym lub zabiegom). Protokół ten został zoptymalizowany dla komórek NIH 3T3.
2. Osusz komórki z glukozy poprzez inkubację w 5 ml świeżo przygotowanego, podgrzanego (37°C) pożywki bez glukozy, uzupełnionej 10% dializowaną surowicą cielęcą (FCS) oraz 4 mM pirogronianem sodu przez 5–15 minut.
3. Zastąp pożywkę osuszającą 1 ml podgrzanej (37°C) pożywki bez glukozy zawierającej 400 μCi [2-³H]-oznaczonej mannozy (niższe stężenie 65 μCi/ml stosuje się do oznaczania całkowitych glikoprotein), a następnie inkubuj komórki w standardowych warunkach hodowli tkankowej przez 1 godzinę.
4. Usuń pożywkę do etykietowania z każdej próbki i ostrożnie dodaj 2 ml zimnego (4°C) roztworu buforowego PBS do próbek odpowiadających punktowi „puls” i umieść je na lodzie (nazywane dalej próbkami „puls”), podczas gdy próbki odpowiadające etapowi „pogoń” należy przemyć trzykrotnie 2 ml podgrzanej (37°C) normalnej kompletnej pożywki, a następnie umieścić w inkubatorze CO₂ w 37°C z 5 ml podgrzanej standardowej pożywki na pożądane okresy „pogoni”.
5. Przemyj próbki „puls” (wcześniej umieszczone na lodzie) trzykrotnie 2 ml zimnego roztworu PBS. Następnie zeskrob komórki ze szalki za pomocą szpatułki do komórek w 2 ml PBS i przenieś je do probówki Eppendorfa o pojemności 2 ml.
6. Krótko odwirować komórki przy 16000Xg (6–10 sekund), odrzucić supernatant i zamrozić osad komórkowy w -80°C.
7. Wykonaj kroki 5 i 6 również dla próbek „pogoń” po zakończeniu czasu „pogoni”.
8. Wyjmij komórki z zamrażarki i zniszcz je poprzez dodanie 300 μl buforu A, krótkie wiryzowanie i 20-minutową inkubację na lodzie; w przypadku analizy całkowitych glikoprotein – poprzez 20-minutową inkubację na lodzie z buforem B, a następnie sonikację (4 razy, po 10 sekund, przy maksymalnej amplitudzie), a następnie zagotuj próbki przez 5 minut.
9. Owiń lizaty przy 16000Xg przez 20 minut w 4°C. Przenieś supernatant do nowej probówki Eppendorfa i odrzuć osad.
10. Jeśli analizowane są całkowite glikoproteiny, przejdź do filtracji molekularnej i deglikozylacji (krok 17). W celu immunoprecypitacji glikoproteiny H2a, pokazanej w tym przykładzie, dodaj do supernatantu z kroku 9 po 20 μl/próbka zawiesiny 1:1 kulek agarozowych A (Repligen) oraz po 3 μl/próbka naszego poliklonalnego przeciwciała króliczego anty-H2a skierowanego przeciw pożądanej glikoproteinie (w naszym przykładzie przeciwciało anty-H2a).
11. Inkubuj próbki przez 4–16 godzin w 4°C, stale mieszając poprzez powolne obracanie.
12. Owiń kulki przy 16000Xg przez 30 sekund i ostrożnie usuń supernatant za pomocą wakuum.
13. Przepłucz kulki, dodając 500 μl buforu D i wirując. Owiń jak w kroku 12 i usuń supernatant. Powtórz przemywanie trzykrotnie.
14. Dodaj 10 μl buforu denaturującego (dostarczonego w zestawie NEB endo-H) do osadu kulek i zagotuj próbki przez 5 minut (gdy analizowane są całkowite białka, deglikozylacja jest przeprowadzana na filtrze Microcon, krok 17).
15. Owiń kulki (16000Xg przez 30 sekund) i przenieś supernatant do nowej probówki Eppendorfa. Następnie dodaj do każdej próbki 0,5 μl enzymu endo H oraz 10 μl buforu reakcyjnego (dostarczonego również w zestawie NEB endo H) i inkubuj próbki przez 3 godziny w 37°C.
16. Aby oddzielić uwolnione glikany od białek, próbki rozcieńcz pięciokrotnie wodą dejonizowaną i nałóż na filtr molekularny (Microcon Ultracel YM30) o wartości odcięcia 30 kDa, a następnie odwiń przy 14000Xg przez 3 minuty. Dodaj 50 μl wody dejonizowanej i powtórz odwirowanie. Przemywanie to powtarzaj jeszcze dwukrotnie, zachowując przesącz.
17. Jeśli analizowane są całkowite glikoproteiny, nałóż supernatant lizatów (z kroku 9) na filtr Microcon. Przepłucz ekstrakt 100 μl buforu E, trzykrotnie poprzez wielokrotne odwirowanie przy 14000Xg przez 3 minuty. Dodaj 3 μl 10X buforu reakcyjnego endo H oraz 1,5 μl enzymu endo H do retentatu na filtrze Microcon i inkubuj przez 3 godziny w 37°C. Uwalniane glikany eluuje się wodą dejonizowaną przez trzykrotne odwirowanie, jak w kroku 16.
18. Jeśli to pożądane, retentaty z kroków 16 i 17, zawierające glikoproteiny oporne na endo H, inkubuje się następnie z 200 mU N-glikozydazy F w 15 μl buforu C, w 37°C przez 16 godzin. Elucja wodą dejonizowaną przeprowadzana jest jak w kroku 16.
19. Umieść probówkę zawierającą przesącz z reakcji endo H (kroki 16 i 17) w koncentratorze SpeedVac i całkowicie wysusz próbki (można to robić do temperatury 45°C w celu przyspieszenia procesu).
20. Aby przygotować próbki do HPLC, zawieś suche osady w 12 μl rozpuszczalnika HPLC (acetonitryl:woda, 60:40, 1% kwas fosforowy).
21. Ustaw urządzenie HPLC (podłączone do kolumny Spherisorb) na stały przepływ rozpuszczalnika (1 ml/min) i stałe ciśnienie (określona wartość pomiędzy 1000 a 2000 psi) oraz umieść kolektor frakcji tak, aby zmieniał probówkę co 1 minutę.
22. Wprowadź próbki do urządzenia HPLC i jednocześnie uruchom kolektor frakcji.
23. Zebranie 48 frakcji po 1 ml z każdego przebiegu próbki oraz z przebiegu mieszaniny oligosacharydów wzorcowych.
24. Przenieś po 500 μl z każdej frakcji do fiolki scyntylacyjnej i wymieszaj zawartość z 3 ml cieczy scyntylacyjnej mieszającej się z wodą.
25. Umieść fiolki w liczniku scyntylacyjnym i odczytaj wyniki.
26. Wyniki w cpm przedstawia się jako funkcję numeru frakcji.
27. Wartości cpm w obrębie szczytu odpowiadają określonym gatunkom glikanów w następujący sposób: frakcje 18–21 odpowiadają M5, frakcje 22–26 – M6, frakcje 27–31 – M7, frakcje 32–35 – M8, frakcje 36–39 – M9, frakcje 40–42 – G1M9, a frakcje 43–45 – G2M9.
28. Suma wartości cpm dla frakcji w obrębie każdego szczytu odzwierciedla absolutną ilość określonego gatunku glikanu. Aby skompensować fakt, że gatunki zawierające więcej reszt mannozy przyłączają więcej znacznika, „względną ilość molową” każdego gatunku glikanu oblicza się następująco: absolutną ilość każdego gatunku glikanu dzieli się przez liczbę reszt mannozy, które zawiera. Następnie tę wartość dzieli się przez sumę względnych ilości molowych wszystkich uzyskanych gatunków glikanów, aby uzyskać „procent całkowity” dla każdego konkretnego gatunku glikanu.

Czas chase (h)	0	4
Uwalniane z endo H (cpm) a	90000	16800
Uwalniane z N-glikozydazy F (cpm) b	20400	3900
Glikoproteiny w retentacie (cpm) c	371700	127695
Dolicholo-oligosacharydy w retentacie (cpm) d	4350	540
Dolicholo-oligosacharydy w retentacie (%) e	1.4 ± 0.7	0.2 ± 0.2

Tabela 1. Analiza uwalniania łańcuchów cukrowych N-związanych za pomocą deglikozydaz oraz obecności dolicholo-oligosacharydów w próbkach glikoprotein.

Zastosowano procedurę typu puls-chase do lizatu z komórek NIH 3T3. Po filtracji za pomocą Microcon, znakowane oligosacharydy N-związane uwalniano głównie za pomocą endo H po etykiecie puls (typ wysokomannozowy) oraz dodatkowo za pomocą N-glikozydazy F po okresie śledzenia (chase), co odpowiadało oligosacharydom typu złożonego (glikanom przetworzonym w aparacie Golgiego), opornym na działanie endo H. Analiza ilościowa wykazała, że dolicholo-oligosacharydy stanowiły pomijalną frakcję znacznika w początkowym retentacie.

Uwagi:

1. Komórki NIH 3T3 oznakowano krótkotrwałe za pomocą [2-³H] mannozy, a następnie poddano śledzeniu w kompletnym ośrodku. Po lizie komórek i filtracji przez Microcon YM30, oligosacharydy N-związane bogate w mannozę wydzielono z pozostałości poprzez inkubację z endo H.
2. Oporny na endo H materiał z pozostałości Microcon z punktu (a) poddano następnie inkubacji z N-glikozydazą F, a uwolnione oligosacharydy zmierzono za pomocą licznika scyntylacyjnego.
3. Pozostałości Microcon uzyskane jak w punkcie (a), przed traktowaniem endo H, ekstrahowano czterokrotnie chlorkowęglanem:metyloalkoholem:wodą w stosunku 10:10:3 w celu usunięcia prekursorowych glikolipidów, a materiał nieekstrahowany rozpuszczono w 1 M NaOH i zmierzono w liczniku scyntylacyjnym.
4. Dolicholo-oligosacharydy oczyszczono z ekstraktów z punktu (c) zgodnie z opisem w punkcie 1 i zmierzono w liczniku scyntylacyjnym.
5. Średnia z 3 eksperymentów dla procentu dolicholo-oligosacharydów (d) całkowitego cpm w pozostałości (c+d).

Przykładowe wyniki

Rycina 1. Analiza typu pulse-chase całkowitych glikoprotein NIH 3T3 w komórkach nieleczonych oraz po inhibicji proteasomu. Po 1-godzinnym etapie pulsowania z [2-³H] uzyskano oczekiwany profil, w którym część prekursorów glukozylowanych pozostała (Glc₂Man₉GlcNAc₂ (G2M9) oraz G1M9), ale większość znacznika występowała w gatunkach M9 i M8, przy czym ten drugi wynikał z usunięcia całej glukozy i jednego reszty mannozy (rycina 1 A). Nie wykryto wolnej mannozy ani innych małych prekursorów, co świadczy o dokładności oczyszczania. Po długim 8-godzinnym etapie chase zaobserwowano bardziej zaawansowane przycinanie do M7-6 oraz niewielką ilość M5, jednak głównymi gatunkami nadal były M9 i M8 (rycina 1 B). Gdy etap chase przeprowadzono w obecności inhibitora proteasomu (30 μM MG-132), zaobserwowano jedynie niewielkie gromadzenie się tych samych przyciętych gatunków (rycina 1 C).

Rycina 2. Ilościowa analiza łańcuchów cukrowych substratu ERAD w porównaniu z całkowitą pulą glikoprotein. (A) W doświadczeniu podobnym do przedstawionego na rycinie 1, obliczono względne stężenia molowe poszczególnych gatunków oligosacharydów na podstawie zawartości mannozy. Przeliczono wartości cpm uzyskane dla każdego gatunku glikanu, a następnie wykreślono procent każdej frakcji względem sumy wszystkich frakcji w funkcji czasu inkubacji, jako średnią z dwóch eksperymentów. (B) Podobnie jak w (A), z tą różnicą, że analizowano glikany wydzielone z substratu ERAD ASGPR H2a po etapie znakowania i inkubacji trwającej do 4 h, w obecności lub w nieobecności inhibitora proteasomu MG-132. (C) Porównanie wartości po 4-godzinnej inkubacji w obecności MG-132 z eksperymentów (A) i (B) dla ASGPR H2a oraz puli glikoprotein. (D) Schemat procesów przycinania łańcuchów N-związanych cukrów w siateczce śródplazmatycznej. Procesy przycinania cukrów prowadzące do powstania form z 6-5 mannozami przyłączonymi do białek (R), które są kierowane do ERAD, w porównaniu z formami 9-8 mannozowymi, które opuszczają siateczkę i kierują się do aparatu Golgiego i dalej. Wyniki wskazują, że proces ERAD wiąże się z przycinaniem mannozy z N-glikanów, prowadzącym do powstania gatunków zawierających 5-6 reszt mannozy.

Dyskusja

Analiza pulse-chase glikanów w żywych komórkach z rozdzielaniem metodą HPLC zapewnia metodę badania dynamiki zmian strukturalnych oligosacharydów w całym cyklu życia glikoproteiny. Coraz więcej dowodów wskazuje na to, że takie zmiany uczestniczą w generowaniu sygnałów dla systemów fałdowania w ER, kontroli jakości oraz transportu wewnątrzkomórkowego ^2-5. Metodę tę można zastosować nie tylko w odniesieniu do konkretnej, interesującej badacza glikoproteiny, ale również do analizy dynamiki struktury wszystkich gl...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
kontroler systemu dozowania wielu rozpuszczalników 600E	Waters	WAT062710
Acetonitryl LiChrosolv (stopnia gradientowego do chromatografii cieczowej)	Merck & Co., Inc.	1.0003
Microcon Amicon Ultra 0,5 ml 30K lub Centricon ultracel YM-30	EMD Millipore	UFC503024 lub 4208
Koncentrator 5301, w tym rotor kątowy stały 48 x 1,5 / 2,0 ml	Eppendorf	5301 000.016
Dializowany F–płodowe serum cielęce	Przemysł biotechnologiczny	04-011-1A
Dulbecco’zmodyfikowane podłoże Eagle’pożywka Medium	GIBCO, by Life Technologies	41965039
Dulbecco’zmodyfikowane podłoże Eagle’podłoże pozbawione glukozy	Sigma-Aldrich	D5030
Dulbecco’bufor fosforanowy (PBS)	Sigma-Aldrich	D1408
Sól sodowa EDTA (Titriplex III)	Merck & Co., Inc.	1084180250
Zestaw Endo Hf (1 000 000 jednostek/ml)	New England Biolabs	p0703S
F–płodowa surowica cielęca (FCS)	Przemysł biologiczny	04-001-1A
zbieracz frakcji Frac-100	Amersham	18-1000-77
Systemy do pomiaru z wykorzystaniem migotania w cieczach LS 6500	Beckman Coulter Inc.	510720
Mannoza, D-[2-3H(N)]- (aktywność właściwa: 15-30 Ci/mmol)	PerkinElmer, Inc.	NET570A
N-karbobenzoksylo-leucylo-leucylo-leucinal (MG-132)	Calbiochem	474790
N-glikozydaza F (1000 jednostek/ml)	Grupa Roche	11365177
N-oktyloglukozyd	Sigma-Aldrich	O3757
komórki NIH 3T3	American Type Culture Collection	CRL-1658
Opti-Flour	PerkinElmer, Inc.	6013199
Roztwór kwasu fosforowego (49–51%, do HPLC)	Fluka	79607
Koktajl inhibitorów proteaz	Sigma-Aldrich	P2714
kulki Protein A-Sepharose	Repligen	IPA300
Królicze przeciwciało poliklonalne anty-H2 karboksyterminalne 6
Deoksycholan sodu	Sigma-Aldrich	30970
Dodecylosiarczan sodu	Bio-Rad	161-0301
Fosforan sodu	Sigma-Aldrich	342483
Roztwór pirogronianu sodu (100mM)	Sigma-Aldrich	S8636
Kolumna Spherisorb NH2, 5 μm, 4,6 x 250 mm	Waters	PSS831115
Triton X-100	VWR	306324N
procesory ultradźwiękowe Vibra-Cell VCX 750	Sonics and Materials, Inc.	690-003
Bufor A: 1% Triton X-100, 0,5% m/v deoksycholan sodu, koktajl inhibitorów proteaz 2% v/v w PBS
Bufor B: 0,5% w/v SDS, koktajl inhibitorów proteaz 2% v/v w PBS
Bufor C: Bufor reakcyjny N-glikozydazy F: 200 mM Na3PO4, pH 8,0, 4 mM EDTA, 1,5% N-octylo-glukozyd
linie komórkowe NIH 3T3 stabilnie ekspresujące H2a 6
Bufor D: 0,5% Triton X-100, 0,25% m/v deoksycholan sodu, 0,5% m/v SDS, koktajl inhibitorów proteaz 2% v/v w PBS
Bufor E: 0,5% m/v SDS, 1% v/v 2-merkaptoetanolu–etanol, koktajl inhibitorów proteaz 2% v/v w PBS
2-merkapto–etanol	Sigma-Aldrich	M3148