$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Poniższy protokół jest przeznaczony do analizy łańcuchów cukrowych całkowitych glikoprotein lub konkretnej, badanej glikoproteiny. Procedura w obu przypadkach jest w zasadzie taka sama, z kilkoma modyfikacjami opisanymi w treści protokołu.
- Do znakowania metabolicznego glikanów typu N- unlink najlepiej użyć subkonfluencyjnej hodowli komórek ssaków hodowanych przez noc w szalce 90 mm dla każdej próbki (próbki mogą reprezentować różne punkty czasowe lub zastosowane traktowania). Niniejszy protokół został zoptymalizowany dla komórek NIH 3T3.
- Poddać komórki głodzeniu glukozowemu poprzez inkubację w 5 ml świeżo przygotowanego, uprzednio ogrzanego (37°C) medium bezglukozowego, uzupełnionego o 10% dializowanego FCS oraz 4 mM pirogronianu sodu, przez 5-15 minut.
- Zastąpić medium do głodzenia 1 ml uprzednio ogrzanego (37°C) medium bezglukozowego zawierającego 400 μCi mannozy znakowanej [2-3H] (do znakowania całkowitej puli glikoprotein stosuje się niższe stężenie 65 μCi/ml) i inkubować komórki w standardowych warunkach hodowli tkankowych przez 1 godzinę.
- Usunąć medium znakujące z każdej próbki i ostrożnie dodać 2 ml PBS o temperaturze 4°C do próbek odpowiadających fazie impulsu (pulse), a następnie umieścić je na lodzie (próbki te określa się jako pulse). Próbki odpowiadające fazie pogoni (chase) należy przepłukać 3 razy 2 ml uprzednio ogrzanego (37°C) standardowego kompletnego medium hodowlanego, a następnie umieścić w inkubatorze CO2 w temperaturze 37°C z 5 ml uprzednio ogrzanego zwykłego medium na wymagany czas pogoni.
- Przepłukać próbki pulse (wcześniej umieszczone na lodzie) 3 razy 2 ml lodowatego PBS. Następnie komórki zebrać z szalki za pomocą skrobaka komórkowego w 2 ml PBS i przenieść do probówki Eppendorf o pojemności 2 ml.
- Odwirować krótko komórki przy 16000Xg (6-10 s), usunąć supernatant i zamrozić osad komórkowy w temperaturze -80°C.
- Wykonać kroki 5 i 6 również dla próbek chase po zakończeniu czasu pogoni.
- Wyjąć komórki z zamrażarki i poddać je lizie poprzez dodanie 300 μl buforu A, krótkie wymieszanie w wortexie i inkubację przez 20 min na lodzie lub, w przypadku analizy całkowitej puli glikoprotein, poprzez inkubację przez 20 min na lodzie z buforem B, a następnie sonikację (4 razy po 10 s, maksymalna amplituda), po czym gotować próbki przez 5 min.
- Odwirować lizaty przy 16000Xg przez 20 min w temperaturze 4°C. Przenieść supernatant do nowej probówki Eppendorf i usunąć osad.
- W przypadku analizy całkowitych glikoprotein przejść do filtracji molekularnej i deglikozylacji (krok 17). Do immunoprecypitacji glikoproteiny H2a przedstawionej w tym protokole, dodać do supernatantu z kroku 9 20 μl/próbkę zawiesiny 1:1 kulek agarozy z białkiem A (Repligen) oraz 3 μl/próbkę naszego króliczego poliklonalnego przeciwciała anty-H2a dla pożądanej glikoproteiny (w naszym przykładzie przeciwciało anty-H2a).
- Inkubować próbki przez 4-16 godzin w temperaturze 4°C, stale mieszając poprzez powolną rotację.
- Odwirować kulki przy 16000Xg przez 30 sekund i ostrożnie usunąć supernatant za pomocą odkurzacza próżniowego.
- Przepłukać kulki, dodając 500 μl buforu D i mieszając w wortexie. Wirować jak w kroku 12 i usunąć supernatant. Powtórzyć płukanie 3 razy.
- Dodać 10 μl buforu denaturującego (dołączonego do zestawu NEB endo-H) do osadu z kulek i gotować próbki przez 5 min (przy analizie całkowitego białka deglikozylację przeprowadza się na filtrze Microcon, krok 17).
- Odwirować kulki (16000Xg przez 30 sekund) i przenieść supernatant do nowej probówki Eppendorf. Następnie do każdej próbki dodać 0,5 μl enzymu endo H oraz 10 μl buforu reakcyjnego (również dołączonego do zestawu NEB endo H) i inkubować próbki w temperaturze 37°C przez 3 godziny.
- Aby oddzielić uwolnione glikany od białek, próbkę rozcieńczyć 5-krotnie wodą dejonizowaną i nanieść na filtr molekularny (Microcon Ultracel YM30) z progiem odcięcia 30 kDa, a następnie odwirować przy 14000Xg przez 3 min. Dodać 50 μl wody dejonizowanej i powtórzyć wirowanie próbek. To płukanie powtórzyć jeszcze 2 razy, zbierając przefiltrowany roztwór.
- W przypadku analizy całkowitych glikoprotein nanieść supernatant lizatów (z kroku 9) na filtr Microcon. Przepłukać ekstrakt 100 μl buforu E, 3 razy poprzez powtarzające się wirowanie przy 14000Xg przez 3 min. Do retentatu na filtrze Microcon dodać 3 μl 10X buforu reakcyjnego endo H i 1,5 μl enzymu endo H, a następnie inkubować przez 3 godziny w temperaturze 37°C. Uwolnione glikany eluować wodą dejonizowaną poprzez 3 powtórzone wirowania, analogicznie do kroku 16.
- W razie potrzeby retentaty z kroków 16 i 17, zawierające glikoproteiny oporne na endo H, inkubować z 200 mU N-glikozydazy F w 15 μl buforu C, w temperaturze 37°C przez 16 h. Elucję wodą dejonizowaną przeprowadzić jak w kroku 16.
- Umieścić probówkę zawierającą przefiltrowany roztwór z reakcji endo H (kroki 16 i 17) w koncentratorze SpeedVac i całkowicie wysuszyć próbki (proces ten można przyspieszyć, stosując temperaturę do 45°C).
- Aby przygotować próbki do analizy HPLC, resuspender wysuszone osady w 12 μl rozpuszczalnika HPLC (acetonitryl:woda, 60:40, 1% kwasu fosforowego).
- Ustawić urządzenie HPLC (połączone z kolumną Spherisorb) na stały przepływ rozpuszczalnika (1 ml/min) i ciśnienie (konkretna wartość między 1000 a 2000 psi) oraz ustawić kolektor frakcji tak, aby zmieniać probówkę co 1 minutę.
- Wprowadzić próbki do urządzenia HPLC i jednocześnie uruchomić kolektor frakcji.
- Zebrać 48 frakcji po 1 ml z każdego przebiegu próbki oraz z przebiegu standardowej mieszaniny oligosacharydów.
- Przenieść 500 μl z każdej frakcji do fiolki scyntylacyjnej i zmieszać zawartość z 3 ml mieszalnej z wodą cieczy scyntylacyjnej.
- Wstawić fiolki i odczytać wynik w liczniku scyntylacyjnym.
- Odczyt cpm nanieść jako funkcję numeru frakcji.
- Wartości cpm w obrębie piku reprezentują konkretne gatunki glikanów w następujący sposób: frakcje 18-21 odpowiadają M5, frakcje 22-26 M6, frakcje 27-31 M7, frakcje 32-35 M8, frakcje 36-39 M9, frakcje 40-42 G1M9, a frakcje 43-45 G2M9.
- Suma wartości cpm dla frakcji w obrębie każdego piku odzwierciedla bezwzględną ilość konkretnego gatunku glikanu. Aby skompensować fakt, że gatunki zawierające więcej reszt mannozy przyjmują więcej znacznika, oblicza się „względną ilość molową” każdego gatunku glikanu w następujący sposób: bezwzględną ilość każdego gatunku glikanu dzieli się przez liczbę zawartych w nim reszt mannozy. Następnie wartość tę dzieli się przez sumę względnych ilości molowych wszystkich uzyskanych gatunków glikanów, aby otrzymać „procent całkowitej ilości” dla każdego konkretnego gatunku glikanu.
| Czas wymywania (h) | 0 | 4 |
| Uwolnione przez endo H (cpm) a | 90000 | 16800 |
| Uwolnione przez N-glikozydazę F (cpm) b | 20400 | 3900 |
| Glikoproteiny w retentacie (cpm) c | 371700 | 127695 |
| Oligosacharydy dolicholowe w retentacie (cpm) d | 4350 | 540 |
| Oligosacharydy dolicholowe w retentacie (%) e | 1.4 ± 0.7 | 0.2 ± 0.2 |
Tabela 1. Analiza uwalniania łańcuchów cukrowych typu N przez deglikozydazy oraz obecności dolichol-oligosacharydów w próbkach glikoprotein.
Zastosowaliśmy procedurę pulse-chase do lizatu z komórek NIH 3T3. Po filtracji Microcon, znakowane oligosacharydy N-połączone były uwalniane głównie za pomocą endo H po etapie pulsacyjnego znakowania (typ wysokomannozowy), a następnie po okresie pogoni za pomocą N-glikozydazy F, co odpowiadało oligosacharydom opornym na endo H (glikanom typu złożonego, przetworzonym w aparacie Golgiego). Analiza ilościowa wykazała, że dolichol-oligosacharydy stanowiły nieistotną frakcję znacznika w początkowym retentacie.
Uwagi:
- Komórki NIH 3T3 poddano znakowaniu impulsowemu [2-3H] mannozą, a następnie fazie wypłukiwania (chase) w pełnej pożywce. Po lizie komórek i filtracji przez Microcon YM30, wysokomannozowe oligosacharydy N-wiązane uwolniono z retentatów poprzez inkubację z endo H.
- Materiał oporny na endo H w retentatach Microcon z punktu (a) inkubowano następnie z N-glikozydazą F, a uwolnione oligosacharydy zmierzono w liczniku scyntylacyjnym.
- Retentaty Microcon otrzymane jak w punkcie (a) przed traktowaniem endo H ekstrahowano 4 razy mieszaniną chloroform:metanol:woda 10:10:3 w celu usunięcia prekursorowych glikolipidów, a materiał nieekstrahowany rozpuszczono w 1N NaOH i zmierzono w liczniku scyntylacyjnym.
- Dolichol-oligosacharydy oczyszczono z ekstraktów z punktu (c) zgodnie z opisem w punkcie 1 i zmierzono w liczniku scyntylacyjnym.
- Średnia z 3 eksperymentów dla procentowego udziału dolichol-oligosacharydów (d) w całkowitej liczbie cpm w retentacie (c+d).
Reprezentatywne wyniki
Rycina 1. Analiza pulse-chase całkowitych glikoprotein NIH 3T3 w komórkach nieleczonych oraz po inhibicji proteasomów. Po 1h znakowania pulsacyjnego [2-3H] otrzymano oczekiwany profil, w którym pozostały niektóre prekursory glukozowane (Glc2Man9GlcNAc2 (G2M9) i G1M9), jednak większość znacznika występowała w formach M9 i M8, z których ta ostatnia była wynikiem usunięcia wszystkich reszt glukozy oraz jednej reszty mannozy (Rycina 1 A). Nie wykryto wolnej mannozy ani innych małych prekursorów, co świadczy o dokładności oczyszczania. Po dość długim, 8-godzinnym okresie pogoni (chase) nastąpiło bardziej rozległe przycinanie do form M7-6 i niewielkiej ilości M5, jednak głównymi formami nadal pozostawały M9 i M8 (Rycina 1 B). W przypadku przeprowadzenia pogoni w obecności inhibitora proteasomów (30 μM MG-132) odnotowano jedynie niewielką akumulację tych samych przyciętych form (Rycina 1 C).
Rysunek 2. Analiza ilościowa łańcuchów cukrowych substratu ERAD w porównaniu z całkowitą pulą glikoprotein. (A) W eksperymencie podobnym do tego przedstawionego na Rysunku 1, względne ilości molowe każdego rodzaju oligosacharydu obliczono na podstawie zawartości mannozy. Przeliczono wartości cpm uzyskane dla każdego rodzaju glikanu, a następnie wykreślono procent każdego rodzaju w stosunku do całkowitej sumy względnych ilości molowych wszystkich obecnych gatunków jako funkcję czasu chase dla średniej z dwóch eksperymentów. (B) Podobnie jak w (A), z wyjątkiem tego, że glikany uwolnione z substratu ERAD ASGPR H2a analizowano po znakowaniu pulsacyjnym i czasie chase do 4h, w obecności lub braku inhibitora proteasomów MG-132. (C) Wartości dla chase 4h w obecności MG-132 z (A) i (B) zestawiono dla ASGPR H2a oraz puli glikoprotein. (D) Schemat procesów przycinania łańcuchów cukrowych N-glikanów w ER. Procesy przycinania cukrów prowadzące do powstania form M6-5 związanych z białkami (R) kierowanymi do ERAD w porównaniu do form M9-8 w białkach opuszczających ER do aparatu Golgiego i dalej. Wyniki wskazują, że proces ERAD wiąże się z przycinaniem mannozy z N-glikanów, co prowadzi do powstania form z pozostałymi 5-6 resztami mannozy.