Przygotowanie próbki MALDI: metoda ultra cienkowarstwowa

Summary

Ten film demonstruje przygotowanie ultracienkiej warstwy matrycy/analitu do analizy peptydów i białek za pomocą spektrometrii mas z desorpcją laserową wspomaganą desorpcją i desorpcją laserową (MALDI-MS).

Abstract

Ten film demonstruje przygotowanie ultracienkiej warstwy matrycy/analitu do analizy peptydów i białek za pomocą spektrometrii mas z desorpcją laserową wspomaganą matrycą (MALDI-MS) ^1,2. Metoda ultracienkowarstwowa polega na wytworzeniu warstwy substratu z kryształów matrycy (kwas alfa-cyjano-4-hydroksycynamonowy) na płytce próbki, która służy jako podłoże do późniejszej krystalizacji mieszaniny matrycy/analitu. Zaletą metody ultracienkiej warstwy w porównaniu z innymi metodami osadzania próbek (np. wysuszonymi kroplami) jest to, że zapewnia ona (i) większą tolerancję na zanieczyszczenia, takie jak sole i detergenty, (ii) lepszą rozdzielczość oraz (iii) wyższą jednorodność przestrzenną. Metoda ta jest szczególnie przydatna do dokładnego oznaczania masy białek. Protokół został początkowo opracowany i zoptymalizowany do analizy białek błonowych i wykorzystany do skutecznej analizy kanałów jonowych, transporterów metabolitów i receptorów, zawierających od 2 do 12 domen transbłonowych ². Od czasu pierwotnej publikacji okazało się również, że jest równie przydatny do analizy rozpuszczalnych białek. Rzeczywiście, wykorzystaliśmy go do wielu białek o szerokim zakresie właściwości, w tym tych o masach cząsteczkowych sięgających 380 kDa ^3. Jest to obecnie nasza metoda z wyboru do analizy masy cząsteczkowej wszystkich białek. Opisana procedura niezmiennie zapewnia wysokiej jakości widma, jest czuła, solidna i łatwa do wdrożenia.

Protocol

Bardzo ważne jest, aby podczas przygotowywania cienkiej warstwy nosić rękawice bezpudrowe.

Czyszczenie płytki próbki

1. Użyj płytki próbnej MALDI ze stali nierdzewnej lub złota.
2. Umyj MeOH i delikatnie przetrzyj chusteczką Kimwipe. Nie pocieraj ani nie szoruj powierzchni za pomocą Kimwipe, aby zapobiec zarysowaniu powierzchni.
3. Umyć za pomocą_H2Oi delikatnie przetrzeć chusteczką Kimwipe.
4. Umyj MeOH i delikatnie przetrzyj chusteczką Kimwipe.
5. W razie potrzeby powtórz cykl czyszczenia MeOH/H₂O/MeOH, zawsze kończąc się MeOH.
6. Upewnij się, że na talerzu nie pozostały żadne plamy ani pozostałości. Jeśli są plamy duchowe, spłucz płytkę wodą dejonizowaną, jednocześnie pocierając powierzchnię dłonią w rękawiczce (nie pocieraj chusteczkami Kimwipes). Powtórzyć cykl czyszczenia MeOH/H₂O/MeOH.
7. Płytkę należy zużyć natychmiast po umyciu.

Przygotowanie roztworu cienkowarstwowego podłoża

1. Wymieszaj 1 część nasyconego 4-HCCA (2 części ACN, 1 część wody i 0,1% końcowego TFA) i 3 części izopropanolu.
   
   nuta: Cienkowarstwowy roztwór podłoża jest bardzo stabilny i może być przechowywany w temperaturze pokojowej w ciemności przez rok. Może być również przechowywany w temperaturze 4 °C.

Tworzenie cienkiej warstwy podłoża

1. Nanieść 20-50 μl cienkowarstwowego roztworu podłoża na lewą środkową stronę płytki i rozprowadzić bokiem końcówki pipety. Przesuwanie w jednym kierunku.
2. Po wyschnięciu roztworu rozpuszczalnik organiczny bardzo szybko odparowuje, pozostawiając drobne kropelki wody na powierzchni płytki. W tym momencie owiń palec wskazujący warstwą Kimwipe i początkowo delikatnie osusz nim powierzchnię płytki.
3. Gdy powierzchnia zostanie uwolniona od kropelek wody, przetrzyj całą płytkę jednokierunkowymi ruchami zamiatającymi za pomocą Kimwipe.
   
   nuta: Jeśli roztwór nie rozprowadzi się wystarczająco po powierzchni płytki, zwiększ skład ACN i odtwórz cienką warstwę. Niektóre parametry, które mogą wpływać na rozprowadzanie roztworu, to wilgotność i temperatura otoczenia.
   
   nuta: W przypadku złotych płytek warstwa zwykle pojawia się jako żółtawe odbicie, w zależności od kąta patrzenia i światła. W przypadku blach stalowych zwykle widoczna jest tylko krawędź warstwy.
    
4. Wyczyść krawędzie płytki świeżym płynem Kimwipe przed umieszczeniem go w uchwycie płytki, aby zapobiec zanieczyszczeniu matrycy instrumentu.

Przygotowanie roztworu matrycowego

1. Nasycony 4-HCCA w FWI (3 części kwasu mrówkowego, 1 część wody, 2 części izopropanolu) jest zalecany do analizy zarówno białek błonowych, jak i rozpuszczalnych. Może być również stosowany w szczególnych przypadkach do analizy bardzo hydrofobowych dużych peptydów (M >4,000 u). Upewnij się, że roztwór matrycy używany do nakrapiania białek nie przekracza ~50% zawartości organicznej, ponieważ całkowicie rozpuści cienkowarstwowy substrat, niwecząc zalety metody.

Test cienkowarstwowego podłoża

1. Umieścić 0,5 μl roztworu matrycy na płytce. Na granicy faz cienkiej warstwy i kropli pojawi się białawy osad. Gdy warstwa ta całkowicie pokryje dno kropli, zwykle w ciągu 10-15 sekund, należy odessać nadmiar cieczy za pomocą przewodu próżniowego. Jeśli formowanie się osadu trwa dłużej niż 30 sekund, oznacza to, że może to oznaczać, że może wystąpić problem z cienkowarstwowym podłożem i/lub roztworem matrycy.

Przykładowa aplikacja

1. Stężenie analitu w roztworach wyjściowych powinno mieścić się w zakresie od 10 do 1000 μM.
2. Rozcieńczyć roztwór analitu w roztworze matrycowym do końcowego stężenia analitu między 0,2–2 μM. Na przykład zacznij od 1 μl próbki i 9 μl roztworu matrycowego.
   
   nuta: Upewnij się, że matryca jest bliska nasycenia w roztworze końcowym, w przeciwnym razie ponownie rozpuścisz cienkowarstwowe podłoże.
   
   nuta: Stężenia analitów wymagane do uzyskania przyzwoitych sygnałów w dużym stopniu zależą od złożoności i składu roztworu (np. zanieczyszczeń) oraz jonizacji analitu.
   
   nuta: Jeśli jednoetapowe rozcieńczanie nie daje dobrych wyników, należy spróbować innego etapu rozcieńczania. Chociaż jest to sprzeczne z intuicją, wysoce skoncentrowane roztwory analitów rzadko dają dobre widma.
   
   Uwaga: Białka błonowe zwykle wymagają większych rozcieńczeń.
    
3. Umieścić 0,5 μl mieszaniny próbka/matryca na płytce. Na granicy faz cienkiej warstwy i kropelki utworzy się białawy osad. Ten osad to kokrystalizacja matrycy i analitu. Gdy warstwa ta całkowicie pokryje dno kropli, zwykle w ciągu 10-15 sekund, należy odessać nadmiar cieczy za pomocą przewodu próżniowego. Jeśli uformowanie się osadu trwa dłużej niż 30 sekund, może to wskazywać na obecność zanieczyszczenia, które zapobiega krystalizacji lub analit jest zbyt skoncentrowany.

Aplikacja kalibru

1. Przygotować mieszaninę kalibru/matrycy w podobny sposób o końcowym stężeniu kalibru między 0,1–0,5 μM.
2. Umieścić mieszaninę kalibru 0,5 μl na matrycy na płytce w bliskiej odległości od plamek próbki. Ta fizyczna bliskość jest wykorzystywana w pseudo-wewnętrznej procedurze kalibracji, w której płytka jest przesuwana z miejsca próbki do punktu kalibru podczas akwizycji próbki, aby dodać kilka strzałów laserowych kalibrów do spektrum. Takie podejście gwarantuje większą dokładność wzorcowania masy niż tylko kalibracja zewnętrzna.

Etap prania

1. Umyj każde miejsce około 2 μl lodowatego 0,1% wodnego roztworu TFA. Odessać nadmiar cieczy za pomocą przewodu próżniowego.

Akwizycja widm masowych

1. Jesteś teraz gotowy do uzyskania widm masowych. Jeśli używasz roztworu macierzy FWI, musisz uzyskać widma tak szybko, jak to możliwe, aby zapobiec nieodwracalnym modyfikacjom analitu, takim jak formylacja.