$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Podczas przygotowywania cienkiej warstwy bardzo ważne jest noszenie rękawiczek bezpudrowych.
Czyszczenie płytki z próbką
- Użyć płytki do próbek MALDI wykonanej ze stali nierdzewnej lub złota.
- Przemyć MeOH i delikatnie wytrzeć chusteczką Kimwipe. Nie należy pocierać ani szorować powierzchni chusteczką, aby uniknąć jej zarysowania.
- Przemyć H2O i delikatnie wytrzeć chusteczką Kimwipe.
- Przemyć MeOH i delikatnie wytrzeć chusteczką Kimwipe.
- W razie potrzeby powtórzyć cykl czyszczenia MeOH/H2O/MeOH, zawsze kończąc etapem z MeOH.
- Upewnić się, że na płytce nie pozostały żadne ślady („ghost spots”) ani osady. W przypadku wystąpienia takich śladów, opłukać płytkę wodą dejonizowaną, pocierając powierzchnię dłonią w rękawiczce (nie używać chusteczek Kimwipe). Powtórzyć cykl czyszczenia MeOH/H2O/MeOH.
- Użyć płytki niezwłocznie po praniu.
Przygotowanie roztworu do podłoża cienkowarstwowego
- Wymieszać 1 część nasyconego 4-HCCA (2 części ACN, 1 część wody i 0,1% końcowego stężenia TFA) z 3 częściami izopropanolu.
Uwaga: Roztwór do nanoszenia cienkiej warstwy na podłoże jest bardzo stabilny i może być przechowywany w temperaturze pokojowej, w ciemności, przez rok. Można go również przechowywać w temperaturze 4 °C.
Przygotowanie podłoża z cienkiej warstwy
- Nanieś 20-50 µL roztworu podłoża do cienkiej warstwy na lewą środkową część płytki i rozprowadź go bokiem końcówki pipety. Wykonuj ruchy w jednym kierunku.
- W miarę wysychania roztworu rozpuszczalnik organiczny odparowuje bardzo szybko, pozostawiając na powierzchni płytki drobne kropelki wody. W tym momencie owiń palec wskazujący warstwą chusteczki Kimwipe i początkowo delikatnie osusz nim powierzchnię płytki.
- Gdy powierzchnia zostanie oczyszczona z kropel wody, przetrzyj całą płytkę jednokierunkowymi ruchami za pomocą chusteczki Kimwipe.
Uwaga: Jeśli roztwór nie rozprowadza się w wystarczającym stopniu po powierzchni płytki, zwiększ zawartość ACN i ponownie przygotuj cienką warstwę. Parametrami, które mogą wpływać na rozprowadzanie roztworu, są m.in. wilgotność i temperatura otoczenia.
Uwaga: W przypadku płytek złotych warstwa zazwyczaj przejawia się jako żółtawy odblask, w zależności od kąta widzenia i oświetlenia. W przypadku płytek stalowych zazwyczaj widoczna jest tylko krawędź warstwy.
- Przed umieszczeniem płytki w uchwycie oczyść jej krawędzie nową chusteczką Kimwipe, aby zapobiec zanieczyszczeniu instrumentu matrycą.
Przygotowanie roztworu matrycy
- Nasycony roztwór 4-HCCA w FWI (3 części kwasu mrawkowego, 1 część wody, 2 części izopropanolu) jest zalecany do analizy zarówno białek błonowych, jak i rozpuszczalnych. Może być on również stosowany w szczególnych przypadkach do analizy bardzo hydrofobowych dużych peptydów (M >4,000 u). Należy upewnić się, że roztwór matrycy używany do nanoszenia białek nie zawiera więcej niż ~50% składników organicznych, ponieważ spowodowałoby to całkowite rozpuszczenie podłoża z cienkiej warstwy, niwelując zalety tej metody.
Test podłoża z cienkiej warstwy
- Nanieś 0,5 µL roztworu matrycy na płytkę. Na granicy między cienką warstwą a kropelką pojawi się białawy osad. Gdy warstwa ta całkowicie pokryje dno kropelki, zazwyczaj w ciągu 10–15 s, odessij nadmiar cieczy za pomocą linii próżniowej. Jeśli utworzenie osadu trwa dłużej niż 30 s , może to wskazywać na problem z podłożem cienkiej warstwy i/lub roztworem matrycy.
Nakładanie próbki
- Stężenie anality w roztworach wyjściowych powinno mieścić się w przedziale od 10 do 1000 µM.
- Rozcieńcz roztwór anality w roztworze matrycy do końcowego stężenia anality wynoszącego 0,2–2 µM. Na przykład, zacznij od 1 µL próbki i 9 µL roztworu matrycy.
Uwaga: Upewnij się, że matryca w roztworze końcowym jest bliska nasycenia, w przeciwnym razie dojdzie do ponownego rozpuszczenia podłoża cienkowarstwowego.
Uwaga: Stężenia anality wymagane do uzyskania zadowalających sygnałów są w dużym stopniu zależne od złożoności i składu roztworu (np. zanieczyszczeń) oraz jonizowalności anality.
Uwaga: Jeśli rozcieńczenie jednostopniowe nie przynosi dobrych wyników, należy spróbować kolejnego etapu rozcieńczania. Choć może wydawać się to nieintuicyjne, silnie stężone roztwory anality rzadko dają dobre widma.
Uwaga: Białka błonowe zazwyczaj wymagają większych rozcieńczeń.
- Nanieś 0,5 µL mieszaniny próbki z matrycą na płytkę. Na granicy między cienką warstwą a kroplą utworzy się białawy osad. Osad ten jest wynikiem kokrystalizacji matrycy i anality. Gdy warstwa ta całkowicie pokryje dno kropli, zazwyczaj w ciągu 10–15 s, odessaj nadmiar cieczy za pomocą linii próżniowej. Jeśli utworzenie osadu trwa dłużej niż 30 s , może to wskazywać na obecność zanieczyszczeń hamujących krystalizację lub zbyt wysokie stężenie anality.
Aplikacja kalibratora
- Przygotować mieszaninę kalibratora i matrycy w podobny sposób, tak aby końcowe stężenie kalibratora wynosiło od 0,1–0,5 µM.
- Nanieść 0,5 µL mieszaniny kalibratora i matrycy na płytkę w bliskim sąsiedztwie plamek z próbką. Ta bliskość fizyczna jest wykorzystywana w procedurze pseudowewnętrznej kalibracji, podczas której podczas akwizycji próbki płytka jest przemieszczana z plamki z próbką do plamki z kalibratorem, aby dodać do widma kilka impulsów laserowych kalibratora. Podejście to gwarantuje wyższą dokładność kalibracji masy niż w przypadku stosowania wyłącznie kalibracji zewnętrznej.
Krok płukania
- Przemyj każdą plamkę około 2 µL lodowatego 0,1% wodnego roztworu TFA. Odessij nadmiar cieczy za pomocą linii próżniowej.
Pozyskiwanie widm mas
- Można teraz przystąpić do pozyskiwania widm masowych. W przypadku zastosowania roztworu matrycy FWI, widma należy pozyskać jak najszybciej, aby zapobiec nieodwracalnym modyfikacjom analitytu, takim jak formylacja.