Analiza profilu polirybosomów eukariotycznych

Podsumowanie

Ten artykuł opisuje protokół ekstrakcji translujących rybosomów z komórek eukariotycznych. Po ekstrakcji rybosomy są rozdzielane na monosomy i polirybosomy przez frakcjonowanie gradientu sacharozy, aby umożliwić analizę różnych populacji rybosomów. W związku z tym metoda ta jest złotym standardem w badaniu regulacji tłumaczenia.

Streszczenie

Synteza białek to złożony proces komórkowy, który jest regulowany na wielu poziomach. Na przykład globalna translacja może zostać zahamowana w fazie inicjacji lub fazie wydłużania przez różne stresy komórkowe, takie jak głód aminokwasów lub wycofanie czynnika wzrostu. Alternatywnie, translacja poszczególnych mRNA może być regulowana przez lokalizację mRNA lub obecność pokrewnych mikroRNA. Badania nad syntezą białek często wykorzystują analizę polirybosomów, aby rzucić światło na mechanizmy regulacji translacji lub defekty w syntezie białek. W tym teście kompleksy mRNA/rybosom są izolowane z komórek eukariotycznych. Gradient gęstości sacharozy oddziela mRNA związane z wieloma rybosomami znanymi jako polirybosomy od mRNA związanych z pojedynczym rybosomem lub monosomem. Frakcjonowanie gradientów umożliwia izolację i kwantyfikację różnych populacji rybosomów i związanych z nimi mRNA lub białek. Różnice w stosunku polirybosomów do monosomów w określonych warunkach mogą wskazywać na defekty w inicjacji translacji lub wydłużeniu/zakończeniu. Badanie mRNA obecnych we frakcjach polirybosomów może ujawnić, czy kohorta poszczególnych mRNA poddawanych translacji zmienia się w zależności od warunków eksperymentalnych. Ponadto składanie rybosomów można monitorować poprzez analizę pików małych i dużych podjednostek rybosomalnych, które są również oddzielone gradientem. W tym filmie przedstawiamy metodę przygotowania surowych ekstraktów rybosomalnych z komórek drożdży, separację ekstraktu przez gradient sacharozy oraz interpretację wyników. Ta procedura jest łatwo przystosowana do komórek ssaków.

Protokół

1. Przygotowanie gradientów sacharozy 7-47%

1. Przygotuj gradienty sacharozy na jeden dzień przed użyciem, aby gradienty stały się ciągłe. Przygotować sterylne 7% i 47% roztwory sacharozy zawierające 50 mM NH₄Cl, 50 mM Tris-Acetate pH 7,0 i 12 mM MgCl₂ i przechowywać w temperaturze 4°C ¹.
2. Dla 6 gradientów zmieszaj 7% i 47% roztwory podstawowe sacharozy, aby uzyskać 48 ml każdego z następujących stężeń sacharozy. Dodać DTT (1M zapasu) do każdego roztworu sacharozy do końcowego stężenia 1mM.
   .

   Stężenie końcowe	7% sacharozy	47% sacharozy
   7 proc	48 ml	0
   17%	36 ml	12 ml
   27%	24 ml	24 ml
   37%	12 ml	36 ml
   47%	0	48 ml

3. W celu wylania gradientów należy przymocować pipetę Pasteura do strzykawki o pojemności 20 ml, zabezpieczając i uszczelniając ją preparatem Parafilm lub użyć długiej igły. Dodaj 7 ml 7% sacharozy na dno probówki ultrawirówki polialomerowej 1 x 3,5 cala. Następnie dodaj 7 ml 17% roztworu sacharozy pod 7% roztwór, umieszczając końcówkę pipety Pasteura w pobliżu dna probówki i pipetując nie szybciej niż 0,3 ml/s. Powtórzyć z 7 ml 27%, 37% i 47% roztworów sacharozy. Powinieneś obserwować wyraźne linie między warstwami, wskazujące, że nastąpiło minimalne mieszanie. Gradienty należy przechowywać w temperaturze 4°C przez noc wraz z wirnikami, butelkami i probówkami, które będą używane do pobierania próbek.

2. Przygotowanie ekstraktu drożdżowego

1. Wyhoduj 125 ml kultury drożdży do OD₆₀₀ 0,8-1,0. Dodać cykloheksymid do kultury do końcowego stężenia 100 μg/ml i kontynuować wstrząsanie w temperaturze 30°C przez 15 minut.
2. W międzyczasie przygotuj bufor do lizy zawierający 80 μg/ml cykloheksymidu, 200 μg/ml heparyny, 0,2% DEPC i 10 mM Tris-HCl pH 7,5, 0,1M NaCl, 30mM MgCl₂. Od tego momentu trzymaj wszystko na lodzie.
3. Wlej kulturę do butelki wirówkowej o pojemności 250 ml i napełnij lodem. Wirować przy 8 000 x g (7 250 obr./min w wirniku SLA-1500) przez 5 minut w temperaturze 4°C. Przepłukać osad raz 10 ml lodowatego buforu do lizy i przenieść do probówek polipropylenowych o pojemności 15 ml. Wirować przy 5,900 x g (~6,000 obr./min w wirniku SLA-600TC) przez 3 minuty w temperaturze 4°C. Ponownie zawiesić osad w 0,5 ml buforu do lizy, przenieść do probówki o pojemności 1,5 ml i dodać 0,5 ml schłodzonych, upieczonych szklanych kulek przemytych kwasem. Wiruj komórki przez cztery 30-sekundowe odstępy, schładzając rurkę na lodzie przez 30 sekund między każdym interwałem. Dodaj kolejne 0,5 ml buforu do lizy do probówki o pojemności 1,5 ml. Wirować z maksymalną prędkością w mikrowirówce (14 000 obr./min w mikrowirówce Eppendorf 5417R) przez 10 minut w temperaturze 4°C. Przenieść supernatant do nowej probówki do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml. Usunąć 10 μl do osobnej probówki, aby określić stosunek OD₂₆₀ / OD₂₈₀ (patrz krok 3.1 poniżej). Ekstrakty przechowywać w temperaturze -80°C.

3. Przygotowanie ekstraktów z komórek ssaków

1. W przypadku komórek przylegających rośnie w naczyniu 100 mm do ~70% konfluencji. Będziesz potrzebował jednej płytki 100 mm na 11 ml gradientu (typowa wydajność to ~20 OD₂₆₀ jednostek). Skaluj wartość liniowo dla większych lub mniejszych rozmiarów gradientu. W przypadku komórek nieprzylegających potrzeba około 1 x 10⁷ komórek na 11 ml gradientu.
2. Przed lizą dodać cykloheksymid do 100 μg/ml. Inkubować w temperaturze 37°C przez 15 minut. Przenieś płytki do lodu i dwukrotnie przepłucz komórki w lodowatym PBS. Wszystkie przyszłe kroki MUSZĄ być wykonywane w temperaturze 0-4°C.
3. Usunąć wszelkie ślady PBS przez aspirację (pozwolić płytkom spłynąć na pochylonym podłożu lodu) i dodać 1 ml buforu do lizy, zeskrobać i przenieść do wstępnie schłodzonej probówki o pojemności 1,5 ml. Składniki bufora do lizy będą musiały być zoptymalizowane pod kątem typu komórki i warunków wzrostu. Dobrym buforem wyjściowym byłoby 20 mM HEPES-KOH, pH 7,4, 15 mM MgCl₂, 200 mM KCl, 1% Triton X-100 (v/v), 100 μg/ml cykloheksymidu, 2 mM DTT i 1 mg/ml heparyny. Kluczowymi zmiennymi są stężenia chlorku magnezu i potasu, a także włączenie lub wykluczenie niejonowych detergentów w celu poprawy ekstrakcji polisomów cytoszkieletu lub związanych z błoną. Lizuj komórki, przechodząc dwukrotnie przez igłę strzykawki o rozmiarze 27 lub przez 5-10 pociągnięć homogenizacji odbić za pomocą tłuczka typu B. Strzykawka lub homogenizator powinny być wstępnie schłodzone przed użyciem.
4. Wirować przy 14 000 x g przez 5 minut w mikrowirówce z chłodzeniem. Przenieść świeży lizat do gradientu sacharozy (w przypadku komórek ssaków składa się on z buforu do lizy pozbawionego Tritonu X-100 i heparyny, ale w inny sposób, jak opisano w ppkt 1.2 i 1.3) lub błyskawicznego zamrożenia w ciekłym azocie w celu późniejszego wykorzystania.

4. Wirowanie gradientów

1. Rozmrozić lizaty polirybosomów na lodzie. Oznaczyć stężenie kwasu nukleinowego w lizacie, dodając zarezerwowaną próbkę 10 μl do 1 ml wody i odczytując stosunek OD₂₆₀/OD₂₈₀ za pomocą spektrofotometru. Typowy plon z kultury drożdży uprawianej zgodnie z opisem wynosi 50 jednostek OD.
2. Za pomocą pipety z końcówką umieszczoną przy ściance probówki w pobliżu powierzchni gradientu, delikatnie nałóż 25 jednostek OD₂₆₀ jednostek lizatu na wierzch gradientu. W przypadku gradientu 35 ml zwykle ładuje się 500 μl lizatu. Bufor do lizy może być użyty, aby zapewnić, że wszystkie gradienty są załadowane równą objętością. Mniejsze ilości materiału zapewniają lepszą rozdzielczość. Za pomocą kleszczy ostrożnie opuść nachylenia do wiader wahadłowego wirnika kubełkowego.
3. Wirować gradienty przy 100 000 x g (23 000 obr./min w wirniku Surespin 630) przez 4 godziny w temperaturze 4°C. Protokół ten można dostosować do mniejszych gradientów głośności.

5. Zbieranie danych i ułamków

1. Około 30 minut przed zakończeniem 4-godzinnego wirowania przymocuj igłę do przekłuwacza rurki Model 184. Podłącz pióro do internetowego monitora absorbancji/fluorescencji Isco Model UA-5. Włącz monitor absorbancji, aby umożliwić osiągnięcie stabilnej linii podstawowej przed analizą próbek. Elektroniczną akwizycję profilu polisomowego można łatwo uzyskać, podłączając jednostkę akwizycji danych DI-148U (DATAQ Instruments) do rejestratora wykresów. Profile mogą być następnie zbierane w czasie rzeczywistym i zapisywane do późniejszej adnotacji za pomocą dołączonego oprogramowania WinDaq.
2. Napełnij pompę strzykawkową 50 ml fluoru obojętnego, korzystając z szybkiego ustawienia przepływu wstecznego. Upewnij się, że nie ma pęcherzyków powietrza. Podłącz wąż od strzykawki do przekłuwacza rurki i na krótko włącz przepływ fluoru obojętnego na 3 ml/min w kierunku do przodu, aby oczyścić wąż z wszelkich pęcherzyków powietrza.
3. Umieścić zlewkę na odpady lub szereg probówek w przypadku zbierania frakcji pod wężem na końcu komory przepływowej, aby zebrać spływającą próbkę.
4. Ostrożnie wyjmij probówki wirówkowe z poliallomeru zawierające gradient sacharozy z wirnika wirówki i umieść je na lodzie (wstępnie uformuj studzienki w lodzie za pomocą pustej probówki, aby uniknąć zakłócających gradientów).
5. Aby przeanalizować ekstrakty komórkowe, umieść rurkę gradientową na przebijaczu rurki. Podłącz górną część rurki do gniazdka i zabezpiecz. Podnieś dolny stopień do probówki wirówkowej tak, aby igła przebiła dno probówki. Gdy igła wysunie się przez dno probówki wirówki, rozpocznij przepływ fluoru obojętnego w kierunku do przodu z prędkością 6 ml / min.
6. Gdy fluor zacznie napływać do probówki, należy monitorować ruch igły na monitorze absorbancji online. Gdy igła zacznie się poruszać, włącz ruch wykresu do ustawienia prędkości 60. Monitor zarejestruje OD₂₅₄, zaczynając od wolnego materiału, po którym następuje detekcja podjednostki rybosomalnej 40S i kontynuacja do kompleksów polirybosomów. Jeśli zbierasz frakcje do analizy RNA lub białka, zwykle pobierane są frakcje 0,2 min (1 ml). Do analizy RNA frakcje należy pobrać bezpośrednio do probówek zawierających Trizol (Invitrogen), Phenol lub SDS/proteinazę K, w zależności od preferowanej metody ekstrakcji.
7. Po osiągnięciu końca profilu polirybosomu należy wyłączyć dopływ fluoru obojętnego do probówki wirówkowej i zatrzymać ruch wykresu monitora absorbancji/fluorescencji.
8. Wciągnąć fluor obojętny z probówki wirówkowej do strzykawki, rozpoczynając przepływ w odwrotnym kierunku z dużą prędkością, uważając, aby nie wciągnąć sacharozy z probówki do strzykawki. Odkręć probówkę wirówki od przebijacza do probówek, opuść igłę i wyjmij probówkę.
9. Powtórz kroki od 5.5 do 5.8 dla każdego gradientu sacharozy.
10. Po przeanalizowaniu wszystkich gradientów sacharozy, wycofać fluor obojętny z węża z powrotem do strzykawki. Usuń każdą część frakcjonatora (przebijacz do probówek i komorę przepływową), w tym wąż odpływowy znajdujący się u góry i dobrze spłucz wodą.

6. Reprezentatywne wyniki

Rysunek 1. Reprezentatywny ślad ekstraktu rybosomu przygotowanego ze szczepu drożdży BY4741 (mata his3Δ1 leu2Δ0 met15Δ0 ura3Δ0) w obecności cykloheksymidu. Ekstrakt rybosomalny poddano frakcjonowaniu przy użyciu gradientu sacharozy 7-47% i przeanalizowano za pomocą strzykawki z pompką podłączonej do detektora UV. Wskazywane są piki zawierające polirybosomy oraz rybosomy 80S, 60S i 40S.

Dyskusja

Informacje uzyskane z profilu polirybosomowego mogą dostarczyć cennych informacji na temat stanu translacji komórki. Ponadto można określić stan montażu samych podjednostek rybosomalnych². Na przykład obecność półjednostek lub szczytów 80S i większych z lekkim ramieniem po prawej stronie profilu wskazuje na związaną podjednostkę 40S oczekującą na dołączenie podjednostki 60S. Przeprowadzenie eksperymentu przy braku dodatku cykloheksymidu lub innego inhibitora wydłużenia pozwala na analizę szybkości spływu, która wskazuje, czy wydłużenie^{jest zmienione,} czy też nie3. Same frakcje są bogatym źródłem odczynników do późniejszego określania związku określonego mRNA lub białka z subpopulacjami rybosomalnymi poprzez północne lub zachodnie blotowanie frakcji. Całkowitą pulę mRNA związanych z aktywnymi rybosomami można określić za pomocą powiązanej mikromacierzy⁴ lub analizy głębokiego sekwencjonowania⁵. Asocjacje białkowe można również ustabilizować przez odpowiednie dodanie odczynnika sieciującego ⁶.

Warto również wspomnieć o analizie polirybosomów z komórek ssaków jako odrębnym protokole pod względem pozornych trudności w ustaleniu warunków wymaganych do uzyskania stabilnych polisomów. Systemy buforowe opisywane w literaturze są bardzo zmienne ^7-10, dlatego może istnieć wymóg optymalizacji bufora do lizy w zależności od typu komórki lub równie prawdopodobne jest, że system buforowy nie jest tak ważny, jak zwrócenie szczególnej uwagi na pracę ze świeżymi lizatami przechowywanymi w niskich temperaturach. Zgodnie z naszą wiedzą, nie przedstawiono systematycznej oceny parametrów wpływających na powstawanie polisomów u ssaków.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
rurka ultrawirówkowa z poliallomera	Beckman Coulter Inc.	326823	1 x 3,5 cala (25x89mm)
Fluorinert	Sigma-Aldrich	F9755
Cycloheximde	Sigma-Aldrich	C-7698
Heparyna	Sigma-Aldrich	H3393
BY4741	Open Biosystems	YSC1048	Inne szczepy działają równie dobrze