Analiza profilu polirybosomów eukariotycznych

Podsumowanie

Niniejszy artykuł opisuje protokół ekstrakcji rybosomów translacyjnych z komórek eukariotycznych. Po ekstrakcji rybosomy są rozdzielane na monosomy i polirybosomy za pomocą frakcjonowania w gradiencie sacharozy, co pozwala na analizę różnych populacji rybosomalnych. W związku z tym metoda ta stanowi złoty standard w badaniu regulacji translacji.

Streszczenie

Synteza białek jest złożonym procesem komórkowym regulowanym na wielu poziomach. Na przykład globalna translacja może zostać zahamowana w fazie inicjacji lub elongacji przez różne stresy komórkowe, takie jak głodzenie aminokwasowe lub odstawienie czynników wzrostu. Z drugiej strony, translacja poszczególnych cząsteczek mRNA może być regulowana poprzez lokalizację mRNA lub obecność komplementarnych mikroRNA. W badaniach nad syntezą białek często wykorzystuje się analizę polirybosomów, aby wyjaśnić mechanizmy regulacji translacji lub defekty syntezy białek. W tym teście kompleksy mRNA/rybosom są izolowane z komórek eukariotycznych. Gradient gęstości sacharozy oddziela cząsteczki mRNA związane z wieloma rybosomami, znane jako polirybosomy, od cząsteczek mRNA związanych z pojedynczym rybosomem, czyli monosomem. Frakcjonowanie gradientów umożliwia izolację i ilościowe oznaczenie różnych populacji rybosomalnych oraz związanych z nimi mRNA lub białek. Różnice w stosunku polirybosomów do monosomów w określonych warunkach mogą wskazywać na defekty w inicjacji translacji lub w jej elongacji/terminacji. Analiza mRNA obecnego we frakcjach polirybosomalnych może wykazać, czy zestaw poszczególnych mRNA podlegających translacji zmienia się w zależności od warunków doświadczalnych. Ponadto montaż rybosomów można monitorować poprzez analizę pików małej i dużej podjednostki rybosomalnej, które są również rozdzielane przez gradient. W tym filmie przedstawiamy metodę przygotowania surowych ekstraktów rybosomalnych z komórek drożdży, rozdział ekstraktu za pomocą gradientu sacharozy oraz interpretację wyników. Procedura ta jest łatwo adaptowalna do komórek ssaków.

Protokół

1. Przygotowanie gradientów sacharozy 7-47%

1. Przygotuj gradienty sacharozy na jeden dzień przed użyciem, aby gradienty stały się ciągłe. Przygotuj sterylne 7% i 47% roztwory sacharozy zawierające 50 mM NH4₄Cl, 50mM Tris-octan pH 7,0 oraz 12mM MgCl2₂ i przechowywać w temperaturze 4°C ¹.
2. W celu przygotowania 6 gradientów wymieszaj roztwory stokowe sacharozy o stężeniach 7% i 47%, aby otrzymać po 48 ml roztworów o następujących stężeniach sacharozy. Do każdego roztworu sacharozy dodaj DTT (roztwór stokowy 1 M) do stężenia końcowego 1 mM.
   

   Stężenie końcowe	7% sacharozy	47% sacharoza
   7%	48 mL	0
   17%	36 ml	12 mL
   27%	24 mL	24 ml
   37%	12 ml	36 mL
   47%	0	48 mL

3. Aby przygotować gradienty, przymocuj pipetę Pasteura do strzykawki o pojemności 20 ml, zabezpieczając i uszczelniając połączenie Parafilmem, lub użyj długiej igły. Do dna probówki do ultracentryfugi z polyallomeru o wymiarach 1 x 3,5 cala dodaj 7 ml 7% sacharozy. Następnie dodaj 7 ml 17% roztworu sacharozy pod roztwór 7%, umieszczając końcówkę pipety Pasteura blisko dna probówki i pipetując z prędkością nieprzekraczającą 0,3 ml/s. Powtórz czynność dla 7 ml roztworów sacharozy o stężeniach odpowiednio 27%, 37% i 47%. Powinny być widoczne wyraźne linie między warstwami, co wskazuje na minimalne zmieszanie składników. Gradienty należy przechowywać w 4°C przez noc, wraz z wirnikami, butelkami i probówkami, które zostaną wykorzystane do pobierania próbek.

2. Przygotowanie ekstraktu drożdżowego

1. Hodować 125 mL kultury drożdży do osiągnięcia OD₆₀₀ na poziomie 0,8-1,0. Dodać do kultury cykloheksymid do stężenia końcowego 100 μg/mL i kontynuować inkubację z wytrząsaniem w temperaturze 30°C przez 15 min.
2. W tym czasie przygotować bufor lizujący zawierający 80 μg/mL cykloheksymidu, 200 μg/mL heparyny, 0,2% DEPC, 10 mM Tris-HCl pH 7,5, 0,1M NaCl oraz 30mM MgCl₂. Od tego momentu wszystkie składniki przechowywać w lodzie.
3. Przelać kulturę do butelki wirówkowej o pojemności 250 mL i wypełnić lodem. Wirować przy 8 000 x g (7 250 rpm w rotorze SLA-1500) przez 5 min w temperaturze 4°C. Przemyć osad raz 10 mL lodowatego buforu lizującego i przenieść do polipropylenowych probówek o pojemności 15 mL. Wirować przy 5 900 x g (~6 000rpm w rotorze SLA-600TC) przez 3 min w temperaturze 4°C. Resuspender osad w 0,5 mL buforu lizującego, przenieść do probówki 1,5 mL i dodać 0,5 mL schłodzonych, wypalanych, mytych kwasem szklanych kulek. Homogenizować komórki w vortexerze w czterech 30-sekundowych interwałach, chłodząc probówkę w lodzie przez 30 sek między każdym interwałem. Dodać kolejne 0,5 mL buforu lizującego do probówki 1,5 mL. Wirować z maksymalną prędkością w mikrocentry fudze (14 000 rpm w mikrocentry fudze Eppendorf 5417R) przez 10 min w temperaturze 4°C. Przenieść supernatant do nowej probówki do mikrocentry fugi o pojemności 1,5 mL. Pobrać 10 μl do oddzielnej probówki w celu wyznaczenia stosunku OD₂₆₀ / OD₂₈₀ (patrz krok 3.1 poniżej). Przechowywać ekstrakty w temperaturze -80°C.

3. Przygotowanie ekstraktów z komórek ssaków

1. W przypadku komórek adherentnych, hodować je w szalce 100 mm do osiągnięcia ok. 70% konfluencji. Wymagana jest jedna szalka 100 mm na 11 ml gradientu (typowy uzysk to ok. 20 jednostek OD₂₆₀). Ilość należy skalować liniowo dla większych lub mniejszych objętości gradientu. W przypadku komórek nieadherentnych, na 11 ml gradientu potrzeba około 1 x 10⁷ komórek.
2. Przed lizą dodać cykloheksymid do stężenia 100 μg/mL. Inkubować w 37°C przez 15 min. Przenieść płytki na lód i dwukrotnie wypłukać komórki w lodowatym PBS. Wszystkie kolejne kroki MUSZĄ być wykonywane w temperaturze 0-4°C.
3. Usunąć wszystkie pozostałości PBS poprzez aspirację (pozostawić płytki do odcieknięcia na nachylonym złożu lodu), dodać 1 mL buforu do lizy, zebrać komórki skrobaczką i przenieść do schłodzonej wcześniej probówki 1,5 mL. Składniki buforu do lizy będą wymagały optymalizacji w zależności od typu komórek i warunków hodowli. Dobrym buforem startowym będzie 20 mM HEPES-KOH, pH 7.4, 15 mM MgCl₂, 200 mM KCl, 1% Triton X-100 (v/v), 100 μg/mL cykloheksymidu, 2 mM DTT oraz 1 mg/mL heparyny. Kluczowymi zmiennymi są stężenia chlorku magnezu i potasu, a także zastosowanie lub pominięcie niejonowych detergentów w celu poprawy ekstrakcji polisomów cytoszkieletowych lub związanych z błoną. Lizować komórki, przepuszczając je dwukrotnie przez igłę strzykawki o rozmiarze 27G lub wykonując 5-10 ruchów homogenizatorem Dounce z tłuczkiem typu B. Strzykawkę lub homogenizator należy schłodzić przed użyciem.
4. Wirować przy 14,000 x g przez 5 min w mikrowirówce z chłodzeniem. Przenieść świeży lizat do gradientu sacharozy (dla komórek ssaków gradient ten przygotowuje się w buforze do lizy pozbawionym Triton X-100 i heparyny, ale w pozostałym zakresie zgodnie z opisem w 1.2 i 1.3) lub zamrozić błyskawicznie w ciekłym azocie do późniejszego użycia.

4. Wirowanie gradientów

1. Rozmrozić lizaty poliribosomów na lodzie. Określić stężenie kwasów nukleinowych w lizacie, dodając zarezerwowaną próbkę 10 μL do 1 mL wody i odczytując stosunek OD₂₆₀/OD₂₈₀ za pomocą spektrofotometru. Typowa wydajność z hodowli drożdży prowadzonej zgodnie z opisem wynosi 50 jednostek OD.
2. Używając pipety z końcówką przyłożoną do ścianki probówki w pobliżu powierzchni gradientu, ostrożnie nanieść 25 jednostek OD₂₆₀ lizatu na wierzch gradientu. Dla gradientu o objętości 35 mL zazwyczaj nanosi się 500 μl lizatu. W celu zapewnienia naniesienia takiej samej objętości do wszystkich gradientów można zastosować bufor do lizy. Mniejsze ilości materiału zapewniają lepszą rozdzielczość. Za pomocą pęsety ostrożnie umieścić probówki z gradientami w koszykach rotora z koszyczkami odchylanymi.
3. Wirować gradienty przy 100,000 x g (23,000 rpm w rotorze Surespin 630) przez 4 h w temperaturze 4°C. Protokół ten można dostosować do gradientów o mniejszej objętości.

5. Gromadzenie danych i frakcji

1. Na około 30 min przed zakończeniem 4-godzinnego wirowania przymocuj igłę do przebijaka do probówek Model 184. Podłącz pióro do on-line monitora absorbancji/fluorescencji Isco Model UA-5. Włącz monitor absorbancji, aby umożliwić osiągnięcie stabilnej linii bazowej przed analizą próbek. Elektroniczną akwizycję profilu polisomów można łatwo uzyskać, podłączając jednostkę akwizycji danych DI-148U (DATAQ Instruments) do rejestratora wykresów. Profile mogą być następnie zbierane w czasie rzeczywistym i zapisywane do późniejszej adnotacji przy użyciu dołączonego oprogramowania WinDaq.
2. Napełnij pompę strzykawkową 50mL Fluorinertu, korzystając z przepływu wstecznego w ustawieniu szybkim. Upewnij się, że nie ma pęcherzyków powietrza. Połącz wąż ze strzykawki z przebijakiem do probówek i krótko uruchom przepływ Fluorinertu z prędkością 3 mL/min w kierunku w przód, aby usunąć wszelkie pęcherzyki powietrza z węża.
3. Pod wężem na końcu celi przepływowej ustaw zlewkę na odpady lub serię probówek (jeśli zbierane są frakcje), aby zbierać nadmiar próbki.
4. Ostrożnie wyjmij z rotora wirówki probówki z polialomeru zawierające gradient sacharozy i umieść je w lodzie (wcześniej przygotuj wgłębienia w lodzie za pomocą pustej probówki, aby uniknąć zaburzenia gradientów).
5. Aby przeanalizować ekstrakty komórkowe, umieść probówkę z gradientem na przebijaku do probówek. Podłącz górną część probówki do wylotu i zabezpiecz. Podnieś dolną platformę do probówki wirówkowej tak, aby igła przebiła dno probówki. Gdy igła przejdzie przez dno probówki wirówkowej, rozpocznij przepływ Fluorinertu w kierunku w przód z prędkością 6mL/min.
6. Gdy Fluorinert zacznie wpływać do probówki, monitoruj ruch igły na on-line monitorze absorbancji. Gdy igła zacznie się poruszać, włącz ruch wykresu, ustawiając prędkość na 60. Monitor zarejestruje OD₂₅₄, zaczynając od materiału wolnego, następnie wykryje podjednostki rybosomalne 40S i kontynuując aż do kompleksów polirybosomów. Jeśli zbierane są frakcje do analizy RNA lub białek, zazwyczaj pobiera się frakcje 0,2 min (1 mL). Do analizy RNA frakcje należy zbierać bezpośrednio do probówek zawierających Trizol (Invitrogen), fenol lub SDS/proteinazę K, w zależności od preferowanej metody ekstrakcji.
7. Po osiągnięciu końca profilu polirybosomów wyłącz przepływ Fluorinertu do probówki wirówkowej i zatrzymaj ruch wykresu w monitorze absorbancji/fluorescencji.
8. Wycofaj Fluorinert z probówki wirówkowej do strzykawki, rozpoczynając przepływ w kierunku wstecznym z dużą prędkością, dbając o to, aby nie zaciągnąć sacharozy z probówki do strzykawki. Odkręć probówkę wirówkową od przebijaka, opuść igłę i wyjmij probówkę.
9. Powtórz kroki od 5.5 do 5.8 dla każdego gradientu sacharozy.
10. Po przeanalizowaniu wszystkich gradientów sacharozy wycofaj Fluorinert z węża z powrotem do strzykawki. Zdemontuj każdą część frakcjonatora (przebijak do probówek i celę przepływową), w tym wąż odpływowy znajdujący się na górze, i dokładnie wypłucz wodą.

6. Reprezentatywne wyniki

Rycina 1. Reprezentatywny zapis ekstraktu rybosomalnego przygotowanego z szczepu drożdży BY4741 (mata his3Δ1 leu2Δ0 met15Δ0 ura3Δ0) w obecności cykloheksymidu. Ekstrakt rybosomalny poddano frakcjonowaniu przy użyciu gradientu sacharozy 7–47% i analizowano za pomocą aparatury z pompą strzykawkową połączoną z detektorem UV. Oznaczono piki zawierające polirybosomy oraz rybosomy 80S, 60S i 40S.

Dyskusja

Informacje uzyskane z profilu polirybosomalnego mogą dostarczyć cennych danych na temat stanu translacyjnego komórki. Dodatkowo można określić stan montażu samych podjednostek rybosomalnych². Na przykład obecność tzw. halfmerów lub piku 80S i większych z lekkim „barkiem” po prawej stronie profilu wskazuje na związaną podjednostkę 40S oczekującą na przyłączenie podjednostki 60S. Przeprowadzenie eksperymentu bez dodawania cykloheksymidu lub innego inhibitora elongacji pozwala na analizę szybkości odrywania się rybosomów (run off), co wskazuje, czy elongacja uległa zmianie³. Same frakcje stanowią bogate źródło materiału do późniejszego oznaczania asocjacji konkretnego mRNA lub białka z subpopulacjami rybosomalnymi za pomocą analizy Northern lub Western blotting frakcji. Całkowitą pulę mRNA związanych z aktywnymi rybosomami można określić za pomocą powiązanej analizy microarray⁴ lub głębokiego sekwencjonowania⁵. Powiązania białkowe można również stabilizować poprzez odpowiednie dodanie odczynnika sieciującego⁶.

Warto również wspomnieć o analizie polirybosomów z komórek ssaków jako o osobnym protokole, ze względu na ewidentne trudności w ustaleniu warunków niezbędnych do uzyskania stabilnych polisomów. Systemy buforowe opisane w literaturze są bardzo zróżnicowane ^7-10, w związku z czym może istnieć potrzeba optymalizacji buforu do lizy w zależności od typu komórek, lub równie prawdopodobne jest, że system buforowy nie jest tak istotny, jak skrupulatna dbałość o pracę ze świeżymi lizatami przechowywanymi w niskich temperaturach. Z naszej wiedzy nie opisano systematycznej oceny parametrów wpływających na tworzenie polisomów u ssaków.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
probówka do ultrawirówki z polialomeru	Beckman Coulter Inc.	326823	1 x 3.5 in. (25x89mm)
Fluorinert	Sigma-Aldrich	F9755
cykloheksymida	Sigma-Aldrich	C-7698
heparyna	Sigma-Aldrich	H3393
BY4741	Open Biosystems	YSC1048	Inne szczepy sprawdzają się równie dobrze