In situ frakcjonowanie subkomórkowe adherentnych i nieadherentnych komórek ssaków

Podsumowanie

In situ frakcjonowanie subkomórkowe komórek ssaków na szkiełkach podstawowych do mikroskopu umożliwia wizualizację lokalizacji białek.

Streszczenie

Funkcja białek jest ściśle powiązana z ich lokalizacją. Choć niektóre białka są ograniczone do konkretnego miejsca lub przedziału subkomórkowego, wiele z nich występuje jako populacja swobodnie dyfundująca, znajdująca się w ciągłej wymianie z subpopulacją ściśle związaną z konkretną domeną lub strukturą subkomórkową. Frakcjonowanie subkomórkowe in situ umożliwia wizualizację kompartymentalizacji białek, a także może ujawnić subpopulacje białek lokalizujące się w określonych strukturach. Na przykład usunięcie rozpuszczalnych białek cytoplazmatycznych oraz słabo związanych białek jądrowych może ukazać trwałe powiązanie niektórych czynników transkrypcyjnych z chromatyną. Następujące po tym trawienie DNA może w niektórych przypadkach ujawnić powiązanie z siecią białek i RNA, określaną zbiorczo jako rusztowanie jądrowe lub macierz jądrowa.

W niniejszym materiale opisujemy kroki niezbędne do przeprowadzenia frakcjonowania in situ adherentnych i nieadherentnych komórek ssaków na szkiełkach podstawowych do mikroskopu. Wizualizację białek można przeprowadzić z wykorzystaniem swoistych przeciwciał lub fluorescencyjnych białek fuzyjnych oraz mikroskopii fluorescencyjnej. Przeciwciała i/lub barwniki fluorescencyjne pełniące rolę markerów konkretnych kompartmentów lub struktur pozwalają na szczegółowe mapowanie lokalizacji białek. Frakcjonowanie in situ można również połączyć z metodą western blotting w celu porównania ilości białek obecnych w każdej frakcji. To proste podejście biochemiczne może ujawnić powiązania, które w przeciwnym razie pozostałyby niewykryte.

Protokół

I. Przygotowanie do frakcjonowania

W tej sekcji opisano przygotowanie szkiełek nakrywkowych do mikroskopu powlekanych poli-L-lizyną oraz przyłączanie komórek przed frakcjonowaniem. W razie potrzeby komórki można przejściowo przetransfekować wektorami ekspresyjnymi białek przed lub po przyłączeniu.

A. Przygotowanie szkiełek nakrywkowych powlekanych poli-L-lizyną

1. Przygotować roztwór poli-L-lizyny o stężeniu 1mg/ml w wodzie destylowanej.
2. Pokryć czyste szkiełka nakrywkowe poli-L-lizyną, inkubując je w roztworze przez co najmniej 1 godzinę na platformie kołyszącej w temperaturze 2°C.
3. Przemyć pokryte szkiełka dwukrotnie sterylną wodą destylowaną, a następnie jednokrotnie 96% etanolem.
4. Wysuszyć pokryte szkiełka na powietrzu na kawałku papieru filtracyjnego i przechowywać w suchym pojemniku do późniejszego użycia (po wyschnięciu można je układać w stosy).

B. Przytwierdzanie komórek do szkiełek podstawowych

Komórki nieprzylegające (w tym przypadku używamy linii komórkowej K562)

1. Umieść szkiełko podstawkowe pokryte poli-L-lizyną w dołku płytki 6-dołkowej, tak aby pokryta powierzchnia była skierowana do góry.
2. Zasiać komórki K562 w zagęszczeniu 7x10⁵ komórek/dołek w podłożu DMEM (Dulbecco's Modified Eagles Medium) uzupełnionym o 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) oraz PS (penicylina 10units/ml, streptomycyna 10mg/ml). W przypadku komórek K562 przed wysianiem można przeprowadzić transfekcję przejściową za pomocą elektroporacji (kuwety do elektroporacji 0,4cm z 1x10⁷ komórek w 200μl pożywki przy 250V / 975μF).
3. Inkubować komórki przez 24 godziny w temperaturze 37°C w 5% CO₂.
4. Odlać pożywkę i dwukrotnie przemyć komórki lodowatym solą fizjologiczną z buforem fosforanowym (PBS).
5. Następnie postępować zgodnie z protokołem frakcjonowania subkomórkowego.

Komórki adherentne (w tym przypadku używamy komórek Cos-7)

1. Umieść niepowlekane szkiełko nakrywką w dołku płytki 6-dołkowej.
2. Przemyj dwukrotnie w PBS uprzednio ogrzanym do 37°C.
3. Od publicités komórki poprzez trawienie trypsyną (0,03% EDTA, 0,25% trypsyny) w PBS w 37°C przez 2 do 5 minut. Ważne jest, aby nie doprowadzić do nadmiernego strawienia komórek i przerwać proces trawienia, gdy pojawią się głównie pojedyncze, pływające komórki.
4. Przerwij trawienie, wysiewając komórki z gęstością 3x10⁵ komórek/dołek w płytce 6-dołkowej w DMEM uzupełnionym o 10% FBS i PSG (penicylina 10 units/ml, streptomycyna 10ug/ml i L-glutamina 292ug/ml), na zwykłych szkiełkach nakrywkach. Komórki adherentne zazwyczaj dobrze przylegają do zwykłych szkiełek nakrywek mikroskopowych, jednak w razie potrzeby można zastosować szkiełka powlekane poli-L-lizyną.
5. Inkubuj komórki przez 24 godziny w 37°C i 5% CO₂. W przypadku komórek Cos-7, jeśli jest to wymagane, można przeprowadzić przejściową transfekcję za pomocą Fugene 6 (Roche), a następnie pozostawić komórki do regeneracji na kolejne 24 godziny w 37°C i 5% CO₂.
6. Odlej pożywkę i przemyj komórki dwukrotnie lodowatym PBS.
7. Następnie postępuj zgodnie z protokołem frakcjonowania subkomórkowego.

II. Frakcjonowanie subkomórkowe

In situ frakcjonowanie przeprowadza się zgodnie ze schematem przedstawionym na Rysunku 1, w oparciu o metodę opisaną wcześniej⁵ z modyfikacjami opisanymi wcześniej⁷ oraz w szczegółowym protokole poniżej. Zaleca się przenoszenie szkiełek podstawkowych do nowej płytki 6-dołkowej po każdym etapie frakcjonowania, wyjmując szkiełko przed usunięciem cieczy. Chociaż do obrazowania wymagane są tylko cztery szkiełka podstawkowe, dodatkowe szkiełka są niezbędne do przygotowania frakcji ekstraktu z całych komórek oraz macierzy jądrowej do analizy western blotting, jeśli ma ona być przeprowadzona równolegle.

1. Przygotować i przefiltrować bufor do cytoszkieletu (CSK): 10 mM PIPES, 30 mM sacharozy, 10 mM NaCl, 3 mM MgCl2₂, 1mM EGTA. Bufor CSK powinien zostać przygotowany na świeżo w dniu frakcjonowania.
2. W razie potrzeby komórki z jednej szkiełka nakrywki mogą zostać wykorzystane do przygotowania ekstraktu z całych komórek do analizy western blotting poprzez delikatne naniesienie 20 µl buforu TES (1% SDS, 2 mM EDTA, 20 mM Tris-HCl pH 7,4) bezpośrednio na szkiełko nakrywkę i inkubowanie przez 1 lub 2 minuty w temperaturze 22°CNastępnie można usunąć całkowity ekstrakt komórkowy, a białka wytrącić poprzez dodanie 250 µl 1M (NH4)⁴)²SO⁴ oraz inkubowanie w lodzie do czasu przygotowania pozostałych próbek do analizy Western blot.
3. Pozostałe szkiełka nakrywkowe należy dwukrotnie przemyć 1 ml lodowatego PBS w temperaturze 22°C poprzez dwu- lub trzykrotne przechylenie płytki 6-dołkowej.
4. Zdjąć szkiełko przykrywcze z całymi komórkami i przenieść je do nowej płytki 6-dołkowej. Następnie przeprowadzić protokół fiksacji komórek i immunofluorescencji.
5. Ostrożnie usuń PBS z pozostałych studzienek.
6. Wyodrębnić białka cytoplazmatyczne i słabo związane białka jądrowe, delikatnie nanosząc 20 $\mu$l buforu CSK z dodatkiem 0,1% (V/V) Tritonu X-10 bezpośrednio na każdą z pozostałych szkiełek podstawkowych i inkubując na lodzie przez 1 minutę.
7. Usunąć ekstrakt cytoplazmatyczny oraz słabo związany ekstrakt jądrowy i przeprowadzić wytrącanie zgodnie z opisem w kroku 2.
8. Przemyj szkiełka podstawowe dwukrotnie 1 ml lodowatego PBS w temperaturze 22°C poprzez przechylenie płytki 6-dołkowej.
9. Usuń szkiełko cover-slip reprezentujące ściśle związane materiały jądrowe, a następnie przeprowadź protokół fiksacji komórek i immunofluorescencji.
10. Ostrożnie usuń bufor PBS z pozostałych dołków, a następnie wyodrębnij silnie związane białka, nakładając delikatnie 20 µl buforu CSK z dodatkiem 0,5% (V/V) Triton X-10 bezpośrednio na każde z pozostałych szkiełek podstawowych i inkubując na lodzie przez 20 minut.
11. Usunąć ściśle związany ekstrakt i przeprowadzić precypitację zgodnie z opisem w kroku 2.
12. Przemyj szkiełka nakrywkowe dwukrotnie 1 ml lodowatego PBS przy 22°C poprzez przechylenie płytki 6-dołkowej.
13. Usuń szkiełko nakrywowe reprezentujące frakcję chromatyny, a następnie przeprowadź procedurę fiksacji komórek i protokół immunofluorescencji.
14. Delikatnie usuń PBS z pozostałych dołków, a następnie nanieś 200 $\mu$l buforu CSK z dodatkiem 10 $\mu$g/ml DNazy I na pozostałe szkiełka podstawne i inkubuj przez 30 minut w temperaturze 37°C.
15. Usunąć ekstrakt chromatyny i przeprowadzić precypitację zgodnie z opisem w kroku 2.
16. Przemyć szkiełka podstawowe dwa razy w lodowatym PBS przy 22°C poprzez przechylenie płytki 6-dołkowej.
17. Usuń szkiełko nakrywkowe reprezentujące frakcję macierzy jądrowej, a następnie przeprowadź utrwalanie komórek zgodnie z protokołem immunofluorescencji.
18. W razie potrzeby białka macierzy można usunąć z dodatkowej szkiełka nakrywki z macierzą do analizy western blotting, używając 20 µl buforu TES, zgodnie z opisem w kroku 2.
19. Próbki do analizy western blot należy odwirować w mikrocentry fudze nakładkowej z prędkością 130 obr./min przy 4°C a osady resuspendowano w 40 $\mu$l buforu do ładowania SDS (62,5 mM Tris-HCl pH 6,8, 2% SDS (m/v), 50 mM DTT, 10% glicerolu, 0,01% błękitu bromofenolowego (m/v)) przed analizą za pomocą SDS-PAGE.
    
    Rycina 1. Schematyczne przedstawienie in situ frakcjonowanie subkomórkowe Bufor cytoszkieletowy (CSK) składa się z 10 mM PIPES, 30 mM sacharozy, 10 mM NaCl i 3 mM MgCl2₂, 1 mM EGTA. Bufor TES składa się z 1% SDS, 2 mM EDTA, 20 mM Tris-HCl pH 7,4.

III. Fixacja komórek i immunofluorescencja

1. Ostrożnie dodaj 1ml 4% formaldehydu/PBS na każde szkiełko nakrywki i inkubuj w temperaturze 4°C przez 30 minut.
2. Każde szkiełko nakrywki przemyj delikatnie 2-3 razy, używając 1ml PBS w temperaturze 2°C.
3. Dodaj 40ul 0,1% Triton X-10/PBS na każde szkiełko nakrywki i inkubuj w temperaturze 2°C przez 10 minut.
4. Każde szkiełko nakrywki przemyj delikatnie 2-3 razy, używając 1ml PBS w temperaturze 2°C.
5. Dodaj 40ul 3% albuminy surowicy bydlęcej (BSA)/PBS i inkubuj w temperaturze 2°C przez 20 minut w celu zmniejszenia potencjalnego barwienia tła.
6. Każde szkiełko nakrywki przemyj delikatnie 2-3 razy, używając 1ml PBS w temperaturze 2°C.
7. Nanieś 100ul przeciwciała pierwszorzędowego w PBS bezpośrednio na szkiełko nakrywki i inkubuj w temperaturze 2°C przez 1 godzinę. Przeciwciała pierwszorzędowe i drugorzędowe należy rozcieńczyć w PBS do wymaganego stężenia. Może to wymagać optymalizacji dla każdego użytego przeciwciała.
8. Każde szkiełko nakrywki przemyj delikatnie 2-3 razy, używając 1ml PBS w temperaturze 2°C.
9. Nanieś 20ul przeciwciała drugorzzędowego w PBS i inkubuj w temperaturze 2°C przez 1 godzinę, chroniąc przed światłem.
10. Każde szkiełko nakrywki przemyj delikatnie 2-3 razy, używając 1ml PBS w temperaturze 2°C.
11. Zamocuj każde szkiełko nakrywki (komórkami dołu) na szklanym preparacie mikroskopowym, używając medium montażowego Vectashield zawierającego DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole hydrochloride).
12. Usuń nadmiar medium montażowego z okolic szkiełka nakrywki za pomocą ręcznika papierowego i inkubuj preparat w temperaturze 22°C przez co najmniej 30 minut, chroniąc przed światłem.
13. Przymocuj szkiełko nakrywki do szklanego preparatu za pomocą bezbarwnego akrylowego lakieru do paznokci.
14. Przechowuj preparaty w ciemności przed wizualizacją za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej.

IV. Reprezentatywne wyniki

Rysunek 2. Frakcjonowanie subkomórkowe nietransfekowanych komórek COS-7. Ufrakcjonowane komórki Cos-7 utrwalono formaldehydem, a następnie poddano immunostynowaniu z użyciem przeciwciał przeciwko $\alpha$-tubulinie, $\alpha$-histonie H1 lub $\alpha$-laminie A/C sprzężonych z TRITC, po czym zastosowano medium montażowe zawierające DAPI. Obrazy pozyskano za pomocą okularu 10x i obiektywu 63x przy użyciu konfokalnego mikroskopu Leica. Jądra komórkowe wizualizowano przy użyciu zestawu filtrów DAPI, natomiast w tym samym polu widzenia komórki barwione przeciwciałami markerowymi wizualizowano przy użyciu zestawu filtrów TRITC.

Rysunek 3. Białko fuzyjne GFP-6E2 wiąże się z macierzą jądrową. Frakcjonowanie subkomórkowe komórek Cos-7 wykazujących ekspresję białka fuzyjnego składającego się z zielonego białka fluorescencyjnego (GFP) połączonego z białkiem E2 wirusa HPV typu 6 (GFP-6E2). Jądra komórkowe wizualizowano za pomocą barwienia DAPI, natomiast lokalizację GFP-6E2 w komórkach przetransfekowanych wizualizowano bezpośrednio poprzez fluorescencję GFP. Laminę A/C wizualizowano przy użyciu przeciwciał α-Lamin A/C sprzężonych z TRITC oraz zestawu filtrów TRITC. Obrazy z nałożeniem kanałów (merge) wykazują, że część białka GFP-6E2 jest związana z macierzą jądrową (panel prawy dolny). Obrazy uzyskano zgodnie z opisem w Rysunku 2.

Dyskusja

Typowe problemy i sugestie:

Wszystkie lub większość komórek zostają utracone podczas płukania. Podczas etapów płukania ciecze należy dodawać powoli, kierując je na ściankę płytki 6-dołkowej, aby uniknąć bezpośredniego strumienia na szkiełko podstawowe. Podobnie, ciecze należy usuwać poprzez ostrożne przechylenie płytki i powolne odpipetowanie nadmiaru płynu. Adhezję komórek można zwiększyć, stosując szkiełka podstawowe powlekane poli-L-lizyną.

DNA genomowe nie został...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
BSA	Odczynnik chemiczny	Sigma-Aldrich	A9647-100G
DNaza I	Odczynnik chemiczny	Sigma-Aldrich	DN25-1G
poli-L-lizyna	Odczynnik chemiczny	Sigma-Aldrich	P-8920
Trypsyna	Odczynnik chemiczny
EGTA	Odczynnik chemiczny	Sigma-Aldrich	E4378-25G
Formaldehyd	Odczynnik chemiczny	VWR	284216N
PIPES	Odczynnik chemiczny	Sigma-Aldrich	P-6757
Sacharoza	Odczynnik chemiczny	Fisher Scientific	S/8600/53
Triton X-100	Odczynnik chemiczny	Sigma-Aldrich	T-6876
Medium montażowy z DAPI	Odczynnik chemiczny	Vector Laboratories	H-1200
Odczynnik do transfekcji Fugene 6	Odczynnik chemiczny	Roche Group	11814443001
Histona H1	Przeciwciała	Santa Cruz Biotechnology, Inc.	SC-8030
Lamin A/C	Przeciwciała	Santa Cruz Biotechnology, Inc.	SC-20681
Tubulina-α	Przeciwciała	Santa Cruz Biotechnology, Inc.	SC-32293