Generowanie transgenicznych C. elegans za pomocą transformacji biolistycznej

Podsumowanie

Robaki transgeniczne są powszechnie stosowane w badaniach nad C. elegans. Opisano prosty, a zarazem skuteczny protokół wprowadzania transgenów do organizmów za pomocą bombardowania biolistycznego cząstkami złota powleczonymi DNA. Nakład pracy oraz wyniki bombardowania wypadają korzystnie w porównaniu z mikroiniekcją w kontekście generowania zwierząt transgenicznych.

Streszczenie

Liczba laboratoriów wykorzystujących wolnożyjącego nicienia C. elegans szybko rośnie. Popularność tego modelu biologicznego przypisuje się szybkiemu czasowi generacji i krótkiej długości życia, łatwemu i niedrogiemu utrzymaniu, w pełni zsekwencjonowanemu genomowi oraz szerokiemu zapleczu zasobów RNAi i zwierząt mutantów. Ponadto analiza genomu C. elegans ujawniła duże podobieństwo między nicieniami a wyższymi kręgowcami, co sugeruje, że badania na nicieniach mogą stanowić istotny dodatek do badań prowadzonych na całych myszach lub hodowlach komórkowych. Potężnym i ważnym elementem badań nad nicieniami jest możliwość wykorzystania zwierząt transgenicznych do badania lokalizacji i funkcji genów. Zwierzęta transgeniczne można tworzyć albo poprzez mikroiniekcję do linii zarodkowej nicienia, albo za pomocą bombardowania biolistycznego. Bombardowanie jest nowszą techniką i jest mniej znana w wielu laboratoriach. W niniejszym materiale opisujemy prosty protokół generowania nicieni transgenicznych metodą bombardowania biolistycznego cząsteczkami złota przy użyciu systemu Bio-Rad PDS-1000. W porównaniu z mikroiniekcją DNA do linii zarodkowej hermafrodyt, protokół ten ma tę zaletę, że nie wymaga od operatora specjalnych umiejętności w zakresie identyfikacji anatomii nicienia czy wykonywania mikroiniekcji. Co więcej, z jednego bombardowania zazwyczaj uzyskuje się wiele linii transgenicznych. Ponadto, w przeciwieństwie do mikroiniekcji, bombardowanie biolistyczne pozwala na uzyskanie zwierząt transgenicznych zarówno z macierzami pozachromosomalnymi, jak i zintegrowanymi transgenami. Możliwość uzyskania zintegrowanych linii transgenicznych pozwala uniknąć stosowania protokołów mutagennych w celu integracji obcego DNA. Podsumowując, bombardowanie biolistyczne może być atrakcyjną metodą generowania zwierząt transgenicznych, szczególnie dla badaczy, którzy nie chcą poświęcać czasu i wysiłku niezbędnego do opanowania techniki mikroiniekcji.

Protokół

Przegląd

Tradycyjnie nicienie transgeniczne wytwarzano poprzez mikroiniekcję DNA transgenu do linii zarodkowej C. elegans ^1,2,3,4. Mimo że metoda ta jest skuteczna, wymaga ona specjalistycznego sprzętu oraz zdobycia doświadczenia w zakresie anatomii nicieni i techniki mikroiniekcji. W ostatnim czasie opracowano bombardowanie biolistyczne jako alternatywną metodę, w której wykorzystuje się pokryte DNA cząsteczki złota do wprowadzenia obcego DNA do linii zarodkowej ^5,6. Podejście to wymaga mniejszego nakładu czasu w postaci praktyki w celu osiągnięcia sukcesu.

Bombardowanie biolistyczne C. elegans w celu wytworzenia robaków transgenicznych charakteryzuje się niską wydajnością na poziomie pojedynczego osobnika, dlatego sukces wymaga zastosowania dużej liczby zwierząt. Można je hodować na kilka sposobów, jednak my stosujemy płytki z jajami, aby zmniejszyć nakład pracy oraz liczbę wykorzystywanych płytek. Nasz protokół rozpoczyna się od przygotowania płytek z jajami oraz robaków, a następnie koncentruje się na protokole bombardowania z wykorzystaniem systemu Bio-Rad PDS-1000/He Hepta. Nasz protokół został częściowo zaadaptowany z pracy Berezikova i wsp. ⁷.

W metodzie bombardowania gen unc-119 jest zazwyczaj wykorzystywany jako marker dla zwierząt transgenicznych. Szczepy nicieni posiadające tę mutację są poważnie nieskoordynowane i prawie się nie ruszają, mają krępą budowę ciała i nie są w stanie tworzyć larw dauer ⁸. Dauer to alternatywny etap larwalny, który służy do opóźnienia rozwoju do stadium dorosłego osobnika zdolnego do rozrodu w niesprzyjających warunkach; wejście w stan dauer jest regulowane przez wiele genów ⁹. Kilka szczepów posiadających gen unc-119 jest dostępnych w C. elegans Genetics Center (CGC, Minneapolis, MN). Pierwotny szczep DP38 (unc-119(ed3)) posiada również niezwiązaną z tym procesem konstytutywną mutację tworzenia dauer (daf-c), która mogłaby wpływać na dalsze eksperymenty. Wiele laboratoriów wyeliminowało tę mutację poprzez krzyżowanie wsteczne, a szczep HT1593 jest dostępny w CGC. Uważamy, że zwierzęta transgeniczne są nieco łatwiejsze do zidentyfikowania w szczepie DP38, dlatego zazwyczaj używamy tego szczepu do tworzenia zwierząt transgenicznych. W razie potrzeby używamy HT1593 do krzyżowania wstecznego nicieni transgenicznych w celu usunięcia mutacji daf-c. Hodowla nicieni DP38 jest jednym z najwolniejszych etapów protokołu, dlatego utrzymujemy zapas płytek hodowlanych podczas przygotowywania transgenów.

Ekspresja markera unc-119 wraz z badanym genem umożliwia łatwą identyfikację zwierząt wykazujących ekspresję transgenu na podstawie przywrócenia prawidłowej ruchliwości i wielkości ciała ⁵. Gen unc-119 można pozyskać z kilku źródeł; stosuje się wektory wykorzystujące genomiczne DNA unc-119, promotor i cDNA unc-119 oraz genomiczne DNA mniejszego genu C. briggsiae ^8,10. Niedawno opisaliśmy prosty protokół wprowadzania kasety unc-119 do dowolnego plazmidu zawierającego gen oporności na ampicylinę poprzez rekombinację homologiczną ¹¹ oraz metodę modyfikacji fosmidów nicieni w celu przeniesienia genu unc-119 za pomocą rekombinacji Cre-lox w celu wytworzenia zwierząt transgenicznych ¹². Plazmidy są dostępne w Addgene Inc. (Cambridge, MA).

Choć nakład pracy związany z przeprowadzeniem pojedynczego bombardowania jest znaczny, lecz możliwy do opanowania, dodatkowa praca związana z wykonaniem wielu bombardowań w ciągu jednego dnia jest minimalna. W związku z tym rutynowo grupujemy produkcję nicieni transgenicznych, aby zmniejszyć nakład pracy potrzebny do wytworzenia każdego z nich.

1. Przygotowanie płytki z jajami

Mutanty nicieni unc-119 są trudne do hodowli na standardowych płytkach NGM, ponieważ ze względu na upośledioną mobilność mają tendencję do głodowania w niektórych częściach płytki, podczas gdy w innych wciąż znajduje się pożywka. Płytki z jajkami (egg plates) rozwiązują ten problem, ponieważ gruba warstwa pożywki na takich płytkach umożliwia nicieniom unc-119 łatwiejsze pełzanie i zajęcie całej powierzchni płytki ⁷. Płytki z jajkami mają również tę zaletę, że wspierają wzrost dużej liczby nicieni, dzięki czemu wymagane jest mniej płytek ¹³. Zazwyczaj 5 płytek z jajkami wystarcza do wyhodowania nicieni na jedną sesję bombardowania. Poniższa receptura pozwala na przygotowanie około 50 płytek, ale w razie potrzeby można ją zmniejszyć o połowę, aby przygotować mniejszą liczbę.

Płytki z jajami mogą ulec łatwemu zanieczyszczeniu, dlatego w płytkach stosujemy zarówno antybiotyki, jak i leki przeciwgrzybicze, a do zasiewu płytek wykorzystujemy wyłącznie jaja poddane traktowaniu podchlorynem.

Dzień 1:

1. Przygotować LB (400 mL) w butelce o pojemności 500 mL. Autoklawować przez 20 min.
2. Wylać ok. 50 płytek NGA o średnicy 10 cm, używając 1 litra NGA z 2% agar. Dodajemy nystatynę w ilości 10 mL na litr oraz streptomycynę do stężenia 200 μg/mL ¹³.
3. Wyhodować 40 mL kultury nocnej OP50-1 w LB z dodatkiem 200 μg/mL streptomycyny. Szczep ten jest oporny na streptomycynę i dostępny w CGC.
4. Autoklawować butelkę 500 mL na następny dzień.

Dzień 2:

1. Oddziel żółtka z 10 kurzych jaj do sterylnej butelki. Używamy do tego separatora żółtek (dostępnego w sklepach z artykułami gospodarstwa domowego, np. w Target). Wstrząśnij.
2. Uzupełnij objętość do 400mL za pomocą pożywki LB. Wstrząśnij.
3. Inkubuj w temperaturze 60°C przez 1 godzinę.
4. Ostudź do temperatury pokojowej.
5. Dodaj 40mL szczepu OP50-1. Wstrząśnij.
6. Rozlej po 5-8 mL mieszaniny na każdą płytkę.
7. Pozostaw płytki w temperaturze pokojowej na noc, aby zastygły.

Dzień 3:

1. Ostrożnie odlej pozostały płyn z płytek. Pozostaw do wyschnięcia pod przykryciem w temperaturze pokojowej przez noc.

Dzień 4:

1. Umieść płytki w pudełku lub plastikowej torebce i przechowuj w temperaturze 4°C do momentu użycia. Płytki te wydają się być zdatne do użytku przez 1-2 miesiące.

2. Wysiewanie płytek z jajami

1. Namnóż nicienie DP38 na płytkach NGA 6 cm, dodając stężony OP50 do niedawno zagłodzonych płytek. W przypadku pojedynczego bombardowania używamy około 6 małych płytek do zaszczepienia 5 płytek z jajami. Przy wielokrotnych bombardowaniach używamy małych płytek do zaszczepienia 2 płytek z peptone liofilizowanym przed zaszczepieniem płytek z jajami.
2. Wyizoluj jaja z nicieni DP38 przy użyciu podchlorynu ^13,14. Resuspenduj jaja w sterylnych buforach S-basal lub M9 ^13,14.
3. Przenieś jaja (>10 000 na płytkę) na odpowiednią liczbę płytek z jajami. Hoduj nicienie na płytkach z jajami w temperaturze 20°C przez 7–10 dni do czasu bombardowania. Płytki będą gotowe do użycia, gdy nicienie zaczną oczyszczać płytki z pożywki. Płytki te są bardzo trudne do zagłodzenia, a dłuższa hodowla zwiększy wydajność nicieni.

Bombardowanie

Złoty roztwór zapasowy przygotowujemy z wyprzedzeniem i przechowujemy w temperaturze 4°C do czasu użycia. Potrzebne są również płytki NGA o średnicy 10 cm, zarówno niepunktowane, jak i punktowane. Płytki niepunktowane muszą zostać wlane odpowiednio wcześniej i całkowicie wysuszone, aby ułatwić absorpcję cieczy dodawanej wraz z nicieniami.

W dniu bombardowania najpierw myjemy nicienie, a następnie przystępujemy do przygotowania nanocząsteczek złota pokrytych DNA. Następnie przenosimy nicienie na niepunktowane płytki NGA, po czym kończymy płukanie nanocząsteczek złota i przenosimy je do makronośników.

Przygotowanie cząsteczek złota:

1. Odważyć 60mg cząsteczek złota do probówki 1,7mL i namoczyć w 70% etanolu przez 15min. Odwirować krótko w celu wytrącenia cząsteczek złota.
2. Przemyć 3 razy w sterylnej wodzie, za każdym razem odwirując krótko w celu zebrania złota.
3. Resuspendować złoto w 1mL 50% sterylnego glicerolu. Jest to roztwór zapasowy cząsteczek złota, który można przechowywać przez wiele miesięcy w temperaturze 4°C.

Nicienie:

1. Zmyj robaki DP38 z płytek z jajami, używając buforu S-basal lub M9, a następnie przenieś je do probówki stożkowej o pojemności 50mL.
2. Pozostaw probówki na blacie, aż robaki opadną na dno. Następnie odessij bufor i dodaj świeży S-basal lub M9. Powtórz płukanie 2 lub 3 razy, aż bufor będzie względnie wolny od zanieczyszczeń. Przechowuj robaki na tym etapie do momentu zakończenia powlekania DNA.
3. Odessij bufor, pozostawiając około 2-3 mL zawiesiny robaków na jedną sesję bombardowania. Przenieś zawiesinę na nieoznaczoną płytkę NGA o średnicy 10 cm umieszczoną na lodzie. Ważne jest zminimalizowanie przenoszonej objętości, ponieważ płytka NGA musi całkowicie wyschnąć przed bombardowaniem. Upewnij się, że robaki pokrywają całą powierzchnię płytki.
4. Pozostaw płytkę do wyschnięcia na lodzie. Lód zapobiegnie zlepianiu się robaków podczas procesu suszenia.

Ten krok jest istotny: płytka powinna być sucha, a nicie równomiernie rozproszone na płytce NGA. Przechowywanie nicieni w lodzie zapobiega ich przemieszczaniu się po płytce i agregowaniu w skupiska.

Przygotowanie DNA (dla jednej serii bombardowania):

1. W probówce 1,7 mL zmieszać:
   • 50 μl cząsteczek złota. Przed dodaniem należy dokładnie resuspender.
   • 50 μl DNA (10-15 μg). Nie zauważyliśmy większej różnicy między DNA kolistym a liniowym. Do oczyszczania DNA zazwyczaj stosujemy wkłady Qiagen midiprep (Qiagen Inc., Valencia, CA).
   • 50 μl 2,5 M CaCl₂. Roztwór ten jest stabilny przez kilka tygodni w temperaturze pokojowej.
   • 20 μl 0,1 M spermidyny.
     
     Spermidyna jest niestabilna w roztworze wodnym. Przygotowujemy alikwoty spermidyny po 16 μl i przechowujemy w -20°C. Bezpośrednio przed użyciem dodajemy 1 mL wody, aby otrzymać roztwór 0,1 M. Roztwór ten musi być świeżo przygotowany do każdego bombardowania.
     
     Zazwyczaj mieszamy cząsteczki złota w probówce 1,7 mL za pomocą wirówki typu vortex z niską prędkością, a następnie kroplami dodajemy CaCl₂, DNA i spermidynę/protaminę podczas wciąż trwającego mieszania. Technika ta jest znana osobom, które przeprowadzały transfekcję z użyciem fosforanu wapnia.
     
     Stosowaliśmy również protaminę zamiast spermidyny, uzyskując bardzo dobre wyniki ¹⁵. Przygotowujemy świeży roztwór (1 mg/mL) w wodzie i używamy 50 μl zamiast 20 μl spermidyny. W przypadku stosowania protaminy zazwyczaj inkubujemy mieszaninę w temperaturze pokojowej przez 10 minut zamiast umieszczać ją na lodzie. Protaminy nie trzeba przechowywać w zamrażarce i występuje ona w formie proszku, a nie cieczy.
2. Inkubować mieszaninę na lodzie przez 30 min, okresowo mieszając w celu utrzymania cząsteczek złota w zawiesinie. Następnie krótko wirować i odessać nadsącz.
3. Przemyć 300 μl 70% etanolu. Krótko wirować.
4. Przemyć 1 mL 100% etanolu. Krótko wirować.
5. Resuspender w 170 μl 100% etanolu.

Przygotowanie makronośników:

1. Wypłucz 7 makronośników (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) w 2-propanolu. Połóż je na ręczniku papierowym i pozostaw do wyschnięcia w temperaturze pokojowej.
2. Nanieś 20μl mieszaniny DNA/złota na środek każdego makronośnika. Przed pipetowaniem należy dokładnie wymieszać zawiesinę w wirówce (vortex), aby złoto pozostało w zawiesinie.
3. Pozostaw etanol do odparowania.

3. Bombardowanie

Przed rozpoczęciem eksperymentu należy przeprowadzić pusty ostrzał, aby przepłukać układ hellem.

1. Włącz pompę próżniową i zamknij pułapkę pompy próżniowej. Stosujemy beztłuszczową pompę próżniową.
2. Otwórz butlę z helem. Upewnij się, że ciśnienie wynosi ≥2200psi.
3. Namocz membranę bezpieczeństwa (1350 psi) w 2-propanolu, umieszczając ją w nakrętce mocującej adapter hepta.
4. Wkręć adapter do systemu PDS-1000 i dokręć go za pomocą dołączonego klucza dynamometrycznego.
5. Umieść 7 makronośników w uchwycie i osadź je za pomocą dołączonego narzędzia. Następnie na uchwycie umieść sito stopowe hepta oraz dno. Odwróć uchwyt i umieść go na drugiej półce od góry. W tym momencie strona makronośników z złotymi kropkami musi być skierowana w dół.
6. Wyrównaj otwory w górnej części uchwytu makronośników z wylotami adaptera hepta.
7. Umieść płytkę NGA z naniesionymi niciami (bez pokrywki) na najniższej półce w komorze bombardowania.
8. Całkowicie otwórz pokrętło przepływu próżni w systemie PDS-1000. Naciskaj przycisk vac, aż ciśnienie w komorze osiągnie 26 In Hg. Następnie przełącz do pozycji hold, aby utrzymać próżnię.
9. Naciśnij i przytrzymaj przycisk fire, aż membrana pęknie. Nastąpi to, gdy ciśnienie osiągnie 1350psi. Czasami trwa to od 5 do 20 sekund. Zwolnij przycisk.
10. Zwolnij próżnię z komory (pozycja vent) i wyjmij płytkę.
11. Wyłącz pompę próżniową i dopływ helu.
12. Uruchom funkcję fire kilka razy, aż linia nie będzie zawierać helu (manometr helu powinien wskazywać 0 psi).
13. Wyłącz system PDS-1000.

Odzyskiwanie nicieni po bombardowaniu:

1. Pozostaw płytkę po bombardowaniu w temperaturze 20°C na 20 minut.
2. Zmyj nicienie z płytki, używając 10 mL buforu S-basal lub M9.
3. Przenieś po 0,5 mL zawiesiny nicieni na 20 płytek NGA o średnicy 10 cm z naniesionymi punktami.
4. Inkubuj w temperaturze 20°C lub w temperaturze pokojowej (22-24°C) przez około 2 tygodnie przed sprawdzeniem obecności uratowanych nicieni.
5. Przesiewaj nicienie pod mikroskopem stereoskopowym w poszukiwaniu fenotypu unc-119(+). Optymalnym momentem na przesiewanie jest czas po zagłodzeniu populacji na płytkach, ponieważ uratowane nicienie mają przewagę przeżywalności nad osobnikami nieuratowanymi.
6. Wyizoluj jedną linię osobniczą z każdej płytki 10 cm, na której znajdowały się uratowane nicienie.

4. Reprezentatywne wyniki

Sukces protokołu w zakresie uzyskania zwierząt transgenicznych zależy od konkretnego transgenu. W przypadku transgenów reporterowych promotor:GFP uzyskaliśmy do 20 linii. Typowy wynik to od 3 do 10 linii. Do 30% linii transgenicznych to linie zintegrowane, jednak dzieje się to losowo, dlatego w przypadku szczególnego zapotrzebowania na linię zintegrowaną przeprowadzamy wielokrotne bombardowania w ciągu jednego dnia.

Dyskusja

Bombardowanie biolistyczne jest prostą metodą wprowadzania obcego DNA do wielu organizmów, w tym C. elegans ^1,5,6,7,16. Opiera się ono na tworzeniu kompleksu cząsteczek złota z DNA w obecności CaCl₂. Kationowe poliaminy, takie jak spermidyna, chronią DNA przed degradacją przez nukleazy in vivo. Ponieważ spermidyna jest cząsteczką labilną, ważne jest przechowywanie jej w małych aliquotach w temperaturze -20°C i przygotowanie roztworu bezpośrednio przed przeprowadzeniem bombardowania. Jak opi...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Cząsteczki złota	Inbio gold	BD021	1micron
Zestaw do Midiprep	Qiagen	12143
Spermidyna	Sigma-Aldrich	S4139
Protamina	Sigma-Aldrich	P4505
Makronośniki	Bio-Rad	165-2335
System PDS-1000/He Hepta	Bio-Rad	165-2257
Membrana pękająca	Bio-Rad	165-2330
Nystatyna	Sigma-Aldrich	N1638
Streptomycyna	MP Biomedicals	100556