Wtryskiwanie doszpikowe u dorosłych danio prążkowanych

Podsumowanie

Prezentujemy technikę wstrzykiwania dosytniewnego u dorosłych rybek danio-ostrobramkowych. Używamy mikrosyringi NanoFil o pojemności 10 μl, sterowanej za pomocą kontrolera Micro4 oraz pompy UltraMicroPump III. Demonstracja obejmuje wykorzystanie zimnej wody jako środka znieczulającego.

Streszczenie

Wygodną metodą chemicznego traktowania rybek zebrafish jest wprowadzenie odczynnika do wody w zbiorniku, skąd zostanie on pobrany przez ryby. Metoda ta utrudnia jednak określenie ilości odczynnika wchłoniętego lub pobranego przez pojedynczą rybę. Niektóre pytania badawcze, szczególnie te związane z badaniami metabolicznymi, mogą zostać lepiej rozwiązane poprzez podanie każdej rybie określonej ilości substancji, w zależności od jej masy ciała. Przedstawiamy tutaj metodę iniekcji doszpikowej (IP) u dorosłych rybek zebrafish. Iniekcję wykonuje się w jamę brzuszną, za obrębiem pasa miednicznego. Procedura ta została zaadaptowana z metod weterynaryjnych stosowanych u większych ryb. Jest ona bezpieczna, ponieważ nie zaobserwowano żadnych śmiertelności. Dodatkowo krwawienie w miejscu iniekcji wystąpiło tylko w 5 ze 127 przypadków, a w każdym z nich krwawienie było krótkotrwałe, trwało kilka sekund, a utracona ilość krwi była niewielka. Sukces tej procedury wymaga delikatnego obchodzenia się z rybami na kilku etapach, w tym podczas głodzenia, ważenia, znieczulania, iniekcji i rekonwalescencji. Wymagane są środki ostrożności w celu zminimalizowania stresu podczas całej procedury. Nasze środki ostrożności obejmują zastosowanie małej objętości iniekcji oraz igły 35G. Jako nośnik stosujemy roztwór soli Cortland, który jest zrównoważony osmotycznie dla ryb słodkowodnych. Napowietrzanie skrzeli podczas procedury iniekcji jest utrzymywane poprzez wprowadzenie ryby w stan znieczulenia chirurgicznego, co pozwala na powolne ruchy pokrywy skrzelowej, a następnie poprzez trzymanie ryby w rynience wewnątrz nasączonej wodą gąbki podczas samej iniekcji. Przydatność iniekcji IP demonstrujemy poprzez podanie glukozy i monitorowanie wzrostu poziomu glukozy we krwi oraz jej późniejszy powrót do normy. Ponieważ wiadomo, że stres zwiększa poziom glukozy we krwi u ryb kostnoszkieletowych, porównujemy poziomy glukozy we krwi u dorosłych osobników po iniekcji nośnika oraz u osobników niepoddanych iniekcji, wykazując, że procedura nie powoduje istotnego wzrostu poziomu glukozy we krwi.

Protokół

1. Przygotowania przed wstrzykiwaniem

1. Poddać ryby postowi przez co najmniej 24 godziny przed wstrzyknięciem. Pozwoli to na opróżnienie zawartości żołądka (cebulki jelitowej). Podstawowy protokół postu polega na przeniesieniu ryb, przy zachowaniu ich normalnej gęstości zasiedlenia, do czystego zbiornika, a następnie wstrzymaniu podawania pokarmu. W przypadku dłuższego postu wymagającego bardziej rygorystycznych warunków (np. do badań poziomu glukozy we krwi), należy zapoznać się z dodatkowymi uwagami w sekcji Dyskusja.
2. Przygotować roztwór soli Cortlanda (Perry et al., 1984).
   Aby otrzymać objętość 100 mL, rozpuścić w wodzie destylowanej następujące składniki:
   725 mg NaCl (124,1 mM)
   38 mg KCl (5,1 mM)
   41 mg Na₂HPO₄ (2,9 mM)
   24 mg MgSO₄∙7H₂O (1,9 mM)
   16 mg CaCl₂∙2H₂O (1,4 mM)
   100 mg NaHCO₃ (11,9 mM)
   4 g poliwinylopirolidonu (PVP) (4%)
   1000 jednostek USP heparyny
   Przefiltrować, wysterylizować i przechowywać w temperaturze 4°C.
3. Przygotować mikroskop.
   • Przykryć podstawę mikroskopu folią plastikową w celu ochrony przed rozlaniem cieczy.
   • Na folię plastikową położyć ręcznik papierowy. Na ręczniku papierowym zostanie umieszczony stół chirurgiczny.
   • Wstępnie ustawić ostrość, obserwując stół chirurgiczny i ustawiając ostrość na gąbce.
   Wskazówka: Położyć palec na gąbce i ustawić na nim ostrość. Pozwoli to wyeliminować lub zminimalizować konieczność dalszej korekty ostrości po umieszczeniu ryby na stole chirurgicznym.
4. Zważyć ryby.
   • Napełnić zlew 500 mL w około 1/3 wodą z hodowli ryb.
   • Tarować wagę.
   • Odłowić rybę za pomocą siatki. Usunąć nadmiar wody z siatki i ryby, krótko przykładając siatkę do ręczników papierowych. Przenieść rybę do zlewka.
   • Zważyć rybę.
   • Przenieść rybę do czystego zbiornika.
   • Przenieść każdą zważoną rybę do oddzielnego, opisanego zbiornika.
   • Obliczyć objętość wstrzyknięcia dla każdej ryby na podstawie jej masy.
5. Przygotować strzykawkę i powiązany sprzęt do iniekcji. Do wstrzykiwania zaleca się stosowanie ściętej stalowej igły 35G oraz mikrosstrzykawki NanoFil 10 μl. Przygotować strzykawkę NanoFil i dren silflex zgodnie z instrukcją producenta. Ważne jest usunięcie wszystkich pęcherzyków powietrza ze strzykawki i drenu. Po napełnieniu strzykawki i drenu, zamontować strzykawkę w pompie i zaprogramować objętość wstrzyknięcia dla pierwszej ryby.
6. Przygotować stół chirurgiczny.
   • Odciąć miękką gąbkę (np. #L800-D, Jaece Industries) tak, aby jej wysokość wynosiła około 20 mm. Na płaskiej powierzchni wykonać nacięcie o głębokości 10-15 mm. Nacięcie to stanowi rynnę, w której ryba będzie spoczywać podczas iniekcji.
   • Umieścić gąbkę w szalce Petriego o średnicy 60 mm.
   • Umieścić szalkę Petriego z gąbką w pokrywce od pudełka z kończykami do pipet o odpowiednim rozmiarze. Pokrywka musi być na tyle duża, aby pomieścić wodę pomagającą utrzymać temperaturę gąbki, ale jednocześnie na tyle płytka, aby nie przeszkadzać w pracy. Stosujemy pokrywkę z pudełka kończyków P200 o wymiarach 11,4 cm dł. x 7,7 cm szer. x 1,5 cm gł.
   Te trzy elementy złożone razem (gąbka w szalce Petriego w pokrywce pudełka) stanowią stół chirurgiczny.
7. Przygotować środek anestetyczny.
   • Przygotować kruszony lód z kostek wykonanych z wody z hodowli ryb.
   Wskazówka: Przy użyciu typowych foremek do kostek lodu, potrzeba będzie 3 foremek do znieczulenia 10-12 ryb.
   • Napełnić czysty kubełek do lodu kruszonym lodem.
   • Umieścić stół chirurgiczny w większym pojemniku, np. w pojemniku do przechowywania żywności Rubbermaid o pojemności 2,4 litra.
   • Wlać nieco wody z hodowli (ciepłej) do zewnętrznego pojemnika oraz na stół chirurgiczny. Trzymać w pobliżu zapas ciepłej wody z hodowli.
   • Włożyć termometr do zewnętrznego pojemnika.

2. Znieczulenie, iniekcja i rekonwalescencja

1. Umieść zewnętrzny pojemnik anestetyczny wraz ze stołem chirurgicznym obok mikroskopu. Przygotuj w pobliżu wiadro z kruszonką lodową.
2. Obniż temperaturę wody do 17°C, dodając kruszonkę lodową. Ważne: na tym etapie nie należy schodzić poniżej 17°C.
3. Użyj siatki, aby przenieść rybę do zewnętrznego pojemnika.
4. Powoli dodawaj kruszonkę lodową do pojemnika, aby w ciągu kilku minut obniżyć temperaturę do 12°C.
5. Monitoruj zachowanie ryby: w temperaturze 17°C lub nieco niższej ryba zazwyczaj rozprostowuje płetwy piersiowe poziomo, łapie powietrze i wykazuje szybkie ruchy pokryw skrzelowych. W miarę spadku temperatury ryba będzie pływać wolniej, aż w końcu przestanie się poruszać. W miarę zbliżania się do chirurgicznej płaszczyzny znieczulenia łapanie powietrza ustanie, a ruchy pokryw skrzelowych spowolnią. Ryba jest gotowa do iniekcji, gdy nie reaguje na dotyk. Dla większości ryb temperatura 12°C jest wystarczająca. Większe ryby mogą wymagać chłodniejszej wody.
6. Po osiągnięciu wymaganej temperatury (~12°C lub niższej), naciśnij gąbkę, aby ją nasączyć.
7. Zanurz palce w zimnej wodzie na tyle długo, aby nie ogrzały one ryby i nie doprowadziły do wybudzenia z anestezji podczas manipulacji.
8. Zimnymi palcami delikatnie przenieś rybę do rynienki gąbki. Ułóż rybę brzuchem do góry, z skrzelami w rynience.
9. Szybko przenieś stół chirurgiczny na stolik mikroskopu.
10. Pracując sprawnie, ostrożnie wprowadź igłę w linii środkowej między płetwami brzusznymi. Igła powinna być skierowana kranialnie i wprowadzona bliżej obręczy miednicznej niż odbytu. Powinieneś wyczuć moment, w którym igła przebija ścianę ciała. Wstrzyknij odpowiednią objętość i wyjmij igłę.
11. Po iniekcji natychmiast przenieś rybę z powrotem do zbiornika z ciepłą wodą (~28,5°C) w celu rekonwalescencji, uwalniając rybę z gąbki nad wodą w zbiorniku.
    Wskazówka: Jeśli ryba nie zacznie natychmiast pływać, pomóż jej w rekonwalescencji, delikatnie kierując strumień wody w stronę skrzeli.
12. Sprawdź igłę. Sporadycznie może do niej przywrzeć łuska, którą należy usunąć przed kolejną iniekcją.
13. Przy kolejnych iniekcjach użyj ciepłej wody z instalacji, aby podnieść temperaturę wody w komorze anestetycznej z powrotem do 17°C przed wprowadzeniem kolejnej ryby.

3. Reprezentatywne wyniki:

Rysunek 1. Reprezentatywne wyniki po podaniu dosytronicznie 0,5 mg/g glukozy lub nośnika. Ryby były głodzone przez 72 godziny przed wstrzyknięciem. Oś X przedstawia czas po wstrzyknięciu. Średnia ± SEM.

Dyskusja

Iniekcja doszprownicza składa się z pięciu etapów: głodzenia, ważenia, znieczulenia, iniekcji i rekonwalescencji. Dla każdego z tych etapów istnieją optymalne praktyki, które pozwalają zapewnić sukces. Sukces ten obejmuje zarówno zdrowie pacjenta (ryby), jak i prawidłowy wynik eksperymentu.

Głodzenie: 24-godzinne głodzenie powinno opróżnić cebulkę jelitową. Praktyka ta pochodzi z literatury weterynaryjnej dotyczącej ryb (np. Brown 1993). Dodatkowe kwestie dotyczące głodzenia omówiono poniżej.

Dłuższy post: Stwierdziliśmy, że wymagany jest 72-godzinny post, aby obniżyć poziom glukozy we krwi do poziomu bazowego przed iniekcją (Eames et al., 2010). Doszliśmy również do wniosku, że w badaniach nad glukozą konieczne jest zastosowanie kilku procedur, aby upewnić się, że ryby są odpowiednio pościły. Należy zacząć od czystego zbiornika (bez osadów na dnie). Zbiorniki powinny być odseparowane od systemu, wyraźnie oznakowane jako „post” i umieszczone w miejscu, w którym entuzjastyczny personel opiekuńczy nie będzie ich karmić. Należy ocenić środowisko zewnętrzne zbiornika i podjąć kroki w celu zapobiegania stresowi ryb wywołanemu zakłóceniami, ponieważ wiadomo, że stres podnosi poziom glukozy we krwi (Chavin and Young, 1970; Groff et al., 1999). Na przykład przeprowadziliśmy eksperyment z postem, podczas którego na stole z akwariami codziennie włączone było radio. Stwierdziliśmy, że poziom glukozy we krwi był niezwykle wysoki i wyciągnęliśmy wniosek, że ryby były zestresowane wibracjami. Innym stresorem jest przeludnienie. Ryby powinny być utrzymywane w zagęszczeniu zgodnym z dobrymi praktykami hodowlanymi. Zalecenia w tym zakresie można znaleźć u Brand et al. (2002) oraz Westerfield (1995). Dobre wyniki osiągnęliśmy, stosując post przy zagęszczeniu 10-12 ryb w zbiorniku o pojemności 9 liter (przy czym 3 warstwy szklanych kulek zajmowały część tej objętości). Separacja płci może powodować stres, dlatego zalecamy utrzymywanie populacji mieszanej podczas postu. Oznacza to, że może dojść do złożenia ikry, którą należy odseparować, aby nie została zjedzona. Prostym sposobem odseparowania ikry jest pokrycie dna zbiornika 2-3 warstwami szklanych kulek. Jakość wody należy utrzymać poprzez usuwanie ikry i odpadów oraz codzienną wymianę około 10-15% wody w zbiorniku. Do usuwania ikry i odpadów dobrze sprawdza się syfonowanie.

Ważenie: Podczas ważenia ryb nieznieczulonych należy zachować ostrożność, aby zminimalizować przenoszenie wody z sieci do zlewki, co zapewni dokładny pomiar masy. Jeśli sieć (z rybą) zostanie osuszona ręcznikami papierowymi, można usunąć większość nadmiaru wody i precyzyjnie zmierzyć wagę. Łatwiejsze może być znieczulenie ryb przed ważeniem, jednak nie badaliśmy możliwych skutków dwukrotnego znieczulania ryby w ciągu jednego dnia. Przetestowaliśmy naszą technikę, ważąc najpierw ryby metodą osuszania sieci, a następnie ważąc je ponownie po znieczuleniu i delikatnym osuszeniu. Nie stwierdzono istotnych różnic w masie między tymi metodami (P = 0.7927, t-test). Dodatkowo sprawdziliśmy, czy metoda osuszania sieci wpływa na poziom glukozy we krwi w porównaniu z prostym przeniesieniem ryby do zlewki natychmiast po złapaniu w sieć (bez osuszania). Nie stwierdzono istotnych różnic w poziomie glukozy we krwi między dwiema metodami przenoszenia (P = 0.2241, t-test).

Znieczulanie: Znieczulenie chemiczne może być odpowiednie dla wielu badań. W niniejszej procedurze zaprezentowaliśmy znieczulenie zimną wodą jako alternatywę, ponieważ wiele środków znieczulających (w tym tricaina/MS-222 (Brown, 1993)) podnosi poziom glukozy we krwi. W poprzednich badaniach ustaliliśmy, że zimna woda nie podnosi poziomu glukozy we krwi u danio pręgowanych (Eames et al., 2010).
W przypadku znieczulenia zimną wodą temperaturę należy obniżać powoli. Tempo obniżania wydaje się zależeć od wielkości ryby; mniejsze ryby zapadają w stan znieczulenia szybciej niż ryby większe. Po wstrzyknięciu można zaobserwować, że ryba zbyt wolno budzi się z narkozy (patrz. poniżej). Może to wynikać z faktu, że temperatura początkowa była zbyt niska lub temperatura została obniżona zbyt gwałtownie. Temperatura początkowa jest zbyt niska, jeśli ryba wygina się bocznie po zanurzeniu w wodzie. Jeśli temperatura początkowa jest prawidłowa, ryba początkowo zachowa równowagę. Przesunie płetwy piersiowe do pozycji poziomej, będzie łapać powietrze i wykaże szybkie ruchy operculum. Zazwyczaj będzie pływać. W miarę obniżania temperatury ruchy będą słabnąć, a ryba straci równowagę. Chirurgiczny poziom znieczulenia zostaje osiągnięty, gdy ryba nie reaguje na manipulacje. Aby utrzymać rybę w stanie znieczulenia chirurgicznego, palce muszą być zimne, dlatego należy trzymać je w wodzie przed kontaktem z rybą. Gąbka również musi być utrzymywana w niskiej temperaturze, identycznej z temperaturą wody użytej do znieczulenia ryby. Ważne jest, aby nasączyć gąbkę wodą wystarczająco zimną, by utrzymać znieczulenie po umieszczeniu na niej ryby.

Iniekcja: Przed przystąpieniem do iniekcji warto przeprowadzić sekcję co najmniej jednej ryby, aby ocenić grubość ściany ciała. Pomoże to określić, na jaką głębokość należy wprowadzić igłę, aby dostać się do jamy brzusznej. Ponadto podczas wprowadzania igły można wyczuć „opór” ściany ciała w momencie wniknięcia igły do jamy brzusznej. Podczas iniekcji należy podjąć kroki zapewniające dobrostan zwierzęcia. Należy upewnić się, że gąbka jest nasycona zimną wodą o odpowiedniej temperaturze, aby zapobiec wybudzeniu się ryby podczas zabiegu. Dobrze nasączona i miękka gąbka jest istotna dla zminimalizowania uszkodzeń łusek oraz warstwy śluzowej skóry. Dobrze nasączona gąbka jest również kluczowa dla zapewnienia napowietrzania skrzeli. Zdecydowanie zalecamy użycie gąbki piankowej wymienionej poniżej w sekcji Materiały. Na koniec, po znieczuleniu ryby, należy pracować szybko, aby zminimalizować czas przebywania zwierzęcia pod wpływem środka znieczulającego.

Wybudzanie: Ryba powinna dojść do siebie po znieczuleniu niemal natychmiast po wprowadzeniu do ciepłej wody w zbiorniku. Jeśli ryba nie zacznie od razu pływać, należy delikatnie zakręcić wodą w stronę skrzeli, aby przyspieszyć wybudzanie. Powolne wybudzanie świadczy o zbyt szybkim wprowadzeniu w stan znieczulenia i wymaga odpowiedniej korekty procedury znieczulania. Możliwe przyczyny powolnego wybudzania są omówione w sekcji Znieczulanie.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Gąbka piankowa	Jaece Industries	L800-D
Szalka Petriego 60 mm
Pokrywa pudełka na końcówki do pipet			niezbyt głęboka, np. 1,5 cm
Plastikowy pojemnik do przechowywania			głęboki, np. 7 cm
Termometr
Kruszony lód			przygotowany z wody kranowej
Ciepła woda kranowa			1 litr lub więcej
Zlewka 500 ml			do odważania
Strzykawka NanoFil	World Precision Instruments, Inc.	NANOFIL	lub strzykawka Hamiltona
Igła G35	World Precision Instruments, Inc.	NF35BV-2	skośna
Przewód Silflex	World Precision Instruments, Inc.	SILFLEX-2
Pompa UltraMicroPump III i kontroler Micro4	World Precision Instruments, Inc.	UMPS-1
Przełącznik nożny	World Precision Instruments, Inc.	15867
Mikroskop sekcyjny
Folia spożywcza
Ręczniki papierowe
Roztwór soli Cortland