Przygotowanie podatnych macierzy do ilościowego pomiaru skurczu komórkowego

Podsumowanie

W tym filmie prezentujemy techniki eksperymentalne wykorzystywane do wytwarzania elastycznych podłoży powleczonych macierzą zewnątrzkomórkową (ECM), które nadają się do hodowli komórkowej oraz pozwalają na zastosowanie mikroskopii sił trakcyjnych i obserwację wpływu sztywności ECM na zachowanie komórek.

Streszczenie

Regulacja adhezji komórkowej do macierzy pozakomórkowej (ECM) jest niezbędna dla migracji komórek i przebudowy ECM. Adhezje ogniskowe to makromolekularne kompleksy, które łączą kurczliwy cytoszkielet z F-aktyny z ECM. Połączenie to umożliwia przekazywanie wewnątrzkomórkowych sił mechanicznych przez błonę komórkową do znajdującego się pod nią podłoża. Niedawne badania wykazały, że właściwości mechaniczne ECM regulują morfologię adhezji ogniskowych i F-aktyny, a także liczne procesy fizjologiczne, w tym różnicowanie, podział, proliferację i migrację komórek. W związku z tym stosowanie podłoży do hodowli komórkowej stało się coraz bardziej rozpowszechnioną metodą precyzyjnego kontrolowania i modulowania właściwości mechanicznych ECM.

Aby ilościowo określić siły trakcyjne w adhezjach ogniskowych w komórce przylegałej, stosuje się podatne podłoża w połączeniu z obrazowaniem o wysokiej rozdzielczości oraz technikami obliczeniowymi w metodzie zwanej mikroskopią sił trakcyjnych (TFM). Technika ta opiera się na pomiarach lokalnej wartości i kierunku deformacji podłoża wywołanych skurczem komórkowym. W połączeniu z wysokorozdzielczą mikroskopią fluorescencyjną białek znakowanych fluorescencyjnie, możliwe jest skorelowanie organizacji i przebudowy cytoszkieletu z siłami trakcyjnymi.

W niniejszej pracy przedstawiamy szczegółowy protokół eksperymentalny przygotowania dwuwymiarowych, podatnych macierzy w celu stworzenia podłoża do hodowli komórkowej o dobrze scharakteryzowanej, regulowanej sztywności mechanicznej, odpowiedniego do pomiaru skurczu komórkowego. Protokoły te obejmują wytwarzanie hydrożeli poliakryloamidowych, powlekanie takich żeli białkami ECM, wysiew komórek na żele oraz wysokorozdzielczą mikroskopię konfokalną z wykorzystaniem komory perfuzyjnej. Dodatkowo przedstawiamy reprezentatywną próbkę danych obrazujących lokalizację i wielkość sił komórkowych przy użyciu cytowanych protokołów TFM.

Protokół

1. Aktywacja powierzchni szkiełka nakrywkowego

1. Kryszalki (#1.5, 22x40 mm) są czyszczone poprzez serię przemyć mydłem i etanolem zgodnie z wcześniej opisanym protokołem (Waterman-Storer, 1998) w celu ich oczyszczenia i usunięcia kurzu.
2. Umieścić kryszalki w stojaku z nierdzewnej stali w taki sposób, aby były od siebie oddalone i nie stykały się.
3. W dygestorium (zaleca się stosowanie rękawic nitrylowych i okularów ochronnych) rozcieńczyć pełny stężenie 3-aminopropyltrimethoxysilane w izopropanolu do stężenia końcowego 2% (2ml silanu /100 ml izopropanolu), aby wypełnić kwadratową szklaną korytko (objętość ~350ml). Ze względu na reaktywność z tworzywami sztucznymi, należy użyć szklanej pipety Pasteura do dodania 3-aminopropyltrimethoxysilane do izopropanolu.
4. Całkowicie zanurzyć kryszalki z punktu 1.2 w tym roztworze na 10 min, delikatnie mieszając na mieszadle magnetycznym w dygestorium.
5. Przemyć kryszalki, zanurzając je w ddH₂O (4 wymiany wody). Ostatnią wymianę pozostawić na 10 min przy jednoczesnym mieszaniu. Roztwory zawierające amino-silan należy utylizować jako odpady niebezpieczne.
6. Suszyć kryszalki w inkubatorze w podwyższonej temperaturze (~37°C) przez 10 minut w środowisku wolnym od kurzu.
7. Ostudzić do temperatury pokojowej.
8. W dygestorium zanurzyć kryszalki w 1% roztworze glutaraldehydu w ddH₂O w szklanym kwadratowym korytku na mieszadle magnetycznym na 30 minut.
9. Przemyć poprzez 3 wymiany ddH₂O przez 10 minut na każdą wymianę, przy jednoczesnym mieszaniu. Glutaraldehyd należy utylizować jako odpad niebezpieczny.
10. Suszyć w temperaturze pokojowej, przykrywając folią aluminiową, aby zapobiec osiadaniu kurzu na kryszalkach.
11. Przechowywać w suchym miejscu, z dala od kurzu, do 2 miesięcy.

2. Przygotowanie żelu poliakryloamidowego (PAA)

1. Przygotować roztwory zapasowe mieszaniny akryloamidu/bis-akryloamidu z 40% akryloamidu i 2% bis-akryloamidu zgodnie z Tabelą 1. Przechowujemy kilka roztworów zapasowych zoptymalizowanych dla żeli PAA o różnej sztywności; przykłady wymieniono w Tabeli 1 i 2. Roztwory zapasowe mogą być przechowywane przez kilka lat, pod warunkiem utrzymywania ich w ciemnej butelce w temperaturze 4 C.
2. Roztwory robocze zawierające końcowe pożądane stężenia akryloamidu/bis-akryloamidu otrzymuje się z roztworów zapasowych. Na przykład przygotowujemy roztwór roboczy 7,5% akryloamidu/0,10% bis-akryloamidu w ddH₂O do wytwarzania żeli PAA o sztywności 2,8kPa.
3. Odgazować roztwór akryloamidu w komorze próżniowej przez 20 min, aby zmniejszyć ilość tlenu w roztworze, który zapobiega polimeryzacji PAA.
4. Przygotować 10% roztwór persiarczanu amonu (APS) (0,5g/5mL). Świeżego zapasu roboczego należy użyć w ciągu 3 dni. Alternatywnie zapasy można zamrozić, aby wykorzystać je w późniejszym terminie.
5. Podczas odgazowywania akryloamidu energicznie przetrzeć szkiełko przedmiotowe o wymiarach 1x3" chusteczkami Rain-X, aby uczynić powierzchnię szkiełka hydrofobową. Aby usunąć nadmiar Rain-X, przetrzeć szkiełko wilgotną chusteczką Kimwipe. Odstawić szkiełko przykryte.
6. Wyjąć roztwór akryloamidu z komory próżniowej i dodać koraliki fluorescencyjne (1% objętościowo, 5 μl dla roztworu roboczego wymienionego w Tabeli 1). Dodać 0,75μl TEMED i 2,5 μl 10% APS, co zainicjuje polimeryzację żelu. Dobrze wymieszać poprzez pipetowanie przez ok. 5 sec, aby zminimalizować wprowadzanie pęcherzyków powietrza.
7. Nanieść 10-12 μl roztworu akryloamidu na hydrofobowe szkiełko przedmiotowe (przygotowane w kroku 2.4) i położyć aktywowane szkiełko nakrywkowe 22x40mm na wierzchu kropli. Roztwór żelu powinien pokrywać całe szkiełko nakrywkowe. Wypchnąć wszelkie pęcherzyki powietrza, które mogą pojawić się w roztworze. Pozostawić roztwór żelu do polimeryzacji w temperaturze pokojowej przez ok. 10 min.
8. Zakończenie polimeryzacji można ocenić, odwracając pozostały roztwór roboczy w probówce do mikrocentryfugi. Ponadto spolimeryzowany żel może oddzielić się od krawędzi szkiełka nakrywkowego. Natychmiast po zaobserwowaniu makroskopowej polimeryzacji oddzielić szkiełko nakrywkowe od szkiełka przedmiotowego. Używając cienkiej końcówki pęsety lub krawędzi żyletki, ostrożnie zdjąć szkiełko nakrywkowe wraz z przyczepionym żelem z powierzchni szkiełka przedmiotowego i zanurzyć żel w ddH₂O, aby utrzymać nawodnienie.

3. Przyłączanie białek macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM) do żelu PAA

Do przyłączania białek ECM można zastosować trzy odrębne metody: albo do górnej powierzchni żelu PAA (3.1 i 3.2), albo poprzez włączenie białek ECM do objętości żelu (3.3). W niniejszym rozdziale omawiamy sprzęganie fibronektyny z żelami PAA w celu uzyskania gęstości ligandów na powierzchni równoważnej ilości zaadsorbowanej na szkle po inkubacji z roztworem fibronektyny o stężeniu 10 μg/mL przez 1 godzinę. Rozważania dotyczące wyboru metody szczegółowo opisano w dyskusji.

1. Sieciowanie białek ECM z powierzchnią żelu PAA za pomocą Sulfo-SANPAH Reaktywne grupy aminowe w białkach są kowalencyjnie przyłączane do powierzchni żelu PAA za pomocą heterobifunkcyjnego czynnika sieciującego Sulfo-SANPAH
   1. Przygotować robocze alikwoty Sulfo-SANPAH o objętości 40 μl poprzez rozpuszczenie proszku Sulfo-SANPAH w bezwodnym dimetylosulfoksydzie (DMSO) (20 μl na mg Sulfo-SANPAH). Roztwory stokowe zamrozić błyskawicznie w ciekłym azocie i przechowywać w temperaturze -80°C do późniejszego użycia.
   2. Usunąć ddH₂O z powierzchni żelu za pomocą wirówki do szkiełek podstawkowych (< 2 s). Unikać wysuszenia żelu.
   3. Rozcieńczyć alikwoty Sulfo-SANPAH-DMSO w ddH₂O (2 mg/ml, pH 7) bezpośrednio przed użyciem i pokryć powierzchnię żelu (~200 μl). Należy pamiętać, że okres półtrwania reaktywności Sulfo-SANPAH w wodzie w temperaturze pokojowej jest krótki (~5 min); dlatego kroki te należy wykonywać szybko.
   4. Naświetlić powierzchnię żelu światłem UV w komorze do sieciowania UV (8 W, długość fali 254 nm w odległości 2-3 cali przez 1,5 min). Sulfo-SANPAH zmieni kolor z pomarańczowego na brązowy.
   5. Zanurzyć szkiełka podstawkowe poddane działaniu UV w zlewce ze świeżym ddH₂O i usunąć nadmiar wody z powierzchni żelu za pomocą wirówki do szkiełek podstawkowych (< 2 s).
   6. Nanieść pipetą ~50 μL zimnej fibronektyny (FN) o stężeniu 1 mg/ml (w PBS, pH 7,4) na Parafilm w naczyniu typu szalka Petriego. Odwrócić szkiełko podstawkowe i położyć je na kropli FN stroną z żelem do FN.
   7. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 1-2 godziny lub w temperaturze 4°C przez noc.
   8. W sterylnych warunkach, w komorze do hodowli komórkowej, umieścić szkiełka podstawkowe w naczyniach do hodowli tkankowej o średnicy 6 cm zawierających PBS (pH 7,4) w ilości wystarczającej do przykrycia szkiełka.
   9. Przemyć dokładnie, wykonując kilka (3-5) płukań w PBS (pH 7,4) w warunkach sterylnych.
   10. Zesterylizować szkiełka podstawkowe za pomocą lampy bakteriobójczej w komorze do hodowli tkankowej przez 30 min.
   11. Inkubować szkiełka podstawkowe w pożywce komórkowej przez 30-45 min przed wysiewem komórek.
2. Sieciowanie ECM z powierzchnią żelu PAA za pomocą hydrazyny hydratu Grupy węglowodanowe w białkach są utleniane i sprzęgane z żelem przy użyciu hydrazyny hydratu.
   1. Przygotować żele poliakrylamidowe zgodnie z opisem w sekcji 2.
   2. Umieścić szkiełka podstawkowe z żelem PAA w plastikowej szalce Petriego w dygestorium i, używając rękawiczek, nanieść pipetą około 1 ml nierozcieńczonej hydrazyny hydratu na powierzchnię każdego żelu PAA i inkubować przez co najmniej dwie godziny, ale nie dłużej niż 24 godziny.
   3. Dodać ddH₂O do szalki Petriego; usunąć roztwór hydrazyny hydratu i zutylizować go jako odpad niebezpieczny.
   4. Dodać do szalki Petriego 5% kwas octowy, aby zanurzyć szkiełko podstawkowe. Przykryć i inkubować przez jedną godzinę.
   5. Usunąć kwas octowy i przemyć ddH₂O. Inkubować w ddH₂O przez jedną godzinę. Szkiełka podstawkowe są teraz aktywowane i gotowe do sieciowania utlenionej fibronektyny (FN).
   6. Rozcieńczyć 10 μl roztworu FN (1 mg/ml) w 940 μl buforu octanu sodu 50 mM (pH 4,5) w ciemnej probówce do mikrowirówki, tak aby uzyskać stężenie końcowe 10 μg/ml.
   7. Przygotować roztwór stokowy 20X nadtlenianu sodu, dodając 80 mg nadtlenianu sodu do 1 ml buforu octanu sodu 50 mM (pH 4,5).
   8. Dodać 50 μl roztworu stokowego 20X nadtlenianu sodu do roztworu FN przygotowanego w kroku 3.2.6, tak aby końcowe stężenia robocze wynosiły 10 μg/ml FN i 4 μg/ml nadtlenianu sodu. Inkubować w ciemnej probówce w temperaturze pokojowej przez 30 minut.
   9. Usunąć nadmiar ddH₂O z aktywowanej powierzchni żelu przygotowanej w kroku 3.2.5 za pomocą wirówki do szkiełek podstawkowych (< 2 s). Unikać wysuszenia żelu.
   10. Nanieść pipetą ~500 μl roztworu FN na aktywowaną powierzchnię żelu i inkubować przez 1 h w temperaturze pokojowej.
   11. Umieścić szkiełka podstawkowe w naczyniach zawierających PBS (pH 7,4) w ilości wystarczającej do przykrycia szkiełka.
   12. Przemyć dokładnie, wykonując kilka (3-5) płukań w PBS (pH 7,4).
   13. Zesterylizować szkiełka podstawkowe za pomocą lampy bakteriobójczej w komorze do hodowli tkankowej przez 30 min.
   14. Inkubować szkiełka podstawkowe w pożywce komórkowej przez 30-45 min przed wysiewem komórek.
3. Koniugacja objętościowa białka ECM w żelu PAA za pomocą Acryloyl-X, estru succinimidylowego Protokół ten wykonuje się przed krokiem 2.5. Reaktywne grupy aminowe w białkach są sprzęgane z monomerem akryloamidu za pomocą chemii estru NHS, a następnie współpolimeryzowane w całej objętości żelu PAA.
   1. Skoniugować wybrany proteinę ECM z Acryloyl-X zgodnie z instrukcjami producenta. Roztwory stokowe skoniugowanego białka należy przechowywać w temperaturze 4°C.
   2. Obliczyć objętość roboczego roztworu PAA wymaganą do wytworzenia żelu (np. 10 μL na szkiełko podstawkowe).
   3. Odjąć 50 μL (np. 10% objętości) wody z ilości wymienionej w recepturze roztworu roboczego w Tabeli 1 i rozpocząć polimeryzację.
   4. Usunąć objętość obliczoną w kroku 3.3.2 i dodać roztwór ECM/Acryloyl-X w ilości stanowiącej 10% objętości (np. 1 μL ECM/Acryloyl-X do 9 μL roztworu PAA). Krok ten należy wykonać szybko, ponieważ żel polimeryzuje.
   5. Wykonać kroki 2.6 i 2.7 zgodnie z wcześniejszym opisem.
   6. Przemyć dokładnie, wykonując kilka (3-5) płukań w PBS (pH 7,4) w warunkach sterylnych.
   7. Zesterylizować szkiełka podstawkowe za pomocą lampy bakteriobójczej w komorze do hodowli tkankowej przez 30 min.
   8. Inkubować szkiełka podstawkowe w pożywce komórkowej przez 30-45 min przed wysiewem komórek.

4. Umieszczanie szkiełka podstawowego w komorze obrazowania konfokalnego

Kroki te wykonuje się po tym, jak komórki miały czas na rozprzestrzenienie się na podłożu żelowym powleczonym ECM (~6-12 godz.). W celu złożenia komory do obrazowania konfokalnego (RC-30WA) zaleca się skorzystanie z instrukcji dostępnych na stronie internetowej firmy Warner Instruments.

1. Podgrzej pożywkę komórkową oraz trypsynę o stężeniu 0,5% lub 0,25%, a następnie nabierz je do strzykawki o pojemności 5 ml lub 10 ml.
2. Zamocuj szkiełko nakrywkowe 22x30 mm w górnym uchwycie na szkiełko (Top Coverslip holder) komory do obrazowania konfokalnego Warner Instruments (RC-30WA), używając smaru próżniowego w celu unieruchomienia szkiełka.
3. Umieść gumową uszczelkę tworzącą komorę na wierzchu szkiełka nakrywkowego, zapewniając dostęp do polietylenowych rurek wlotowych i wylotowych. Pozwoli to na uzyskanie odstępu od 150 do 1000 μm pomiędzy górnym szkiełkiem nakrywowym a szkiełkiem 22x40 mm pokrytym żelem, w zależności od rozmiaru użytej uszczelki.
4. Podłącz strzykawki do rurki wlotowej za pomocą zestawu złączy i sprawdź, czy pożywka przepływa przez rurki na górne szkiełko nakrywkowe oraz czy w liniach przepływu nie ma pęcherzyków powietrza.
5. Nałóż smar próżniowy na podstawę komory i umieść w niej szkiełko 22x40 mm pokryte żelem, stroną z komórkami do góry. Nałóż na komórki podgrzaną pożywkę.
6. Umieść górny uchwyt na szkiełko na podstawie komory, tak aby uszczelka komory oddzielała go od szkiełka pokrytego żelem. Upewnij się, że piny pozycjonujące (Locating Pins) w podstawie komory znajdują się w otworach pozycjonujących (Locating Holes) w górnym szkiełku nakrywowym.
7. Nałóż płytę dociskową (Pressure Plate) na podstawę komory i za pomocą klucza do płyty dociskowej (Pressure Plate Wrench) przykręć i zabezpiecz płytę dociskową.
8. Sprawdź przepływ pożywki przez rurki i komorę, aby monitorować ewentualne wycieki wewnątrz komory oraz wyeliminować wszelkie strefy pozbawione pożywki na powierzchni komórek. Uwaga: użycie igły o małym rozmiarze do wytworzenia lekkiej próżni podczas infuzji pożywki może pomóc w wyeliminowaniu stref pozbawionych pożywki.
9. Zamocuj komorę do obrazowania konfokalnego do adaptera stolika (Stage Adapter) znajdującego się w uchwycie mikroskopu w celu przeprowadzenia obrazowania.
10. Wykonaj obrazowanie białka znakowanego fluorescencyjnie oraz kuleczek fluorescencyjnych osadzonych w podłożu żelowym przy użyciu fluorescencyjnego mikroskopu konfokalnego.
11. Aby uzyskać obraz pozycji kuleczek w stanie nieodkształconym wewnątrz żelu, przepłucz komorę trypsyną w celu odłączenia adhezji komórkowych od żelu, a następnie wykonaj obraz kuleczek fluorescencyjnych w tym samym polu widzenia, w którym przylegała komórka. Porównanie pozycji kuleczek odkształconych i nieodkształconych pozwala na ilościowe określenie przemieszczenia podłoża żelowego podczas kontrakcji.

Reprezentatywne wyniki:

Powyższy protokół opisuje procedurę eksperymentalną przygotowania podatnych żeli PAA do badania kurczliwości komórek, co zostało zilustrowane na Rysunku 1. Powierzchnia żelu otrzymana za pomocą tego protokołu jest stosunkowo płaska i gładka, z równomiernie rozmieszczonymi w całej objętości fluorescencyjnymi kuleczkami (Rysunek 2A).

Jeśli pomiar kurczenia się żelu odbywa się w miejscu adhezji ogniskowych, obrazowanie komórki (Rysunek 3A) i powierzchni żelu (Rysunek 3B) należy przeprowadzić w konfokalnej płaszczyźnie optycznej adhezji ogniskowych. Kurczenie się żelu można zwizualizować poprzez przesunięcie osadzonych fluorescencyjnych kuleczek (Rysunek 3B) na powierzchni żelu w stanie, gdy komórki są przyległe (napięte), w porównaniu do stanu, gdy są oderwane (rozluźnione). Zastosowanie algorytmów obliczeniowych pozwala na wyznaczenie naprężeń trakcyjnych związanych z przesunięciem kuleczek oraz odpowiadającego im modułu sprężystości żelu (Rysunek 3C i 3D) (Sabass et al., 2008). Jeśli obrazowanie odbywa się głębiej wewnątrz żelu, przesunięcia kuleczek będą mniejsze i nie będą reprezentatywne dla sił trakcyjnych wywieranych w miejscach adhezji ogniskowych.

Rycina 1. Schematyczna ilustracja układu eksperymentalnego. Ogólnym celem tej procedury jest stworzenie podatnych macierzy do badania kontrakcji komórkowej. Pierwszym krokiem procedury eksperymentalnej jest aktywacja szkiełek podstawowych poprzez traktowanie amino-silanem/glutaraldehydem w celu zakotwiczenia spolimeryzowanych żeli. Drugim krokiem jest polimeryzacja żelu poliakryloamidowego, zawierającego fluorescencyjne kuleczki, na aktywowanym szkiełku podstawowym. Trzeci krok obejmuje chemiczne sieciowanie ligandu zewnątrzkomórkowego z powierzchnią żelu poliakryloamidowego, przy użyciu jednej z trzech technik sprzęgania wymienionych w kroku 3. Następnie komórki są wysiewane na żel, gdzie mogą przylegać i rozprzestrzeniać się. Podczas aktywnej kontrakcji komórkowej kuleczki zatopione w żelu ulegają przesunięciu.

Rysunek 2. Przekrój optyczny konfokalny górnej powierzchni żelu PAA, zwizualizowany za pomocą (A.) fluorescencyjnych kuleczek o rozmiarze 40nm zatopionych w żelu oraz (B.) immunofluorescencji fibronektyny.

Rycina 3. Reprezentatywny wynik eksperymentu badania sił trakcyjnych. (A.) Adhezje ogniskowe w ludzkiej komórce osteosarkoma U2OS są oznakowane GFP-paksyliną oraz (B.) pozycje fluorescencyjnych kulek osadzonych w żelu PAA pod adhezjami ogniskowymi w stanie naprężonym (zielony) i nienaprężonym (czerwony). Strzałki wskazują przykłady przemieszczenia kulek. (C.) Wektory naprężeń trakcyjnych i (D.) odpowiadająca im mapa w skali cieplnej naprężeń trakcyjnych wyznaczona na podstawie kurczenia się żelu przy użyciu algorytmów obliczeniowych (Sabass et al., 2008). Pasek skali = 5 μm.

Tabela 1:

Przykładowe roztwory zapasowe i robocze PAA (dane w tabeli 1 zostały pierwotnie uzyskane od Yeunga i wsp. i niezależnie potwierdzone w naszym laboratorium.)

Roztwór stokowy PAA
Moduł ścinania żelu PAA (Pa)	230	2833	8640	16344
40% akrylamid (ml)	1.25	3.12	2.34	2.50
2% bis-akrylamid (ml)	0.50	0.83	1.88	0.60
Woda (ml)	3.25	1.04	0.78	1. 90
Objętość całkowita (ml):	5	5	5	5

Roztwór roboczy PAA
Użyty roztwór stokowy (Pa)	230	2833	8640	16344
Objętość roztworu stokowego (μL)	150	150	200	300
Woda (μL)	341.75	341.75	291.75	191.75
Kuleczki (μL)	5	5	5	5
TEMED (μL)	0.75	0.75	0.75	0.75
10% APS (μL)	2.5	2.5	2.5	2.5
Objętość całkowita (μL):	500	500	500	500
Końcowe % akryloamidu	3	7.5	7.5	12
Końcowe % bis-akryloamidu	0.06	0.1	0.3	0.15

Tabela 2:

Moduł ścinania podłoży PAA o różnych końcowych stężeniach akryloamidu i bis-akryloamidu

12% akryloamidu			7,5% akryloamidu
% bis-akryloamidu	Moduł ścinania (Pa)		% bis-akryloamidu	Moduł ścinania (Pa)
0.145	16344		0.01	689
0.28	30067		0.03	1535
0.45	34263		0.05	2286
0.55	42375		0.075	2833
0.575	50873		0.1	4069
0.6	55293		0.2	5356
			0.3	8640
5% akrylamid			3% akrylamid
% bis-akryloamidu	Moduł ścinania (Pa)		% bis-akryloamidu	Moduł ścinania (Pa)
0.05	430		0.02	1.3
0.075	600		0.04	54
0.1	1431

Dyskusja

Opisana tutaj procedura przygotowania eksperymentu mikroskopii sił trakcyjnych (TFM), wraz z implementacją obliczeniowych rutyn śledzenia (Sabass et al., 2008), umożliwia kwantyfikację sił komórkowych z rozdzielczością przestrzenną w skali mikronowej. Aby zoptymalizować protokół eksperymentalny, kluczowe jest utworzenie czystego i jednorodnego podłoża żelowego z równomierną powłoką ligandu ECM. Poniżej omawiamy potencjalne problemy:

Nierównomierna powierzchnia żelu lub rozdarcia:

...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
3-aminopropyltrimetoksysilan	Aldrich	28, 177-8
40% akrylamid	Bio-Rad	161-0140
2% bisakryloamidu	Fisher Scientific	BP1404
TEMED	Fisher Scientific	BP 150-20
Wodoronadtiosiarczan amonu	Fisher Scientific	BP179
fluorescencyjne mikrosfery 40 nm	Invitrogen	F8789
Sulfo-SANPAH	Pierce, Thermo Scientific	22589
Komora do obrazowania konfokalnego (RC-30)	Warner Instruments	64-0320
Wirówka do szkiełek nakrywkowych	Własnej roboty	ND
Lampa ultrafioletowa CL1000	UVP Inc.	95-0228-01
Stojak ze stali nierdzewnej	Nauki o mikroskopii elektronowej	72239-04
acryloyl-X, SE (kwas 6-((akryloilo)amino)heksanowy)	Invitrogen	A-20770
Hydrazyna hydrat	Sigma-Aldrich	225819
Metajodynian sodu	Thermo Fisher Scientific, Inc.	20504
Izopropanol	Fisher Scientific	A416-4
Fibonektyna	Sigma-Aldrich	F2006
Kolagen	BD Biosciences	354236
Kryszalki (#1,5)	Corning	2940‐224
Glutaraldehyd	Nauki o mikroskopii elektronowej	16120
Rain-X	Produkty SOPUS	www.rainx.com
Kwas octowy	Acros Organics	64-19-7