Przygotowanie podatnych macierzy do ilościowego pomiaru skurczu komórkowego

Podsumowanie

W tym filmie prezentujemy techniki eksperymentalne wykorzystywane do wytwarzania elastycznych podłoży powleczonych macierzą zewnątrzkomórkową (ECM), które nadają się do hodowli komórkowej oraz pozwalają na zastosowanie mikroskopii sił trakcyjnych i obserwację wpływu sztywności ECM na zachowanie komórek.

Streszczenie

Regulacja adhezji komórkowej do macierzy pozakomórkowej (ECM) jest niezbędna dla migracji komórek i przebudowy ECM. Adhezje ogniskowe to makromolekularne kompleksy, które łączą kurczliwy cytoszkielet z F-aktyny z ECM. Połączenie to umożliwia przekazywanie wewnątrzkomórkowych sił mechanicznych przez błonę komórkową do znajdującego się pod nią podłoża. Niedawne badania wykazały, że właściwości mechaniczne ECM regulują morfologię adhezji ogniskowych i F-aktyny, a także liczne procesy fizjologiczne, w tym różnicowanie, podział, proliferację i migrację komórek. W związku z tym stosowanie podłoży do hodowli komórkowej stało się coraz bardziej rozpowszechnioną metodą precyzyjnego kontrolowania i modulowania właściwości mechanicznych ECM.

Aby ilościowo określić siły trakcyjne w adhezjach ogniskowych w komórce przylegałej, stosuje się podatne podłoża w połączeniu z obrazowaniem o wysokiej rozdzielczości oraz technikami obliczeniowymi w metodzie zwanej mikroskopią sił trakcyjnych (TFM). Technika ta opiera się na pomiarach lokalnej wartości i kierunku deformacji podłoża wywołanych skurczem komórkowym. W połączeniu z wysokorozdzielczą mikroskopią fluorescencyjną białek znakowanych fluorescencyjnie, możliwe jest skorelowanie organizacji i przebudowy cytoszkieletu z siłami trakcyjnymi.

W niniejszej pracy przedstawiamy szczegółowy protokół eksperymentalny przygotowania dwuwymiarowych, podatnych macierzy w celu stworzenia podłoża do hodowli komórkowej o dobrze scharakteryzowanej, regulowanej sztywności mechanicznej, odpowiedniego do pomiaru skurczu komórkowego. Protokoły te obejmują wytwarzanie hydrożeli poliakryloamidowych, powlekanie takich żeli białkami ECM, wysiew komórek na żele oraz wysokorozdzielczą mikroskopię konfokalną z wykorzystaniem komory perfuzyjnej. Dodatkowo przedstawiamy reprezentatywną próbkę danych obrazujących lokalizację i wielkość sił komórkowych przy użyciu cytowanych protokołów TFM.

Protokół

1. Aktywacja powierzchni szkiełka nakrywki

1. Kryszki (#1.5, 22x40 mm) są czyszczone poprzez serię myć detergentem i etanolem zgodnie z wcześniej opisanym protokołem (Waterman-Storer, 1998) w celu ich oczyszczenia i usunięcia kurzu.
2. Umieść kryszki w stojaku ze stali nierdzewnej w taki sposób, aby były od siebie oddalone i nie stykały się.
3. W dygestorium (zaleca się stosowanie rękawiczek nitrylowych i gogli) rozcieńcz pełny roztwór 3-aminopropyltrimetoksysilanu w izopropanolu do końcowego stężenia 2% (2ml silanu / 100 ml izopropanolu), aby wypełnić kwadratowe szklane naczynie (objętość ~350ml). Ze względu na reaktywność z tworzywami sztucznymi, użyj szklanej pipety Pasteura do dodania 3-aminopropyltrimetoksysilanu do izopropanolu.
4. Całkowicie zanurz kryszki z kroku 1.2 w tym roztworze na 10 min, delikatnie mieszając na mieszadle magnetycznym w dygestorium.
5. Przemyj kryszki, zanurzając je w ddH₂O (4 wymiany wody). Pozostaw na 10 min podczas ostatniej wymiany, przy jednoczesnym mieszaniu. Roztwory zawierające aminosilan należy utylizować jako odpady niebezpieczne.
6. Susz kryszki w inkubatorze w podwyższonej temperaturze (~37°C) przez 10 minut w środowisku wolnym od kurzu.
7. Ostudź do temperatury pokojowej.
8. W dygestorium zanurz kryszki w 1% roztworze glutaraldehydu w ddH₂O w kwadratowym szklanym naczyniu na mieszadle magnetycznym przez 30 minut.
9. Przemyj poprzez 3 wymiany ddH₂O przez 10 minut na każdą wymianę, przy jednoczesnym mieszaniu. Glutaraldehyd należy utylizować jako odpad niebezpieczny.
10. Susz w temperaturze pokojowej, przykrywając folią aluminiową, aby zapobiec osiadaniu kurzu na kryszkach.
11. Przechowuj w suchym miejscu, z dala od kurzu, przez okres do 2 miesięcy.

2. Przygotowanie żelu poliakrylamidowego (PAA)

1. Przygotuj roztwory zapasowe mieszaniny akrylamidu/bis-akrylamidu z 40% akrylamidu i 2% bis-akrylamidu, zgodnie z Tabelą 1. Przechowujemy kilka roztworów zapasowych zoptymalizowanych dla żeli PAA o różnej sztywności; przykłady wymieniono w Tabelach 1 i 2. Roztwory zapasowe mogą być przechowywane przez kilka lat, pod warunkiem utrzymywania ich w ciemnej butelce w temperaturze 4 C.
2. Roztwory robocze zawierające końcowe pożądane stężenia akrylamidu/bis-akrylamidu otrzymuje się z roztworów zapasowych. Na przykład przygotowujemy roztwór roboczy 7,5% akrylamidu/0,10% bis-akrylamidu w ddH₂O do wytwarzania żeli PAA o sztywności 2,8kPa.
3. Odgazuj roztwór akrylamidu w komorze próżniowej przez 20 min, aby zredukować zawartość tlenu w roztworze, który zapobiega polimeryzacji PAA.
4. Przygotuj 10% roztwór persiarczanu amonu (APS) (0,5g/5mL). Zużyj świeżego zapasu roboczego w ciągu 3 dni. Alternatywnie zapasy można zamrozić, aby wykorzystać je w późniejszym terminie.
5. Podczas odgazowywania akrylamidu energicznie przetrzyj szkiełko mikroskopowe o wymiarach 1x3" chusteczkami Rain-X, aby uczynić powierzchnię szkiełka hydrofobową. Aby usunąć nadmiar Rain-X, przetrzyj szkiełko wilgotną chusteczką Kimwipe. Odstaw szkiełko, przykrywając je.
6. Wyjmij roztwór akrylamidu z komory próżniowej i dodaj kulki fluorescencyjne (1% objętościowo, 5 μl dla roztworu roboczego wymienionego w Tabeli 1). Dodaj 0,75μl TEMED i 2,5 μl 10% APS, co zainicjuje polimeryzację żelu. Wymieszaj dokładnie poprzez pipetowanie przez ~5 s, aby zminimalizować wprowadzanie pęcherzyków powietrza.
7. Nanieś 10-12 μl roztworu akrylamidu na hydrofobowe szkiełko mikroskopowe (przygotowane w kroku 2.4) i umieść aktywowane szkiełko nakrywką o wymiarach 22x40mm na wierzchu kropli. Roztwór żelu powinien pokryć całą powierzchnię szkiełka nakrywki. Wygładź wszelkie pęcherzyki, które mogą pojawić się w roztworze. Pozostaw roztwór żelu do polimeryzacji w temperaturze pokojowej przez ~10 min.
8. Zakończenie polimeryzacji można ocenić, odwracając pozostały roztwór roboczy w probówce do mikrowirówki. Ponadto spolimeryzowany żel może odklejać się od krawędzi szkiełka nakrywki. Natychmiast po zaobserwowaniu makroskopowej polimeryzacji oddziel szkiełko nakrywkę od szkiełka przedmiotowego. Używając cienkiego czubka pęsety lub krawędzi żyletki, ostrożnie zdejmij szkiełko nakrywkowe wraz z przytwierdzonym żelem z powierzchni szkiełka mikroskopowego i zanurz żel w ddH₂O, aby utrzymać nawodnienie.

3. Sprzęganie białek macierzy pozakomórkowej (ECM) z żelem PAA

Do przyłączania białek ECM można zastosować trzy różne metody: albo do górnej powierzchni żelu PAA (3.1 i 3.2), albo poprzez włączenie białka ECM do objętości żelu (3.3). W tym rozdziale omawiamy sprzęganie fibronektyny z żelami PAA w celu uzyskania gęstości ligandów na powierzchni równoważnej ilości zaadsorbowanej na szkle po inkubacji z roztworem fibronektyny o stężeniu 10 μg/mL przez 1 godzinę. Rozważania dotyczące wyboru metody szczegółowo opisano w dyskusji.

1. Sieciowanie białka ECM z powierzchnią żelu PAA za pomocą Sulfo-SANPAH Reaktywne grupy aminowe w białkach są kowalencyjnie przyłączane do powierzchni żelu PAA za pomocą heterobifunkcyjnego czynnika sieciującego Sulfo-SANPAH
   1. Przygotować 40 μl robocze alikwoty Sulfo-SANPAH, rozpuszczając proszek Sulfo-SANPAH w bezwodnym dimetylosulfotlenku (DMSO) (20 μl na mg Sulfo-SANPAH). Zapaszki zamrozić gwałtownie w ciekłym azocie i przechowywać w temperaturze -80°C do późniejszego użycia.
   2. Usunąć ddH₂O z powierzchni żelu za pomocą wirówki do szkiełek nakrywkowych (< 2s). Unikać wysuszenia żelu.
   3. Rozcieńczyć alikwoty Sulfo-SANPAH-DMSO w ddH₂O (2mg/ml, pH 7) bezpośrednio przed użyciem i pokryć powierzchnię żelu (~200 μl). Należy pamiętać, że okres połowicznego rozpadu reaktywności Sulfo-SANPAH w wodzie w temperaturze pokojowej jest krótki (~5 min); dlatego kroki te należy wykonywać szybko.
   4. Naświetlić powierzchnię żelu światłem UV w piecu do sieciowania UV (8W, długość fali 254 nm w odległości 2-3 cali przez 1,5 min). Kolor Sulfo-SANPAH zmieni się z pomarańczowego na brązowy.
   5. Zanurzyć poddane działaniu UV szkiełka nakrywkowe w zlewce ze świeżym ddH₂O i usunąć nadmiar wody z powierzchni żelu za pomocą wirówki do szkiełek nakrywkowych (< 2s).
   6. Nanieść pipetą ~50 μL zimnej fibonektyny (FN) o stężeniu 1mg/ml (w PBS, pH 7,4) na Parafilm w naczyniu typu szalka Petriego. Odwrócić szkiełko nakrywkowe na kropli FN, tak aby strona z żelem stykała się z FN.
   7. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 1-2 godziny lub w temperaturze 4°C przez noc.
   8. W sterylnych warunkach w dygestorium do hodowli komórkowych umieścić szkiełka nakrywkowe w 6 cm naczyniach do hodowli tkankowej zawierających PBS (pH 7,4) w ilości wystarczającej do przykrycia szkiełka.
   9. Przepłukać dokładnie, wykonując kilka (3-5) płukań w PBS (pH 7,4), w sterylnych warunkach.
   10. Zesterylizować szkiełka nakrywkowe za pomocą lampy bakteriobójczej w dygestorium do hodowli komórkowej przez 30 min.
   11. Inkubować szkiełka nakrywkowe w pożywce komórkowej przez 30-45 min przed wysianiem komórek.
2. Sieciowanie ECM z powierzchnią żelu PAA za pomocą nawodnyzyny Grupy węglowodanowe w białkach są utleniane i sprzęgane z żelem przy użyciu nawodnyzyny.
   1. Przygotować żele poliakrylamidowe zgodnie z opisem w sekcji 2.
   2. Umieścić szkiełka nakrywkowe z żelem PAA w plastikowej szalce Petriego w dygestorium i w rękawiczkach nanieść pipetą około 1 ml nierozcieńczonej nawodnyzyny na powierzchnię każdego żelu PAA i inkubować przez co najmniej dwie godziny, ale nie dłużej niż 24 godziny
   3. Dodać ddH₂O do szalki Petriego; usunąć roztwór nawodnyzyny i zutylizować jako odpad niebezpieczny.
   4. Dodać do szalki Petriego 5% kwas octowy, aby zanurzyć szkiełko nakrywkowe. Przykryć i inkubować przez jedną godzinę.
   5. Usunąć kwas octowy i wypłukać ddH₂O. Inkubować w ddH₂O przez jedną godzinę. Szkiełka nakrywkowe są teraz aktywowane i gotowe do sieciowania utlenionej fibonektyny (FN).
   6. Rozcieńczyć 10 μl roztworu FN o stężeniu 1 mg/ml w 940 μl buforu octanu sodu 50 mM (pH 4,5) w ciemnej probówce do mikrocentryfugi, aby uzyskać stężenie końcowe 10 μg/ml.
   7. Przygotować roztwór zapasowy 20X nadjodynianu sodu, dodając 80 mg nadjodynianu sodu do 1 ml buforu octanu sodu 50 mM (pH 4,5).
   8. Dodać 50 μl zapasu 20X nadjodynianu sodu do roztworu FN przygotowanego w punkcie 3.2.6, tak aby końcowe stężenia robocze wynosiły 10 μg/ml FN i 4 μg/ml nadjodynianu sodu. Inkubować w ciemnej probówce w temperaturze pokojowej przez 30 minut.
   9. Usunąć nadmiar ddH₂O z aktywowanej powierzchni żelu przygotowanej w punkcie 3.2.5 za pomocą wirówki do szkiełek nakrywkowych (< 2 s). Unikać wysuszenia żelu.
   10. Nanieść pipetą ~500 μl roztworu FN na aktywowaną powierzchnię żelu i inkubować przez 1 h w temperaturze pokojowej.
   11. Umieścić szkiełka nakrywkowe w naczyniach zawierających PBS (pH 7,4) w ilości wystarczającej do przykrycia szkiełka.
   12. Przepłukać dokładnie, wykonując kilka (3-5) płukań w PBS (pH 7,4).
   13. Zesterylizować szkiełka nakrywkowe za pomocą lampy bakteriobójczej w dygestorium do hodowli komórkowej przez 30 min.
   14. Inkubować szkiełka nakrywkowe w pożywce komórkowej przez 30-45 min przed wysianiem komórek.
3. Koniugacja objętościowa białka ECM w żelu PAA za pomocą Akryloyl-X, estru sukcynimidowego Protokół ten jest wykonywany przed krokiem 2.5. Reaktywne grupy aminowe w białkach są sprzęgane z monomerem akrylamidowym za pomocą chemii estru NHS, a następnie współpolimeryzowane w całej objętości żelu PAA.
   1. Skoniugować wybrany białko ECM z Akryloyl-X zgodnie z instrukcjami producenta. Roztwory zapasowe skoniugowanego białka należy przechowywać w temperaturze 4°C.
   2. Obliczyć objętość roboczego roztworu PAA wymaganą do wytworzenia żelu (np. 10 uL na szkiełko nakrywkowe).
   3. Odjąć 50 μL (np. 10% objętości) wody z ilości wymienionej w przepisie na roztwór roboczy w Tabeli 1 i rozpocząć polimeryzację.
   4. Usunąć objętość obliczoną w punkcie 3.3.2 i dodać roztwór ECM/Akryloyl-X do 10% objętości (np. 1 μL ECM/Akryloyl-X do 9 μL roztworu PAA). Krok ten należy wykonać szybko, ponieważ żel polimeryzuje.
   5. Dokończyć kroki 2.6 i 2.7 zgodnie z wcześniejszym opisem.
   6. Przepłukać dokładnie, wykonując kilka (3-5) płukań w PBS (pH 7,4), w sterylnych warunkach.
   7. Zesterylizować szkiełka nakrywkowe za pomocą lampy bakteriobójczej w dygestorium do hodowli komórkowej przez 30 min.
   8. Inkubować szkiełka nakrywkowe w pożywce komórkowej przez 30-45 min przed wysianiem komórek.

4. Umieszczanie szkiełka nakrywki w komorze obrazowania konfokalnego

Kroki te wykonuje się po tym, jak komórki rozprzestrzenią się na podłożu żelowym pokrytym ECM (~6-12 godz.). W celu zmontowania komory do obrazowania konfokalnego (RC-30WA) zaleca się skorzystanie z instrukcji dostępnych na stronie internetowej firmy Warner Instruments.

1. Podgrzej pożywkę komórkową oraz trypsynę w stężeniu 0,5% lub 0,25%, a następnie pobierz je do strzykawki o pojemności 5 ml lub 10 ml.
2. Umieść szkiełko nakrywkowe 22x30 mm w uchwycie górnej nakrywki (Top Coverslip holder) komory do obrazowania konfokalnego Warner Instruments (RC-30WA), używając smaru próżniowego w celu utrwalenia szkiełka.
3. Na wierzchu szkiełka nakrywkowego umieść gumową uszczelkę tworzącą komorę, zapewniając dostęp do polietylenowych rurek wlotowej i wylotowej. Pozwoli to na uzyskanie odstępu od 150-1000 μm między górnym szkiełkiem a szkiełkiem nakrywkowym 22x40 mm pokrytym żelem, w zależności od rozmiaru zastosowanej uszczelki.
4. Podłącz strzykawki do rurki wlotowej za pomocą zestawu łączników i sprawdź, czy pożywka przepływa przez rurki na górne szkiełko nakrywkowe oraz czy w liniach przepływu nie ma pęcherzyków powietrza.
5. Nałóż smar próżniowy na podstawę komory i umieść szkiełko nakrywkowe 22x40 mm pokryte żelem, stroną z komórkami do góry. Na komórki nanieś podgrzaną pożywkę.
6. Umieść uchwyt górnej nakrywki na podstawie komory tak, aby uszczelka komory (Chamber Gasket) oddzielała go od szkiełka pokrytego żelem. Upewnij się, że kołki ustalające (Locating Pins) w podstawie komory znajdują się w otworach ustalających (Locating Holes) w górnym szkiełku nakrywkowym.
7. Nałóż płytę dociskową (Pressure Plate) na podstawę komory i za pomocą klucza do płyty dociskowej (Pressure Plate Wrench) przykręć i zabezpiecz płytę.
8. Sprawdź przepływ pożywki przez rurki i komorę, aby monitorować ewentualne nieszczelności wewnątrz komory oraz wyeliminować wszelkie strefy pozbawione pożywki na powierzchni komórek. Uwaga: użycie igły o małym rozmiarze do wytworzenia lekkiej próżni podczas infuzji pożywki może pomóc w wyeliminowaniu stref pozbawionych pożywki.
9. Zamocuj komorę do obrazowania konfokalnego do adaptera stolika (Stage Adapter) znajdującego się w uchwycie mikroskopu w celu przeprowadzenia obrazowania.
10. Wykonaj obrazowanie białka znakowanego fluorescencyjnie oraz kulek fluorescencyjnych zatopionych w podłożu żelowym przy użyciu konfokalnego mikroskopu fluorescencyjnego.
11. Aby uzyskać obraz nieodkształconych pozycji kulek w żelu, przepłucz komorę trypsyną w celu odłączenia adhezji komórkowych od żelu, a następnie wykonaj obraz kulek fluorescencyjnych w tym samym polu widzenia, w którym przylegała komórka. Porównanie odkształconych i nieodkształconych pozycji kulek pozwala na kwantyfikację przemieszczenia podłoża żelowego podczas kontrakcji.

Reprezentatywne wyniki:

Powyższy protokół opisuje procedurę eksperymentalną przygotowania podatnych żeli PAA do badania kurczliwości komórek, która została zilustrowana na Rysunku 1. Powierzchnia żelu uzyskana za pomocą tego protokołu jest stosunkowo płaska i gładka, z równomiernie rozmieszczonymi w całej objętości fluorescencyjnymi kuleczkami (Rysunek 2A).

Jeśli pomiar skurczu żelu odbywa się w miejscu przylegania ogniskowego, obrazowanie komórki (Rysunek 3A) oraz powierzchni żelu (Rysunek 3B) należy przeprowadzić w konfokalnej płaszczyźnie optycznej przylegania ogniskowego. Skurcz żelu można zwizualizować poprzez przemieszczenie zatopionych fluorescencyjnych kulek (Rysunek 3B) na powierzchni żelu w stanie, gdy komórki są przyległe (napięte), w porównaniu do stanu, gdy są odczepione (rozluźnione). Zastosowanie algorytmów komputerowych pozwala wyznaczyć naprężenia trakcyjne związane z przemieszczeniem kulek oraz odpowiadający im moduł sprężystości żelu (Rysunek 3C i 3D) (Sabass et al., 2008). Jeśli obrazowanie odbywa się głębiej w żelu, przemieszczenia kulek będą mniejsze i nie będą reprezentować sił trakcyjnych wywieranych w punktach przylegania ogniskowego.

Rycina 1. Schematyczny rysunek układu eksperymentalnego. Ogólnym celem tej procedury jest stworzenie podatnych macierzy do badania skurczu komórkowego. Pierwszym krokiem procedury eksperymentalnej jest aktywacja szkiełek podstawkowych poprzez traktowanie amino-silanem/glutaraldehydem w celu zakotwiczenia spolimeryzowanych żeli. Drugim krokiem jest polimeryzacja żelu poliakryloamidowego, zawierającego fluorescencyjne kuleczki, na aktywowanym szkiełku podstawkowym. Trzeci krok obejmuje chemiczne sieciowanie liganda zewnątrzkomórkowego z powierzchnią żelu poliakryloamidowego przy użyciu jednej z trzech technik sprzęgania wymienionych w kroku 3. Następnie komórki są wysiewane na żel, gdzie mogą się przytwierdzić i rozprzestrzenić. W wyniku aktywnego skurczu komórkowego kuleczki zatopione w żelu ulegają przemieszczeniu.

Rysunek 2. Przekrój optyczny konfokalny górnej powierzchni żelu PAA, z obrazowaniem (A.) fluorescencyjnych kulek o rozmiarze 40nm zatopionych w żelu oraz (B.) immunofluorescencji fibronektyny.

Rysunek 3. Reprezentatywny wynik eksperymentu pomiaru sił trakcyjnych. (A.) Adhezje ogniskowe w ludzkiej komórce osteosarcoma U2OS są znakowane GFP-paksylliną oraz (B.) pozycje fluorescencyjnych kuleczek osadzonych w żelu PAA pod adhezjami ogniskowymi w stanie naprężonym (zielony) i nienaprężonym (czerwony). Strzałki wskazują przykłady przesunięcia kuleczek. (C.) Wektory naprężeń trakcyjnych oraz (D.) odpowiadająca im mapa skali ciepła naprężeń trakcyjnych wyznaczona na podstawie skurczu żelu przy użyciu algorytmów obliczeniowych (Sabass et al., 2008). Pasek skali = 5 μm.

Tabela 1:

Przykłady roztworów zapasowych i roboczych PAA (Dane w tabeli 1 zostały pierwotnie uzyskane od Yeung et. al. i niezależnie potwierdzone w naszym laboratorium.)

Roztwór zapasowy PAA
Moduł ścinania żelu PAA (Pa)	230	2833	8640	16344
40% akrylamidu (mL)	1.25	3.12	2.34	2.50
2% bis-akrylamidu (mL)	0.50	0.83	1.88	0.60
Woda (mL)	3.25	1.04	0.78	1. 90
Objętość całkowita (mL):	5	5	5	5

Roboczy roztwór PAA
Użyty roztwór zapasowy (Pa)	230	2833	8640	16344
Objętość roztworu zapasowego (μL)	150	150	200	300
Woda (μL)	341.75	341.75	291.75	191.75
Kuleczki (μL)	5	5	5	5
TEMED (μL)	0.75	0.75	0.75	0.75
10% APS (μL)	2.5	2.5	2.5	2.5
Objętość całkowita (μL):	500	500	500	500
Końcowe % akrylamidu	3	7.5	7.5	12
Końcowe % bis-akrylamidu	0.06	0.1	0.3	0.15

Tabela 2:

Moduł ścinania podłoży PAA o różnych końcowych stężeniach akrylamidu i bis-akrylamidu

12% akryloamidu			7,5% akryloamidu
% bis-akryloamidu	Moduł ścinania (Pa)		% bis-akryloamidu	Moduł ścinania (Pa)
0.145	16344		0.01	689
0.28	30067		0.03	1535
0.45	34263		0.05	2286
0.55	42375		0.075	2833
0.575	50873		0.1	4069
0.6	55293		0.2	5356
			0.3	8640
5% akryloamidu			3% akryloamidu
% bis-akryloamidu	Moduł ścinania (Pa)		% bis-akryloamidu	Moduł ścinania (Pa)
0.05	430		0.02	1.3
0.075	600		0.04	54
0.1	1431

Dyskusja

Opisana tutaj procedura przygotowania eksperymentu mikroskopii sił trakcyjnych (TFM), wraz z implementacją obliczeniowych rutyn śledzenia (Sabass et al., 2008), umożliwia kwantyfikację sił komórkowych z rozdzielczością przestrzenną w skali mikronowej. Aby zoptymalizować protokół eksperymentalny, kluczowe jest utworzenie czystego i jednorodnego podłoża żelowego z równomierną powłoką ligandu ECM. Poniżej omawiamy potencjalne problemy:

Nierównomierna powierzchnia żelu lub rozdarcia:

...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
3-aminopropyltrimetoksysilan	Aldrich	28, 177-8
40% akrylamid	Bio-Rad	161-0140
2% bisakryloamidu	Fisher Scientific	BP1404
TEMED	Fisher Scientific	BP 150-20
Wodoronadtiosiarczan amonu	Fisher Scientific	BP179
fluorescencyjne mikrosfery 40 nm	Invitrogen	F8789
Sulfo-SANPAH	Pierce, Thermo Scientific	22589
Komora do obrazowania konfokalnego (RC-30)	Warner Instruments	64-0320
Wirówka do szkiełek nakrywkowych	Własnej roboty	ND
Lampa ultrafioletowa CL1000	UVP Inc.	95-0228-01
Stojak ze stali nierdzewnej	Nauki o mikroskopii elektronowej	72239-04
acryloyl-X, SE (kwas 6-((akryloilo)amino)heksanowy)	Invitrogen	A-20770
Hydrazyna hydrat	Sigma-Aldrich	225819
Metajodynian sodu	Thermo Fisher Scientific, Inc.	20504
Izopropanol	Fisher Scientific	A416-4
Fibonektyna	Sigma-Aldrich	F2006
Kolagen	BD Biosciences	354236
Kryszalki (#1,5)	Corning	2940‐224
Glutaraldehyd	Nauki o mikroskopii elektronowej	16120
Rain-X	Produkty SOPUS	www.rainx.com
Kwas octowy	Acros Organics	64-19-7