Opisano wydajny system analizy struktury i funkcji genu w kulturze ex vivo limfocytów B śledziony. Metoda ta wykorzystuje produkcję rekombinowanych retrowirusów w wolnej od komórek pomocniczych (helper-free), ekotropowej linii komórkowej pakującej. Osiągnięto stabilną, dziedziczną ekspresję badanego genu w pierwotnych limfocytach, co prowadzi do generowania przeciwciał powierzchniowych na komórkach B przechodzących rekombinację zmiany klasy.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Produkcja rekombinowanych retrowirusów i infekcja limfocytów B
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Transgeniczna ekspresja genów w komórkach eukariotycznych to potężne podejście genetyki odwrotnej, w którym geny zainteresowania są eksprimowane pod kontrolą heterologicznego systemu ekspresji, aby ułatwić analizę wynikowego fenotypu. Metodę tę można wykorzystać do ekspresji genu, który normalnie nie występuje w danym organizmie, do ekspresji zmutowanej formy produktu genu lub do nadekspresji formy dominująco-negatywnej produktu genu. Jest ona szczególnie przydatna w badaniach układu krwiotwórczego, w którym regulacja transkrypcyjna stanowi główny mechanizm kontrolny w rozwoju i różnicowaniu limfocytów B 1, co zostało omówione w 2-4.
Genetyka myszy stanowi potężne narzędzie w badaniach nad ludzkimi genami i chorobami. Analiza porównawcza genomu myszy i człowieka wykazuje zachowanie syntenii w ponad 90% genomu 5. Ponadto wiele technologii stosowanych w modelach mysich znajduje zastosowanie w badaniu genów ludzkich, na przykład w przypadku delecji genów i wymiany allelicznej 6. Jednak stworzenie myszy transgenicznej wymaga znacznych zasobów, zarówno finansowych, jak i technicznych. Kilka projektów rozpoczęło gromadzenie bibliotek szczepów myszy typu knockout (KOMP, EUCOMM, NorCOMM) lub szczepów indukowanych mutagenezą (RIKEN), co wymaga wysiłków na szeroką skalę i współpracy 7. Dlatego też wskazane jest, aby przed przejściem do modelu mysiego najpierw zbadać fenotyp pożądanego genu w modelu hodowli komórkowej z komórek pierwotnych.
Retrowirusowe DNA integruje się z DNA gospodarza, najlepiej w obrębie lub w pobliżu jednostek transkrypcyjnych lub wysp CpG, co prowadzi do stabilnej i dziedzicznej ekspresji zapakowanego genu docelowego przy jednoczesnym uniknięciu wyciszenia transkrypcyjnego 8 9. Geny są następnie transkrybowane pod kontrolą wysokowydajnego promotora retrowirusowego, co skutkuje wysoką wydajnością transkrypcji i produkcji białek. W związku z tym ekspresja retrowirusowa może być stosowana w przypadku komórek trudnych do transfekcji, pod warunkiem, że komórki te znajdują się w aktywnym stanie podczas mitozy. Ponieważ geny strukturalne wirusa znajdują się w linii komórkowej do pakowania, wektory ekspresyjne używane do klonowania genu docelowego nie zawierają genów strukturalnych wirusa, co eliminuje możliwość powstania rewersantów wirusowych i zwiększa bezpieczeństwo pracy z nadsączkami wirusowymi, gdyż nie powstają w nich zakaźne wiriony 10.
W niniejszej pracy przedstawiamy protokół produkcji rekombinowanych retrowirusów i następczego zakażania limfocytów B śledziony. Po izolacji hodowlane komórki śledziony są stymulowane limfokinami pochodzącymi z komórek Th oraz przeciwciałem anty-CD40, co indukuje gwałtowną proliferację i różnicowanie limfocytów B 11. Protokół ten jest idealny do badania zdarzeń występujących w późnych etapach rozwoju i różnicowania limfocytów B, ponieważ komórki te są izolowane ze śledziony po początkowych procesach hematopoetycznych, ale przed stymulacją antygenową indukującą różnicowanie plazmacytowe.
Protokół
1. Izolacja i stymulacja B-limfocytów śledziony
- Pobrać śledziony od myszy z niedoborem AID 12 w wieku od 2 do 3 miesięcy. Izolację śledziony należy przeprowadzić w warunkach sterylnych, a organy tymczasowo przechowywać w zimnym roztworze soli fosforanowej (PBS) zawierającym 15% płodowej surowicy bydlęcej (FBS).
- Śledzionę należy następnie przenieść do sterylnej komory z laminarnym przepływem powietrza i zhomogenizować w 5 mL PBS uzupełnionego o 2,5% FBS. Homogenizat przelać do probówki Falcon 15 mL.
- Próbkę zhomogenizowanej tkanki śledziony wirować przy 100rpm przez 10 minut w temperaturze 4°C w celu osadzenia komórek.
- Odlać supernatant po wirowaniu. Osad komórkowy resuspender w 10 mL buforze do lizy erytrocytów (RBC) w temperaturze pokojowej przez 7 minut, aby uniknąć zanieczyszczenia krwinkami czerwonymi.
- Wirować próbkę przy 10 rpm przez 10 minut, odlać supernatant i resuspender komórki w 10 mL PBS zawierającego 2,5% FBS.
- Pobrać 10 μL alikwot i policzyć komórki przy rozcieńczeniu 1:100 za pomocą standardowego komory contamosyjowej, stosując błękit trypanu w celu wykluczenia komórek martwych. Z jednej śledziony można uzyskać około 20-30 milionów komórek.
- Wirować próbkę przy 10rpm przez 10 minut i odlać supernatant.
- Resuspender osad w 0,5% BSA/PBS zawierającym 2mM EDTA do stężenia 107 komórek na 90 μL.
- Do komórek dodać magnetyczne kulki pokryte przeciwciałem anty-CD43, aby specyficznie związać komórki inne niż B. Stosować 10 μL kulek na 90 μL (107 komórek). Dobrze wymieszać i inkubować w temperaturze 4°C przez 20 minut.
- Po oznakowaniu komórek przemyć je, dodając 2,5% FBS/PBS do górnej części probówki. Wirować próbkę przy 10 rpm przez 10 minut.
- Odlać supernatant. Resuspender komórki w 0,1% BSA/PBS do stężenia 10x107 komórek na ml.
- Zamontować kolumnę do sortowania magnetycznego na separatorze magnetycznym. Umieścić probówkę stożkową bezpośrednio pod kolumną, aby zbierać przelew, a następnie przygotować kolumnę, przepuszczając przez nią 3mL 0,5% BSA/PBS w celu przepłukania.
- Po przepłynięciu płynu płuczącego wymienić probówkę zbiorczą na nową. Jeśli objętość próbki jest mniejsza niż 1 mL, dostosować ją do 1 mL za pomocą 0,5 %BSA/PBS/EDTA i nanieść próbkę na kolumnę. Na jedną kolumnę nanosić maksymalnie 1 mL komórek; w razie potrzeby użyć wielu kolumn.
- Pozostawić komórki, aby pasywnie przepłynęły przez kolumnę, i zbierać niezwiązane komórki do probówki stożkowej znajdującej się pod kolumną. Przemyć kolumnę 4 razy za pomocą 3 mL 0,5% BSA/PBS, kontynuując zbieranie przelewu.
- Zebrać cały przelew, w którym wzbogacone będą spoczynkowe komórki B negatywne pod względem CD43. Kolumnę wyrzucić. Wirować przelew przy 10 rpm przez 10 minut.
- Odlać supernatant i dodać 10 mL pożywki (15% FCS/ +glutamina, Pen/Strep, niezbędne aminokwasy, 50 μM Β-ME).
- Policzyć komórki i hodować w stężeniu 106 komórek na ml.
- Aby stymulować wzrost i proliferację komórek B, uzupełnić pożywkę rekombinowanym IL-4 oraz przeciwciałem anty-CD40 w taki sposób, aby końcowe stężenia wynosiły odpowiednio 20 μg/mL i 1 μg/mL, a następnie przenieść komórki do kolby hodowlanej.
- Hodować komórki przez noc. Policzyć komórki i rozcieńczyć do 106 komórek na ml, dodając w razie potrzeby IL-4 i CD40.
- Hodować komórki przez 72 godziny przed infekcją wirusową.
2. Transfekcja komórek producentów
Należy zastosować uznane protokoły transfekcji z użyciem lipidów kationowych lub fosforanu wapnia. Transfekcję przeprowadza się w płytce 10cm3 na jeden konstrukt DNA, stosując 10 μg plazmidowego DNA na płytkę. W naszej rutynowej praktyce stosujemy metodę transfekcji fosforanem wapnia 13, 14, zauważając wysoki miano wirusa po dodaniu chlorochiny.
- Jako komórki producenta do transfekcji wykorzystać komórki Phoenix o stopniu konfluencji 60%-70%. Przy takiej konfluencji liczba komórek powinna wynosić 5 milionów na płytkę 10 cm.
- Na godzinę przed transfekcją wymienić medium na świeże, kompletne medium do wzrostu komórek Phoenix.
- W sterylnej probówce typu Eppendorf połączyć 10 μg DNA konstruktu opakowującego oraz 250 μL 0,5M CaCl2, a następnie uzupełnić objętość końcową do 50 μL sterylną wodą.
- Za pomocą pipety 1 mL energicznie wymieszać ten roztwór z 500 μL 2X HNP w 15-mililitrowej probówce polipropylenowej.
- Pozostawić mieszaninę w temperaturze pokojowej na 8-10 minut. W tym czasie utworzy się osad.
- Dodawać mieszaninę do transfekcji kroplami do komórek, delikatnie kołysząc naczyniem, aby równomiernie rozprowadzić mieszaninę w medium.
- Inkubować komórki w temperaturze 37°C przez 12 godzin.
- 12 godzin po transfekcji wymienić medium na 8 ml kompletnego medium do wzrostu komórek B i przenieść komórki z powrotem do inkubatora w temperaturze 37°C.
3. Zakażanie stymulowanych limfocytów B śledziony
- Usunąć supernatant z komórek Phoenix 48 h po transfekcji i przepuścić go przez filtr 0,2 mikrona, aby usunąć szczątki komórkowe.
- Wymieszać 3 mL supernatantu zawierającego wirusa z 3 mL uprzednio aktywowanych limfocytów B (zgodnie z krokiem 1). Aby zwiększyć adsorpcję wirusa do komórek, dodać polybrene do stężenia końcowego 16 μg/mL.
- Zainfekować komórki poprzez wirowanie przy 250 rpm przez 90 minut w temperaturze 30°C.
- Bezpośrednio po wirowaniu inkubować przez kolejne 48-72 h w temperaturze 37°C, aby umożliwić wzrost i proliferację komórek.
4. Analiza cytometryczna
- Za pomocą cytometru przepływowego przeanalizowano komórki pod kątem ekspresji powierzchniowej B20 oraz powierzchniowego IgG1. Obecność IgG1 na powierzchni komórek wskazuje, że doszło do rekombinacji przełączającej klasę w wyniku skutecznego ratunku poprzez retrowirusową komplementację genu AID.
5. Reprezentatywne wyniki
Z powodzeniem przywróciliśmy niedobór białka aktywacyjnej cytydyny deaminase indukowanej (AID) w limfocytach B z deficytem AID (AID-/-) za pomocą transdukcji retrowirusowej. W skrócie: wygenerowaliśmy rekombinowane retrowirusy wykazujące ekspresję białka AID mysiego (mAID) poprzez transfekcję komórek Phoenix plazmidem pMX-mAID-GFP. 15-18Zbiór wirusów zakażono do komórek B z niedoborem AID, otrzymanych od myszy z niedoborem AID w ex vivo warunki stymulacji rekombinacji przełączającej klasy (CSR) 19Następnie analizowano zainfekowane limfocyty B pod kątem CSR do IgG1 po 72 godzinach inkubacji w hodowli, wykorzystując analizę cytometryczną. Rycina 2 przedstawia detekcję IgG1 na powierzchni limfocytów B z AID, czego nie zaobserwowano w przypadku pustego konstruktu, co wskazuje, że CSR nastąpiło w wyniku przywrócenia ekspresji AID.
Rycina 1: Schemat pakowania retrowirusowego w komórkach producentach: Geny zainteresowania, reprezentowane przez Ψ, podklonowano do wektora pMX-IRES-GFP zgodnie z wcześniejszym opisem 15Plazmid wprowadzono do ekotropowej linii komórkowej do pakowania wirusów, zdolnej do produkcji białek gag-pol oraz białka otoczki (Phoenix, Orbigen), stosując metodę fosforanu wapnia. 13, 14Czterdzieści osiem godzin po transfekcji zebrano nadsącz zawierający cząsteczki wirusowe w celu zakażenia docelowych pierwotnych limfocytów B uzyskanych od myszy.
Rysunek 2: Komórki B z niedoborem AID, stymulowane przeciwciałem anty-CD40 oraz IL-4, zostały zainfekowane retrowirusem zawierającym pMX-mAID-GFP lub retrowirusem wykazującym ekspresję samego GFP. Poziom CSR do IgG1 oceniono za pomocą analizy FACS.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Transdukcja retrowirusowa limfocytów B śledziony, opisana w niniejszej pracy i przedstawiona na Rysunku 1, jest podejściem genetycznym przydatnym w badaniu limfocytów B, ponieważ wiele zdarzeń rozwojowych w limfopoezie jest kontrolowanych przez regulację transkrypcyjną 1, 2. W późniejszych etapach dojrzewania limfocytów B aktywacja poprzez CD40L jest niezbędna do indukcji wzrostu limfocytów B, wejścia w cykl komórkowy i proliferacji 11, 20. Jak pokazano na Rysunku 2...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Nie zgłoszono żadnych konfliktów interesów.
Podziękowania
C.K. otrzymuje wsparcie z programu doktoranckiego Uniwersytetu Columbia. U.B. jest stypendystą Leukemia and Lymphoma Society of America, laureatem New Investigator Award z Leukemia Research Foundation oraz otrzymuje wsparcie z funduszy startowych dla nowej kadry naukowca Uniwersytetu Columbia.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| FCS | Atlanta Biologicals | S11550 | |
| RPMI | Invitrogen | 22400 | |
| PBS | Invitrogen | 20012 | |
| Bufor do lizy erytrocytów (RBC) | Sigma-Aldrich | R7757 | |
| Kuleczki CD43 | Miltenyi Biotec | ||
| Pełna pożywka dla limfocytów B | Różne | Różne komponenty | RPMI, 15% FCS, 1% nieessentialnych aminokwasów, 1% pirogronianu sodu, 1% HEPES, 1% Pen-Strep, 50μM β-merkapto–etanolu |
| IL-4 | |||
| Anti-CD40 | BD Biosciences | 553787 | |
| polybrene | Sigma-Aldrich | 107689 | |
| Sól difosforanu chlorochiny | Sigma-Aldrich | C6628 | Stosowana w stężeniu 100mM |
| Komórki Ph–nix Eco (mysie) | Orbigen | RVC-10002 | |
| PE-Cy5-α-mouse-CD45R (B220) | eBioscience | 15-0452-81 | |
| PE-α-mouse-IgG1 | BD Biosciences | A85-1 |
Bibliografia
- Bartholdy, B., Matthias, P. Transcriptional control of B cell development and function. Gene. 327, 1-23 (2004).
- Henderson, A., Calame, K. Transcriptional regulation during B cell development. Annu Rev Immunol. 16, 163-200 (1998).
- Graf, T. Differentiation plasticity of hematopoietic cells. Blood. 99, 3089-30101 (2002).
- Xiao, C., Rajewsky, K. MicroRNA control in the immune system: basic principles. Cell. 136, 26-36 (2009).
- Waterston, R. H. Initial sequencing and comparative analysis of the mouse genome. Nature. 420, 520-562 (2002).
- Griffiths, A. J. F., Miller, J. H., Suzuki, D. T., Lewontin, R. C., Gelbart, W. M. Introduction to Genetic Analysis. , W. H. Freeman. New York. (2000).
- Gondo, Y. Next-generation gene targeting in the mouse for functional genomics. BMB Rep. 42, 315-3123 (2009).
- Plachy, J. Proviruses selected for high and stable expression of transduced genes accumulate in broadly transcribed genome areas. J Virol. 84, 4204-4211 (2010).
- Felice, B. Transcription factor binding sites are genetic determinants of retroviral integration in the human genome. PLoS One. 4, e4571-e4571 (2009).
- Karavanas, G. Cell targeting by murine retroviral vectors. Crit Rev Oncol Hematol. 28, 7-30 (1998).
- Noelle, R. J. A 39-kDa protein on activated helper T cells binds CD40 and transduces the signal for cognate activation of B cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 89, 6550-6554 (1992).
- Muramatsu, M. Class switch recombination and hypermutation require activation-induced cytidine deaminase (AID), a potential RNA editing enzyme. Cell. 102, 553-563 (2000).
- Yelle, J., Dion, M., Hamelin, C. Efficient transfection of mammalian cells with viral DNA in optimal culture conditions. J Virol Methods. 7, 321-326 (1983).
- Chen, C., Okayama, H. High-efficiency transformation of mammalian cells by plasmid DNA. Mol Cell Biol. 7, 2745-2752 (1987).
- Fagarasan, S. In situ class switching and differentiation to IgA-producing cells in the gut lamina propria. Nature. 413, 639-6343 (2001).
- Basu, U. The AID antibody diversification enzyme is regulated by protein kinase A phosphorylation. Nature. 438, 508-5011 (2005).
- McBride, K. M. Regulation of class switch recombination and somatic mutation by AID phosphorylation. J Exp Med. 205, 2585-2594 (2008).
- Barreto, V. M. AID from bony fish catalyzes class switch recombination. J Exp Med. 202, 733-738 (2005).
- Delphin, S., Stavnezer, J. Regulation of antibody class switching to IgE: characterization of an IL-4-responsive region in the immunoglobulin heavy-chain germline epsilon promoter. Ann N Y Acad Sci. 764, 123-135 (1995).
- Castigli, E. CD40 expression and function in murine B cell ontogeny. Int Immunol. 8, 405-411 (1996).
- Ballantyne, J. Efficient recombination of a switch substrate retrovector in CD40- activated B lymphocytes: implications for the control of CH gene switch recombination. J Immunol. 161, 1336-1347 (1998).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
