Ocena równowagi ruchowej i koordynacji u myszy z wykorzystaniem belki równowagi

Podsumowanie

Deficyty w obrębie precyzyjnej koordynacji ruchowej można ocenić za pomocą testu na belce równowagi. Wynik testu określa się na podstawie prędkości przejścia przez belkę oraz liczby ześlizgnięć myszy z belki.

Streszczenie

Urazy mózgu, manipulacje genetyczne oraz leczenie farmakologiczne mogą prowadzić do zmian w sprawności motorycznej u myszy. Precyzyjną koordynację ruchową i równowagę można ocenić za pomocą testu chodzenia po belce. Celem tego badania jest utrzymanie przez mysz pionowej pozycji i przejście przez podwyższoną, wąską belkę do bezpiecznej platformy. Test odbywa się przez 3 kolejne dni: 2 dni treningu i 1 dzień właściwego badania. Wyniki na belce są kwantyfikowane poprzez pomiar czasu potrzebnego myszy na przejście przez belkę oraz liczby poślizgnięć łap występujących w tym procesie. W niniejszym opracowaniu przedstawiamy protokół stosowany w naszym laboratorium oraz reprezentatywne wyniki uzyskane w grupie myszy C57BL/6. Zadanie to jest szczególnie przydatne do wykrywania subtelnych deficytów w umiejętnościach motorycznych i równowadze, których mogą nie wykryć inne testy motoryczne, takie jak Rotarod.

Protokół

1. Niniejszy protokół opiera się na metodach opracowanych przez Southwell et. al. (2009) oraz Carter et. al. (2001).

1. Aparat z belkami składa się z belek o długości 1 metra (z płaską powierzchnią o szerokości 12 mm lub 6 mm), opartych na dwóch słupkach 50 cm nad blatem stołu. Na końcu belki, jako punkt końcowy, umieszczone jest czarne pudełko. (Sklejkę i inne rodzaje drewna na belki, słupki i pudełko można znaleźć w większości sklepów z artykułami budowlanymi). W czarnym pudełku umieszcza się materiał gniazdowy z klatek domowych, aby przyciągnąć mysz do punktu końcowego. Lampa (z żarówką 60 W) służy do oświetlenia punktu startowego i pełni rolę bodźca awersyjnego. Czas przejścia środkowego odcinka 80 cm jest mierzony przez dwa detektory ruchu (wyprodukowane przez Visopia): jeden na poziomie 0 cm, który uruchamia stoper, oraz drugi na poziomie 80 cm, który go zatrzymuje. Pod belką, około 7,5 cm nad blatem stołu, rozciągnięto hamak nylonowy (dostępny w lokalnym sklepie z tkaninami), aby zamortyzować ewentualne upadki. Kamera wideo ustawiona na statywie służy do rejestracji przebiegu badania. Aparat wykorzystany w tej demonstracji został zbudowany na miejscu.
2. Do tego testu zaleca się grupę co najmniej 10 myszy dla każdego stanu. Myszy są przetrzymywane w grupach, jeśli to możliwe, w cyklu 12 godzin światła (7:00–19:00) i ciemności, a przed rozpoczęciem testu są aklimatyzowane w klatkach w pomieszczeniu behawioralnym przez co najmniej 2 tygodnie. Około 10 min przed treningiem/testowaniem myszy mogą być transportowane do pomieszczenia z aparatem z belkami.
3. W dniach treningowych każda mysz pokonuje belkę 12 mm 3 razy, a następnie belkę 6 mm 3 razy. W przypadku myszy, które nie są w stanie pokonać węższych belek lub w przypadku większych osobników, można zastosować belki o większej szerokości (np. 28 mm). Myszy są umieszczane na jednym końcu belki, a czas wymagany do dotarcia do pudełka ucieczkowego na drugim końcu (oddalonego o 80 cm) jest mierzony przez detektory ruchu. Stoper jest uruchamiany w momencie, gdy nos myszy wchodzi w środkowy odcinek 80 cm, i zatrzymywany, gdy zwierzę dotrze do końca tego odcinka. Pomiędzy sesjami treningowymi na dwóch belkach myszy odpoczywają przez 10 min w swoich klatkach domowych. W tym okresie między próbami można trenować kolejne 3–4 myszy, aby efektywnie wykorzystać czas. Myszy C57BL/6 zazwyczaj pokonują belkę z minimalną liczbą zatrzymań lub wahań. Jednak w przypadku, gdy zwierzę zatrzyma się, zacznie węszyć lub rozglądać się zamiast iść naprzód, badacz powinien zachęcić mysz do kontynuowania ruchu, delikatnie popychając ją od tyłu palcami w rękawiczkach. Po wejściu do bezpiecznego pudełka myszy mają czas (~15 s) na odpoczynek przed kolejną próbą. Po każdej sesji treningowej myszy są przenoszone bezpośrednio do klatek domowych i odstawiane do pomieszczenia mieszkalnego. Należy zauważyć, że myszy mogą częściej się zatrzymywać, jeśli są nadmiernie trenowane i staną się zbyt zaznajomione z zadaniem i aparatem. Z drugiej strony, jeśli po 2 dniach treningu myszy nadal nie pokonują całej belki z sukcesem, trening można kontynuować przez kolejne dni. Jeśli myszy są poddane działaniom terapeutycznym, przed rozpoczęciem leczenia należy uzyskać pomiar bazowy wyników.
4. W dniu testu rejestrowane są czasy przejścia każdej belki. Wyciągana jest średnia z dwóch udanych prób, w których mysz nie zatrzymała się na belce. Nagrania wideo mogą być wykorzystane do dokładniejszej analizy poślizgów i innych obserwowalnych deficytów motorycznych. Alternatywnym sposobem oceny chodu po belce jest system punktowania neurologicznego^1,2, w którym niezdolność do pokonania belki oceniana jest na „1”, a zdolność do normalnego przejścia belki z obiema łapami na jej powierzchni i mniej niż dwoma poślizgami stopy na „7”. Poślizg definiuje się jako zsunięcie się stopy z górnej powierzchni belki. W tym systemie indeksowania wynik „3” odpowiadałby pokonywaniu belki poprzez ciągnięcie kończyn. Zwierzę, które uzyska wynik 1 w dwóch próbach, nie jest ponownie testowane. Opis wyników na belce w odniesieniu do innych punktacji można znaleźć w publikacjach Feeney et al. (1982) oraz Carter et al. (2001).
5. Przed umieszczeniem kolejnej belki w aparacie, belki i pudełko są oczyszczane z odchodów myszy i przecierane ręcznikami nasączonymi 70% etanolem, a następnie wodą.

2. Reprezentatywne wyniki:

Rycina 1. Typowe czasy przejścia samców i samic C57Bl6 po belkach o szerokości 6 mm i 12 mm. Grupa myszy C57BL/6-NCRL WT w wieku od 9 do 11 tygodni została poddana testom na obu belkach po 2 dniach treningu. Średnie czasy przejścia belki 12 mm wynosiły 4,6 ± 0,4 sec dla samców (n=14) i 3,3 ± 0,3 sec dla samic (n=11). Czasy na belce 6 mm wynosiły 6,8 ± 0,7 sec dla samców (n=13) i 5,9 ± 0,5 sec dla samic (n=10) (błędy podano jako S.E.M.).

Dyskusja

Wyniki testu na belce równoważnej stanowią użyteczną miarę precyzyjnej koordynacji i równowagi, co zostało potwierdzone w poprzednich badaniach. Test ten pozwala wykryć deficyty motoryczne wynikające z wieku, uszkodzeń ośrodkowego układu nerwowego oraz manipulacji genetycznych i farmakologicznych u młodych i starszych gryzoni^2,3,4. Myszy z uszkodzeniami kory mózgu często wykazują ześlizgiwanie się z belki po stronie przeciwległej do uszkodzenia^5,6. Test na belce był również stosowany do różnicowania...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Belki: 1-m paski gładkiego drewna z małymi, średnimi i dużymi kwadratowymi przekrojami poprzecznymi (tj. o szerokości 6, 12 i 28 mm)
Stojak wspierający do podtrzymania początkowej sekcji uniesionej belki (∼1,5-cm przekrój poprzeczny, 50 cm wysokości)
Pudełko celu (20 cm z każdej strony) zamontowane na stojaku wspierającym (3 cm przekrój poprzeczny, 50 cm wysokości)
Hamak-∼7,5 cm nad blatem stołu
Lampka biurkowa o mocy 60 watów (W)
Kamera wideo, statyw i czyste kasety wideo
Ethanol, ręczniki papierowe, materiały czyszczące