Deficyty w obrębie precyzyjnej koordynacji ruchowej można ocenić za pomocą testu na belce równowagi. Wynik testu określa się na podstawie prędkości przejścia przez belkę oraz liczby ześlizgnięć myszy z belki.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Ocena równowagi ruchowej i koordynacji u myszy z wykorzystaniem belki równowagi
* These authors contributed equally
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Urazy mózgu, manipulacje genetyczne oraz leczenie farmakologiczne mogą prowadzić do zmian w sprawności motorycznej u myszy. Precyzyjną koordynację ruchową i równowagę można ocenić za pomocą testu chodzenia po belce. Celem tego badania jest utrzymanie przez mysz pionowej pozycji i przejście przez podwyższoną, wąską belkę do bezpiecznej platformy. Test odbywa się przez 3 kolejne dni: 2 dni treningu i 1 dzień właściwego badania. Wyniki na belce są kwantyfikowane poprzez pomiar czasu potrzebnego myszy na przejście przez belkę oraz liczby poślizgnięć łap występujących w tym procesie. W niniejszym opracowaniu przedstawiamy protokół stosowany w naszym laboratorium oraz reprezentatywne wyniki uzyskane w grupie myszy C57BL/6. Zadanie to jest szczególnie przydatne do wykrywania subtelnych deficytów w umiejętnościach motorycznych i równowadze, których mogą nie wykryć inne testy motoryczne, takie jak Rotarod.
Protokół
1. Niniejszy protokół opiera się na metodach opracowanych przez Southwell et. al. (2009) oraz Carter et. al. (2001).
- Aparat z belkami składa się z belek o długości 1 m z płaską powierzchnią o szerokości 12 mm lub 6 mm, opartych na dwóch słupkach w odległości 50 cm nad blatem stołu. Na końcu belki umieszcza się czarne pudełko jako punkt końcowy. (Sklejkę i inne rodzaje drewna na belki, słupki i pudełko można nabyć w większości sklepów budowlanych). W czarnym pudełku umieszcza się materiał gniazdowy z klatek macierzystych, aby przyciągnąć mysz do punktu końcowego. Lampa (z żarówką 60 W) służy do oświetlenia punktu startowego i pełni rolę bodźca awersyjnego. Czas przejścia środkowego odcinka 80 cm jest mierzony przez dwa detektory ruchu (producent: Visopia): jeden przy 0 cm, który uruchamia stoper, i drugi przy 80 cm, który go zatrzymuje. Pod belką, ok. 7,5 cm nad blatem stołu, rozciągnięty jest nylonowy hamak (dostępny w lokalnym sklepie z tkaninami), aby zamortyzować ewentualne upadki. Kamera wideo jest ustawiona na statywie w celu rejestracji przebiegu badania. Aparat wykorzystany w tej demonstracji został zbudowany na miejscu.
- Do tego testu zaleca się kohortę co najmniej 10 myszy dla każdego wariantu badania. Myszy są utrzymywane w grupach, jeśli to możliwe, w 12-godzinnym cyklu światło (7:00-19:00)/ciemność i są aklimatyzowane w klatkach w pomieszczeniu behawioralnym przez co najmniej 2 tygodnie przed rozpoczęciem testu. Około 10 min przed treningiem/testowaniem myszy można przetransportować do pomieszczenia z aparatem z belkami.
- W dniach treningowych każda mysz przechodzi przez belkę 12 mm 3 razy, a następnie przez belkę 6 mm 3 razy. Dla myszy, które nie są w stanie przejść przez węższe belki, lub dla większych myszy, można zastosować belki o większej szerokości (np. 28 mm). Myszy są umieszczane na jednym końcu belki, a czas potrzebny na dotarcie do pudełka ucieczkowego na drugim końcu (w odległości 80 cm) jest mierzony przez detektory ruchu. Stoper uruchamia się w momencie, gdy nos myszy wchodzi w środkowy odcinek 80 cm, a zatrzymuje, gdy zwierzę dotrze do końca tych 80 cm. Pomiędzy sesjami treningowymi na dwóch belkach myszy odpoczywają przez 10 min w swoich klatkach macierzystych. W tym czasie między próbami można trenować kolejne 3-4 myszy, aby efektywnie wykorzystać czas. Myszy C57BL/6 zazwyczaj przechodzą przez belkę przy minimalnej liczbie zatrzymań lub zawahań. Jednak gdy zwierzę się zatrzyma, węszy lub rozgląda bez posuwania się naprzód, badacz powinien zachęcić mysz do dalszego ruchu, delikatnie popychając ją od tyłu palcami w rękawiczkach. Po wejściu do bezpiecznego pudełka myszy mają czas na odpoczynek (ok. 15 s) przed kolejną próbą. Po każdej sesji treningowej myszy są przenoszone bezpośrednio do klatek macierzystych i odstawiane do pomieszczenia hodowlanego. Należy zauważyć, że myszy mogą częściej się zatrzymywać, jeśli są nadmiernie trenowane i stają się zbyt oswojone z zadaniem i aparatem. Z drugiej strony, trening można kontynuować przez dodatkowe dni, jeśli po 2 dniach treningu myszy nadal nie pokonują całej belki pomyślnie. Jeśli myszy są poddawane działaniu substancji leczniczych, przed rozpoczęciem leczenia należy uzyskać pomiar wyjściowy wydajności.
- W dniu testu rejestruje się czasy przejścia każdej belki. Wyciąga się średnią z dwóch udanych prób, w których mysz nie zatrzymała się na belce. Nagrania wideo mogą być wykorzystane do dokładniejszej analizy poślizgów i innych obserwowalnych deficytów motorycznych. Alternatywnym sposobem oceny chodu po belce jest system punktacji neurologicznej1,2, w którym brak możliwości przejścia przez belkę oceniany jest jako „1”, a zdolność do normalnego przejścia belki z obiema łapami na jej powierzchni i mniej niż dwoma poślizgami jako „7”. Poślizg definiuje się jako ześlizgnięcie się łapy z górnej powierzchni belki. W tym systemie punktacja „3” odpowiadałaby przejściu belki z przeciąganiem kończyn. Zwierzę, które uzyska punktację 1 w dwóch próbach, nie jest ponownie testowane. Opis wyników na belce w odniesieniu do innych punktacji można znaleźć w pracy Feeney et al. (1982) oraz Carter et al. (2001).
- Belki i pudełko są oczyszczane z odchodów myszy i przecierane ręcznikami nasączonymi 70% etanolem, a następnie wodą, przed umieszczeniem kolejnej belki w aparacie.
2. Reprezentatywne wyniki:
Rycina 1. Typowe czasy przejścia samców i samic C57Bl6 po belkach o szerokości 6mm i 12mm. Grupa myszy C57BL/6-NCRL WT w wieku od 9 do 11 tygodni została przebadana na obu belkach po 2 dniach treningu. Średnie czasy przejścia belki 12 mm wyniosły 4,6 ± 0,4 sec dla samców (n=14) oraz 3,3 ± 0,3 sec dla samic (n=11). Czasy na belce 6 mm wyniosły 6,8 ± 0,7 sec dla samców (n=13) oraz 5,9 ± 0,5 sec dla samic (n=10) (błędy podano jako S.E.M.).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Wyniki testu na belce równoważnej stanowią użyteczną miarę precyzyjnej koordynacji i równowagi, co zostało potwierdzone w poprzednich badaniach. Test ten pozwala wykryć deficyty motoryczne wynikające z wieku, uszkodzeń ośrodkowego układu nerwowego oraz manipulacji genetycznych i farmakologicznych u młodych i starszych gryzoni2,3,4. Myszy z uszkodzeniami kory mózgu często wykazują ześlizgiwanie się z belki po stronie przeciwległej do uszkodzenia5,6. Test na belce był również stosowany do różnicowania...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Doświadczenia na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi i przepisami ustalonymi przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Wykorzystania Zwierząt (IACUC) Caltech.
Podziękowania
Amber Southwell przygotowała aparaturę i przeszkoliła autorów w zakresie jej użytkowania. Finansowanie zostało zapewnione z grantu NINDS przyznanego Paulowi Pattersonowi.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Belki: 1-m paski gładkiego drewna z małymi, średnimi i dużymi kwadratowymi przekrojami poprzecznymi (tj. o szerokości 6, 12 i 28 mm) | |||
| Stojak wspierający do podtrzymania początkowej sekcji uniesionej belki (∼1,5-cm przekrój poprzeczny, 50 cm wysokości) | |||
| Pudełko celu (20 cm z każdej strony) zamontowane na stojaku wspierającym (3 cm przekrój poprzeczny, 50 cm wysokości) | |||
| Hamak-∼7,5 cm nad blatem stołu | |||
| Lampka biurkowa o mocy 60 watów (W) | |||
| Kamera wideo, statyw i czyste kasety wideo | |||
| Ethanol, ręczniki papierowe, materiały czyszczące |
Bibliografia
- Feeney, D. M., Gonzalez, A., Law, W. A. Amphetamine, haloperidol, and experience interact to affect rate of recovery after motor cortex injury. Science. 217, 855-857 (1982).
- Carter, R. J., Morton, J., Dunnett, S. B. Motor coordination and balance in rodents. Curr Protoc Neurosci. Chapter 8, (2001).
- Wallace, J. E., Krauter, E. E., Campbell, B. A. Motor and reflexive behavior in the aging rat. J Gerontol. 35, 364-370 (1980).
- Brooks, S. P., Dunnett, S. B. Tests to assess motor phenotype in mice: a user's guide. Nat Rev Neurosci. 10, 519-529 (2009).
- Fox, G. B., Fan, L., Levasseur, R. A., Faden, A. I. Sustained sensory/motor and cognitive deficits with neuronal apoptosis following controlled cortical impact brain injury in the mouse. J Neurotrauma. 15, 599-614 (1998).
- Buccafusco, J. J. Methods of behavioral analysis in neuroscience. , 2nd edn, CRC Press. (2009).
- Southwell, A. L., Ko, J., Patterson, P. H. Intrabody gene therapy ameliorates motor, cognitive, and neuropathological symptoms in multiple mouse models of Huntington's disease. J Neurosci. 29, 13589-13602 (2009).
- Carter, R. J. Characterization of progressive motor deficits in mice transgenic for the human Huntington's disease mutation. J Neurosci. 19, 3248-3257 (1999).
- Gulinello, M., Chen, F., Dobrenis, K. Early deficits in motor coordination and cognitive dysfunction in a mouse model of the neurodegenerative lysosomal storage disorder, Sandhoff disease. Behav Brain Res. 193, 315-319 (2008).
- Stanley, J. L. The mouse beam walking assay offers improved sensitivity over the mouse rotarod in determining motor coordination deficits induced by benzodiazepines. J Psychopharmacol. 19, 221-227 (2005).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
