Do hodowli komórek macierzystych grzebienia neuronalnego (NCSC) in vitro wymagane jest specjalne medium (NCSCM). Niezbędnym składnikiem NCSCM jest ekstrakt z embrionu kurczaka (CEE). Opisujemy tutaj precyzyjne techniki pozwalające na uzyskanie maksymalnej ilości czystego i wysokiej jakości CEE, w tym szczegóły dotyczące procesów izolacji, maceracji, wirowania oraz filtracji.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Wytwarzanie ekstraktu z zarodka kurczaka do hodowli mysich komórek macierzystych grzebienia neuronalnego
* These authors contributed equally
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Grzebień neuronalny powstaje z neuroektodermy podczas embriogenezy i utrzymuje się jedynie tymczasowo. Wczesne eksperymenty dowiodły już, że pluripotencjalne komórki progenitorowe stanowią integralną część grzebienia neuronalnego1. Fenotypowo komórki macierzyste grzebienia neuronalnego (NCSC) definiuje jednoczesna ekspresja p75 (receptor czynnika wzrostu nerwów o niskim powinowactwie, LNGFR) oraz SOX10 podczas ich migracji z grzebienia neuronalnego2,3,4,5. Komórki progenitorowe te mogą różnicować się w komórki mięśni gładkich, komórki chromafinne, neurony i komórki glejowe, a także w melanocyty, chrząstkę i kości6,7,8,9. Do hodowli NCSC in vitro wymagane jest specjalne medium dla komórek macierzystych grzebienia neuronalnego (NCSCM)10. Najbardziej złożonym elementem NCSCM jest przygotowanie ekstraktu z zarodka kurczaka (CEE), który stanowi kluczowe źródło czynników wzrostu dla NCSC oraz innych rodzajów eksplantów neuronalnych. Pozostałe składniki NCSCM, poza CEE, są dostępne w sprzedaży. Przy produkcji CEE z wykorzystaniem standardowego sprzętu laboratoryjnego niezwykle istotna jest znajomość wymagających szczegółów dotyczących procesów izolacji, maceracji, wirowania i filtracji. W niniejszym protokole opisujemy precyzyjne techniki pozwalające na uzyskanie maksymalnej ilości czystego i wysokiej jakości CEE.
Protokół
Autorzy oświadczają, że eksperymenty na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z dyrektywą Rady Wspólnot Europejskich (86/609/EEC), według wytycznych NIH dotyczących opieki i wykorzystania zwierząt w procedurach eksperymentalnych oraz zgodnie z regulacjami ustalonymi przez Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) na Uniwersytecie w Duisburgu-Essen (Niemcy).
Część 1: Przygotowanie (nie pokazano w filmie)
PRZYGOTOWANIE MATERIAŁÓW I ROZTWIORÓW (przed wyjęciem jaj z inkubatora)
- Jaja należy inkubować w inkubatorze z nawilżaniem przez 11 dni w temperaturze 37°C (100°F).
- Spray z 70% etanolem, czyste płytki, precyzyjne czyste pęsety, sterylne DMEM schłodzone do 4°C (40°F) w lodzie oraz sterylne strzykawki o pojemności 60 mL.
- Sterylne probówki Corning o pojemności 50 mL należy wypełnić w połowie zimnym DMEM (4°C), aby wymieszać zmacerowane zarodki w stosunku 1:1 (masa zmacerowana: DMEM). Disekcję zarodków kurczęt należy rozpocząć niezwłocznie po wyjęciu jaj z inkubatora.
- Narzędzia do dysekcji należy wysterylizować w autoklawie lub, w dniu zabiegu, zanurzyć je w 70% etanolu na 20 minut.
Część 2: Disekcja zarodków kurczaka (zaprezentowana na wideo)
- Zwilż inkubowane jaja rozpylonym 70% etanolem przez co najmniej 30 sekund, a następnie ostrożnie osusz je czystymi, miękkimi ręcznikami papierowymi, unikając nadmiernego wstrząsania jaj.
Uwaga: Zaleca się, aby nie przeprowadzać sekcji więcej niż 60 embrionów kurzych jednocześnie. - Ostrożnie otwórz jaja, uderzając je o ostrą krawędź, a następnie ostrożnie wyjmij embrion, dbając o to, aby nie uszkodzić pęcherzyka żółtkowego ani samego embrionu kurczaka.
- Szybko zlokalizuj początek pępowiny i otwórz przezroczystą błonę otaczającą, nie niszcząc pęcherzyka żółtkowego ani małych naczyń krwionośnych. Następnie przetnij pępowinę za pomocą precyzyjnej, czystej pęsety.
- Wyjmij embrion z pęcherzyka żółtkowego.
Uwaga: Embriony należy szybko zdekapitować (nie pokazano tego na filmie). - Zbierz embriony do minimalnego medium niezbędnego (minimal essential medium) w temperaturze 4°C.
Część 3: Maceracja zarodków kurzych
- Wyjmij tłok ze sterylnej strzykawki 60 mL.
- Przenieś około 10 embrionów do jednej strzykawki 60 mL.
- Ostrożnie włóż tłok z powrotem do strzykawki, aby uniknąć ryzyka utraty zmacerowanego materiału.
- Przeprowadź macerację, naciskając tłok.
- Zbierz zmacerowaną masę do przygotowanych probówek Corning wypełnionych w połowie DMEM w stosunku 1:1 (masa zmacerowana: DMEM). Przy zastosowaniu 10 embrionów uzyskuje się objętość około 25 mL.
- Umieść mieszaninę na wytrząsarce na 45 min w temperaturze 4°C.
Część 4: Centryfugowanie zarodka kurczaka - zawiesina w DMEM
- Przenieś zawiesinę zarodka kurczaka w DMEM do probówek do wirowania.
- Dodaj sterylną hialuronidazę w stężeniu 1 mg na 25 mg zarodka.
- Bardzo precyzyjnie wytaruj probówki do wirowania.
Uwaga: Ten krok należy wykonać z ostrożnością, ponieważ wirowanie odbywa się przy bardzo wysokiej sile g, a użycie niezrównoważonych probówek może doprowadzić do uszkodzenia materiału lub wirówki. Za pomocą wagi o wysokiej dokładności należy uzyskać zgodność trzech miejsc po przecinku dla wszystkich probówek, uzupełniając brakującą ilość za pomocą DMEM. - Obniż temperaturę wirówki do 4°C.
Uwaga: Rotor wirówki powinien również być przechowywany przez noc w komorze chłodniczej lub lodówce. - Wiruj przez 6 godzin przy wartości co najmniej 180.000 x g x h. Uwaga: Aby uzyskać lepsze wyniki w zakresie rozdziału poszczególnych faz, zastosuj 266.000 x g x h. Jeśli to możliwe, użyj regulacji próżniowej.
Część 5: Filtracja ekstraktu z zarodka kurczaka
Po wirowaniu można zaobserwować trzy fazy: górną mętną fazę ciekłą z fragmentami tłuszczowymi, przejrzystą fazę ciekłą w środku oraz osad na dnie probówki do wirowania. Uwaga: Należy ściśle unikać wstrząsania lub gwałtownego poruszania odwirowaną mieszaniną, ponieważ mogłoby to zniweczyć efekt etapu wirowania poprzez utratę przejrzystej środkowej fazy ciekłej.
Uwaga: Wszystkie kolejne kroki muszą być wykonane w warunkach sterylnych przy użyciu dygestorium z laminarnym przepływem powietrza:
- Pipetujemy przejrzystą fazę ciekłą do systemu filtrującego z porami o wielkości 0.45 μm. Następnie włączamy podłączoną pompę próżniową.
Uwaga: Nie należy naruszać osadu na dnie. Mogłoby to doprowadzić do zanieczyszczenia ekstraktu i zapchania systemu filtrującego. - Przenosimy pre-ekstrakt do systemu filtrującego z porami o wielkości 0.22 μm i ponownie włączamy podłączoną pompę próżniową.
- Otrzymany ekstrakt z zarodka kurczaka dzielimy na aalikwoty w sterylnych probówkach Corning o pojemności 15 mL.
- Aliquoty szybko mrozimy w temperaturze -80°C (-62°F). Uwaga: Ekstrakt z zarodka kurczaka (CEE) zachowuje trwałość do dwóch lat przy przechowywaniu w -80°C.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Niniejszy protokół opiera się na modyfikacjach procedur opisanych w przeszłości10,11. Oprócz wcześniejszych publikacji przedstawiamy tutaj poszczególne kroki procesu w bardziej rozbudowanej formie. Wspiera to osobę przeprowadzającą eksperyment, dostarczając istotnych szczegółów zapewniających prawidłowy przebieg i wiarygodne wyniki. Ponadto, ponieważ proces sekcji jest niezbędną częścią ekstrakcji CEE, szczegółowo opisujemy procedurę wyjmowania embrionów z worka żółtkowego. Poniżej omówiono kilka ważnych punkt...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.
Podziękowania
Wsparcie i rady Markusa Pajtlera oraz Roberta Bohrera były nieocenione przy wizualizacji niniejszego protokołu.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| jaja kurze inkubowane przez 11 dni | Sorries-Trockels Vermehrungszucht GmbH | ||
| Alkoholowy spray do dezynfekcji | Schülke Mayr GmbH | ||
| DMEMGlutamax | GIBCO, by Life Technologies | ||
| Strzykawka sterylna (60 ml) | BD Biosciences | ||
| Probówki sterylne (50; 15 ml) | Greiner Bio-One | ||
| Końcówki do pipet sterylne | Starlab GmbH | ||
| Hialuronidaza typu IV-S | Sigma-Aldrich | ||
| Stericupy Milipore sterylne (0,45; 0,22 μl) | Fisher Scientific | ||
| Pipety sterylne (25; 10; 5 ml) | Greiner Bio-One | ||
| Wirówka L5-50 | Rotor typu Ti-45 |
Bibliografia
- Bronner-Fraser, M., Fraser, S. E. Cell lineage analysis reveals multipotency of some avian neural crest cells. Nature. 335, 161-164 (1988).
- Stemple, D. L., Anderson, D. J. Isolation of a stem cell for neurons and glia from the mammalian neural crest. Cell. 71, 973-985 (1992).
- Rao, M. S., Anderson, D. J. Immortalization and controlled in vitro differentiation of murine multipotent neural crest stem cells. J Neurobiol. 32, 722-746 (1997).
- Paratore, C., Goerich, D. E., Suter, U., Wegner, M., Sommer, L. Survival and glial fate acquisition of neural crest cells are regulated by an interplay between the transcription factor Sox10 and extrinsic combinatorial signaling. Cell. 128, 3949-3961 (2001).
- Kim, J., Lo, L., Dormand, E., Anderson, D. J. SOX10 maintains multipotency and inhibits neuronal differentiation of neural crest stem cells. Neuron. 38, 17-31 (2003).
- Anderson, D. J., Groves, A., Lo, L., Ma, Q., Rao, M., Shah, N. M., Sommer, L. Cell lineage determination and the control of neuronal identity in the neural crest. Review Cold Spring Harb Symp Quant Biol. 62, 493-504 (1997).
- Dorsky, R. I., Moon, R. T., Raible, D. W. Environmental signals and cell fate specification in premigratory neural crest. Review Bioessays. 22, 708-716 (2000).
- Sieber-Blum, M. Factors controlling lineage specification in the neural crest. Int Rev Cytol. 197, 1-33 (2000).
- Dupin, E., Real, C., Ledouarin, N. The neural crest stem cells: control of neural crest cell fate and plasticity by endothelin-3. Int Rev Cytol. 73, 533-545 (2001).
- Maurer, J., Fuchs, S., Jäger, R., Kurz, B., Sommer, L., Schorle, H. Establishment and controlled differentiation of neural crest stem cell lines using conditional transgenesis. Differentiation. 75, 890-891 (2007).
- Wu, Y. Y., Mujtaba, T., Rao, M. S. Isolation of stem and precursor cells from fetal tissue. Methods Mol Biol. 198, 29-40 (2002).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
