W niniejszym artykule opisujemy identyfikację serotypu 3 wirusa towarzyszącego adenowirusom (AAV3) jako najskuteczniejszego wektora do celowania w ludzkie komórki raka wątroby.
Artykuł metodologiczny
Wysokoefektywna transdukcja komórek raka wątroby za pomocą wektorów rekombinowanego wirusa adeno-zależnego serotypu 3
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Opracowano rekombinowane wektory oparte na niepatogennym ludzkim parwowirusie, wirusie towarzyszącym adenowirusom 2 (AAV2), które są obecnie wykorzystywane w wielu badaniach klinicznych nad terapią genową. W ostatnim czasie wyizolowano również szereg dodatkowych serotypów AAV, które wykazują selektywny tropizm tkankowy w różnych modelach zwierząt małych i dużych1. Spośród 10 najczęściej stosowanych serotypów AAV, AAV3 jest zdecydowanie najmniej wydajny w transdukcji komórek i tkanek in vitro, jak i in vivo.
Jednak w naszych niedawno opublikowanych badaniach udokumentowaliśmy, że wektory AAV3 niezwykle efektywnie transdukują linie komórkowe raka wątroby u ludzi – hepatoblastoma (HB) oraz raka hepatokomórkowego (HCC), ponieważ AAV3 wykorzystuje ludzki receptor czynnika wzrostu hepatocytów jako koreceptor komórkowy do wiązania i wnikania do tych komórek2,3.
W niniejszym artykule opisujemy kroki niezbędne do osiągnięcia wysokowydajnej transdukcji ludzkich komórek raka wątroby za pomocą rekombinowanych wektorów AAV3 niosących gen reporterowy. Zastosowanie rekombinowanych wektorów AAV3 niosących gen terapeutyczny może w przyszłości doprowadzić do potencjalnej terapii genowej nowotworów wątroby u ludzi.
Protokół
1. Pakowanie wektorów rekombinowanego wirusa adeno-zależnego serotypu 3 (rAAV3)
- Przejdź do witryny: „http://www.geguchadze.com/calc" i oblicz ilość DNA.
- Wstępnie zmieszaj plazmidy pHelper (pomocniczy adenowirusa), pACG2c3 (pomocniczy AAV) i pdsAAV-CB-EGFP (wektor rAAV) w pożywce bez FBS i antybiotyków. Objętość całkowita powinna wynosić 8,750 μL dla dziesięciu płytek o powierzchni 15 cm2.
- Dodaj bezpośrednio 1,250 μL PEI (0,1% m/v, Polysciences, Cat# 23966, pH 4,5) do roztworu DNA z kroku 1.2. Mieszaj roztwór DNA-PEI w wirówce typu vortex przez kilka sekund.
- Inkubuj roztwór DNA-PEI w temperaturze pokojowej (RT) przez 5 min w celu utworzenia kompleksu.
- Dodaj 1 mL roztworu DNA-PEI na każdą płytkę 15 cm2.
- Usuń pożywkę po 4 godzinach, zastępując ją świeżymi 25 mL pełną pożywką z 10%FBS (C-DMEM).
- Siedemdziesiąt dwie godziny po transfekcji zeskrob komórki i przelej je do stożkowej probówki wirówkowej o pojemności 250 mL.
- Wiruj przy 3000 rpm w temperaturze 4°C przez 10 min. Odlej nadosad.
- Resuspenduj osad komórkowy w 5 mL buforu RB TMS (50 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, pH 8,0). Przenieś do nowej probówki stożkowej 15 mL.
- Zamroź w kąpieli z suchego lodu i etanolu przez 10 min, a następnie odmroź w 37°C przez 10 min. Powtórz czynność trzy razy.
- Dodaj 1 μL 4,8 M MgCl2 i 2 μL Benzonazy (25 U/ μL, Novagen, Cat# 70664-3). Wymieszaj w vortexie i inkubuj w 37°C przez 40 min.
- Odwiruj przy 4,000 rpm w temperaturze 4°C przez 40 min i zbierz nadosad (klarowny lizat).
- W probówce wirówkowej Quick-Seal 13 mL (Beckman, Cat# 342413) przygotuj gradient jodiksanolu (OptiPrep, Cat# 1114542) od góry do dołu: 2 mL 15%, 2 mL 25%, 1,5 mL 40% i 1,5 mL 60% jodiksanolu. Nałóż nadosad (krok 1.12) na górę gradientu jodiksanolu. Wypełnij probówki buforem RB TMS.
- Wiruj przy 75,000 rpm przez 1 godzinę w 16°C, używając rotora Beckman 90Ti.
- Zbierz frakcję 40% jodiksanolu, wprowadzając strzykawkę na granicy 40-60%.
- Przenieś frakcję 40% jodiksanolu do jednej probówki stożkowej 50 mL i uzupełnij do 40 mL buforem A (20 mM Tris, 15 mM NaCl, pH 8,5).
- Złóż aparat do filtracji, używając kolumny HiTrap Q HP (GE Healthcare, Cat# 17-1154-01). Przemyj kolumnę następującymi buforami: 25 mL buforu A (20 mM Tris, 15 mM NaCl, pH 8,5); 25 mL buforu B (10 mM Tris, 500 mM NaCl, pH 8,5); 50 mL buforu A; 40 mL próbki wirusa w buforze A; 50 mL buforu A (20 mM Tris, 15 mM NaCl, pH 8,5); 20 mL buforu C (20 mM Tris, 175 mM NaCl, pH 8,5);
- Zbierz bufor C do koncentratora Apollo 20 mL (Orbital Biosciences). Wiruj przy 3,000 rpm w 4°C przez 10 min.
- Odrzuć przelew i dodaj 20 mL schłodzonego PBS, a następnie wiruj przy 3,000 rpm w 4°C przez 10 min.
- Odrzuć przelew i dodaj 500 μL schłodzonego PBS. Wypłucz wektory z membrany, przenieś do probówek Eppendorf traktowanych silikonem i przechowuj zamrożone w małych aliquotach w -80°C.
2. Oznaczanie miana wektora rAAV3
- Odmrozić 10 μL oczyszczonego wirusa w probówce Eppendorf na lodzie. Dodać 40 μL ddH2O.
- Dodać 0,2 μL Benzonazy (25 U/ μL, Novagen, Cat# 70664) i inkubować w 37°C przez 1 godzinę.
- Odmiarkować 50 μL standardu plazmidowego (0,2 ng/ μL) do drugiej probówki Eppendorf.
- Dodać 50 μL 100 mM NaOH do każdej probówki i inkubować w 65°C przez 30 min.
- Natychmiast schłodzić na lodzie przez co najmniej 5 min.
- Wyciąć membranę transferową (Millipore, Cat# INYC00010) zgodnie z rozmiarem papieru filtrującego Bio-Dot (Bio-Rad, Cat# 1620161). Płukać membranę w 10x SSC przy użyciu trzech papierów filtrujących przez 20 min.
- Przygotować aparat do slot blot SF (Bio-Dot, Cat# 170-6542). Podłączyć go do kolby próżniowej i dodać 100 μL 10x SSC do aparatu do slot blot.
- Dodać 100 μL 20x SSC i 1 μL 6x barwnika do ładowania do każdej z próbek z kroku 2.5.
- Nanieść 100 μL każdej z próbek na membranę w aparacie do slot blot.
- Dodać kolejne 100 μL 10x SSC do każdej z próbek.
- Powtarzać kroki 2.9 i 2.10, aż cała próbka przejdzie przez membranę.
- Zdemontować aparat do slot blot i wyjąć membranę. Umieścić ją w urządzeniu do sieciowania UV Inspector Linker SL-1000. Włączyć funkcję „Energy”, wybrać „Optimal Crosslink” (wartość 1200) i nacisnąć „Start”.
- Gotować 1 mL DNA z plemników łososia (SS) (Fisher, Cat# NC9753983) przez 5 min. Schłodzić na lodzie przez co najmniej 5 min.
- Przygotować roztwór do prehybrydyzacji, mieszając 27,5 mL ddH2O, 15 mL 20x SSC, 5 mL 50x roztworu Denhardta, 1,25 mL 20% SDS, 0,25 mL PolyA oraz 1 mL SS DNA z kroku 2.13.
- Zawiesić membranę w 25 mL roztworu do prehybrydyzacji w zakorkowanym cylindrze szklanym i inkubować w 65°C w komorze do hybrydyzacji przez noc.
- Rozcieńczyć 50 ng matryc DNA w 10 μL ddH2O. Gotować w 100°C przez 5 min i natychmiast schłodzić na lodzie przez co najmniej 5 min.
- Wirować przy 3000 rpm w temperaturze pokojowej przez 1 min. Dodać 2 μL 10 mM 3 dNTP (bez dCTP), 2 μL mieszaniny heksanukleotydów (Roche, Cat# 11277081001), 1 μL fragmentu Klenow (Roche, Cat# 11008404001) oraz 5 μL α-32P-dCTP. Inkubować w 37°C przez 10 min.
- Wirować kolumny G-50 (GE Healthcare, Cat# 27-5330-01) przy 3000 rpm przez 2 min. Nanieść sondę z kroku 2.17 na kolumnę. Wirować przy 3000 rpm przez 2 min i zebrać frakcję przejściową.
- Zmierzyć radioaktywność. Gotować sondę w 100°C przez 5 min i natychmiast schłodzić na lodzie przez co najmniej 5 min.
- Dodać sondę (6x105 cpm/ mL) do roztworu do prehybrydyzacji z membraną.
- Inkubować przez noc w 65°C w komorze do hybrydyzacji.
- Odlać roztwór do hybrydyzacji i płukać membranę w 2x SSC + 0,1% SDS w temperaturze pokojowej przez 15 min.
- Odlać roztwór i płukać membranę w 0,1x SSC + 0,1% SDS w 65°C przez 30 min.
- Odlać roztwór i krótko płukać membranę w 0,1x SSC w temperaturze pokojowej.
- Naświetlać film w -80°C przez 6 godzin, a następnie go wywołać. Typowy wynik przedstawiono na Rysunku 1.
3. Transdukcja za pośrednictwem wektora rAAV3 i ekspresja transgenu w ludzkich komórkach raka wątroby
- Wysiać 1x104 komórek (Huh7 lub Hep293TT) do każdej studni płytki 96-dołkowej. Inkubować w wilgotnym inkubatorze CO2 przez co najmniej 18 godzin.
- Usunąć pożywkę z płytki 96-dołkowej.
- Przemyć komórki dwukrotnie 50 μL pożywki bez FBS i antybiotyków, a następnie usunąć płyn.
- Dodać 50 μL pożywki bez FBS i antybiotyków oraz wektory rAAV w dawce 5,000 vgs/cell.
- Inkubować płytki w inkubatorze CO2 przez 4 godziny.
- Odlać pożywkę. Przemyć komórki dwukrotnie 50 μL pożywki kompletnej, a następnie usunąć płyn.
- Dodać 150 μL C-DMEM do każdej studni i inkubować płytkę w inkubatorze CO2 przez 72 godziny, a następnie zwizualizować ekspresję EGFP za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego (DMI 4000B; Leica Microsystems).
- Obrazy z trzech studni z komórkami zakażonymi wirusem poddać analizie ilościowej przy użyciu oprogramowania ImageJ (NIH, Bethesda, MD, USA).
- Ekspresję transgenu ocenia się jako całkowitą powierzchnię fluorescencji zielonej (pixel2) na pole widzenia. Typowy wynik przedstawiono na Rysunku 2.
- Ekspresję transgenu można również określić za pomocą cytometrii przepływowej.
4. Reprezentatywne wyniki:
Postępując zgodnie z opisanym powyżej protokołem, można efektywnie generować wektory AAV różnych serotypów. Typowa wydajność wynosi ~500 μL zawierających ~1011 vgs/μL oczyszczonego zapasu wektora. Czystość zapasu wektora określa się poprzez porównanie sygnałów hybrydyzacji w ilościowych testach DNA slot blot, z trawieniem Benzonazą i bez niego. Oczyszczone wektory rAAV3 efektywnie transdukują ludzkie linie komórkowe raka wątroby – hepatoblastomy (HB) oraz raka hepatokomórkowego (HCC).
Rycina 1. Ilościowa analiza DNA metodą slot-blot w celu oznaczenia mian wektorów rAAV3. Dwukrotne rozcieńczenia oczyszczonych zapasów wirusa, trawione Benzonazą (górny rząd), analizowano na ilościowych slot-blotach DNA z użyciem sondy DNA specyficznej dla EGFP znakowanej 32P. Miano wektora AAV3 określono poprzez porównanie z 1 ng (środkowy rząd) lub 10 ng (dolny rząd) standardów plazmidowych AAV-EGFP naniesionych na membranę. Liczby odpowiadają kopiom DNA.
Rycina 2. Ekspresja transgenu za pośrednictwem rekombinantnego wektora AAV w ludzkich komórkach raka wątroby. Komórki Hep293TT, niedawno opracowana linia komórkowa hepatoblastomy ludzkiej4, zostały poddane infekcji pozorowanej (lewy panel) lub transdukcji wektorami scAAV2-EGFP lub scAAV3-EGFP w dawce 5,000 vgs/cell w temperaturze 37°C przez 2 godziny. Ekspresję transgenu zwizualizowano 72 godziny po transdukcji przy użyciu mikroskopu fluorescencyjnego.
Dyskusja
Opracowano rekombinowane wektory oparte na niepatogennym ludzkim parwowirusie, wirusie towarzyszącym adenowirusom (AAV), które są obecnie wykorzystywane w licznych badaniach klinicznych nad terapią genową5. Wcześniej, spośród 10 najczęściej stosowanych serotypów AAV, raportowano, że wydajność transdukcji wektorów AAV3 jest ogólnie szczególnie niska, zarówno in vitro, jak i in vivo1. Jednakże nasza niedawna obserwacja, że wektory AAV3 niezwykle dobrze transdukują linie komórkowe raka wątroby człowieka, co określono ilościowo za pomocą cytometrii przepływowej2, oraz że AAV3 wykorzystuje ludzki receptor czynnika wzrostu hepatocytów (hHGFR) jako komórkowy koreceptor do wiązania i wnikania do tych komórek3, silnie sugeruje selektywny tropizm tkankowy AAV3 do ludzkich komórek wątroby w ogóle, a w szczególności do ludzkich komórek raka wątroby. Ponieważ jednak wektory AAV3 wydajnie transdukują również prawidłowe ludzkie hepatocyty2, ich potencjalne zastosowanie w terapii genowej nowotworów in vivo mogłoby zostać ograniczone. Jedną z możliwych strategii obejścia tego problemu jest celowanie transkrypcyjne w komórki nowotworowe poprzez identyfikację produktu genu, który jest selektywnie produkowany przez guz, a nie przez prawidłowe hepatocyty. Na przykład wcześniejsze badania wykazały, że poziom α-fetoproteiny (AFP) w surowicy jest wykorzystywany jako specyficzny marker do śledzenia obecności, progresji i/lub nawrotu niektórych typów raka wątroby, ponieważ prawidłowe hepatocyty zazwyczaj produkują bardzo niewielkie ilości tego białka. Rzeczywiście, wykorzystaliśmy wektory AAV3 zawierające promotor AFP, aby skierować ekspresję transgenu do komórek raka wątroby, a nie do prawidłowych hepatocytów2, a obecnie trwają badania nad sprawdzeniem skuteczności tego podejścia w mysim modelu ksenograftu raka wątroby. W naszych dodatkowych badaniach zaobserwowaliśmy, że wydajność transdukcji wektorów różnych serotypów AAV może zostać znacząco zwiększona poprzez mutagezę celowaną reszt tyrozyny wyeksponowanych na powierzchni kapsydów wirusowych6-14. Ponieważ 6 z 7 tyrozyn wyeksponowanych na powierzchni jest również konserwatywnych w AAV3, przeprowadziliśmy mutagezę celowaną tych reszt i zaobserwowaliśmy, że wydajność transdukcji mutantów tyrozynowych wektorów AAV3 jest znacznie wyższa w ludzkich komórkach raka wątroby (dane niepublikowane). Obecnie trwają również badania nad oceną bezpieczeństwa i skuteczności mutantów tyrozynowych wektorów AAV3 w mysich modelach ksenograftów hepatoblastomy i raka wątrobowokomórkowego człowieka; w przypadku sukcesu, optymalne mutanty tyrozynowe wektorów serotypu AAV3 mogą okazać się użyteczne w celowaniu w ludzkie nowotwory wątroby w ramach potencjalnej terapii genowej.
Oświadczenia
Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.
Podziękowania
Dziękujemy dr. R. Jude Samulskiemu i dr. Xiao Xiao za uprzejme przekazanie odpowiednio plazmidów rekombinowanego AAV3 oraz AAV-EGFP, a także dr Gail Tomlinson za hojne udostępnienie linii komórkowych Hep293TT. Badania te były częściowo finansowane z grantów Public Health Service R01 HL-076901, R01 HL-097088 oraz P01 DK-058327 (Projekt 1) przyznanych przez National Institutes of Health (dla AS).
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| DMEM | Cellgro | 10-0170CM | |
| PEI | Polysciences, Inc. | 23966 | |
| Benzonaza | Novagen, EMD Millipore | 70664-3 | |
| Kolumna HiTrap Q HP | GE Healthcare | 17-1154-01 | |
| DNA z plemni łososia | Fisher Scientific | NC9753983 | |
| Gradient iodiksanolu | OptiPrep | 1114542 | |
| Kolumny G-50 | GE Healthcare | 27-5330-01 |
Bibliografia
- Zincarelli, C., Soltys, S., Rengo, G., Rabinowitz, J. E. Analysis of AAV serotypes 1-9 mediated gene expression and tropism in mice after systemic injection. Mol Ther. 16, 1073-1080 (2008).
- Glushakova, L. G., Lisankie, M. J., Eruslanov, E. B., Ojano-Dirain, C., Zolotukhin, I., Liu, C., Srivastava, A., Stacpoole, P. W. AAV3-mediated transfer and expression of the pyruvate dehydrogenase E1 alpha subunit gene causes metabolic remodeling and apoptosis of human liver cancer cells. Mol Genet & Metabol. 98, 289-299 (2009).
- Ling, C., Lu, Y., Kalsi, J. K., Jayandharan, G. R., Li, B., Ma, W., Cheng, B., Gee, S. W., McGoogan, K. E., Govindasamy, L., Zhong, L., Agbandje-McKenna, M., Srivastava, A. Human hepatocyte growth factor receptor is a cellular coreceptor for adeno-associated virus serotype 3. Hum Gene Ther. 21, 1741-1747 (2010).
- Chen, T. T., Rakheja, D., Hung, J. Y., Hornsby, P. J., Tabaczewski, P., Malogolowkin, M., Feusner, J., Miskevich, F., Schultz, R., Tomlinson, G. E. Establishment and characterization of a cancer cell line derived from an aggressive childhood liver tumor. Pediatr Blood & Cancer. 53, 1040-1047 (2009).
- Daya, S., Berns, K. I. Gene therapy using adeno-associated virus vectors. Clin Microbiol Rev. 21, 583-593 (2008).
- Zhong, L., Li, B., Mah, C. S., Govindasamy, L., Agbandje-McKenna, M., Cooper, M., Herzog, R. W., Zolotukhin, I., Warrington, K. H. Jr, Weigel-Van Aken, K. A., Hobbs, J. A., Zolotukhin, S., Muzyczka, N., Srivastava, A. Next generation of adeno-associated virus 2 vectors: point mutations in tyrosines lead to high-efficiency transduction at lower doses. Proc Natl Acad Sci USA. 105, 7827-7832 (2008).
- Petrs-Silva, H., Dinculescu, A., Li, Q., Min, S. H., Chiodo, V., Pang, J. J., Zhong, L., Zolotukhin, S., Srivastava, A., Lewin, A. S., Hauswirth, W. W. High-efficiency transduction of the mouse retina by tyrosine-mutant AAV serotype vectors. Mol Ther. 17, 463-471 (2009).
- Jayandharan, G. R., Zhong, L., Sack, B. K., Rivers, A. E., Li, M., Li, B., Herzog, R. W., Srivastava, A. Optimized adeno-associated virus (AAV)-protein phosphatase-5 helper viruses for efficient liver transduction by single-stranded AAV vectors: therapeutic expression of factor IX at reduced vector doses. Hum. Gene Ther. 21, 271-283 (2010).
- Li, M., Jayandharan, G. R., Li, B., Ling, C., Ma, W., Srivastava, A., Zhong, L. High-efficiency transduction of fibroblasts and mesenchymal stem cells by tyrosine-mutant AAV2 vectors for their potential use in cellular therapy. Hum Gene Ther. 21, 1527-1543 (2010).
- Kauss, M. A., Smith, L. J., Zhong, L., Srivastava, A., Wong, K. K. J. r, Chatterjee, S. Enhanced long-term transduction and multilineage engraftment of human hematopoietic stem cells transduced with tyrosine-modified recombinant adeno-associated virus serotype 2. Hum Gene Ther. 21, 1129-1136 (2010).
- Qiao, C., Zhang, W., Yuan, Z., Shin, J. H., Li, J., Jayandharan, G. R., Zhong, L., Srivastava, A., Xiao, X., Duan, D. Adeno-associated virus serotype 6 capsid tyrosine-to-phenylalanine mutations improve gene transfer to skeletal muscle. Hum Gene Ther. 21, 1343-1348 (2010).
- Markusic, D. M., Herzog, R. W., Aslanidi, G. V., Hoffman, B. E., Li, B., Li, M., Jayandharan, G. R., Ling, C., Zolotukhin, I., Ma, W., Zolotukhin, S., Srivastava, A., Zhong, L. High-efficiency transduction and correction of murine hemophilia B using AAV2 vectors devoid of multiple surface-exposed tyrosines. Mol Ther. 18, 2048-2056 (2010).
- Ojano-Dirain, C., Glushakova, L. G., Zhong, L., Zolotukhin, S., Muzyczka, N., Srivastava, A., Stacpoole, P. W. An animal model of PDH deficiency using AAV8-siRNA vector-mediated knockdown of pyruvate dehydrogenase E1α. Mol Genet & Metabol. 101, 183-191 (2010).
- Petrs-Silva, H., Dinculescu, A., Li, Q., Deng, W. T., Pang, J. J., Min, S. H., Chiodo, V., Neeley, A. W., Govindasamy, L., Bennett, A., Agbandje-McKenna, M. Novel properties of tyrosine-mutant AAV2 vectors in the mouse retina. Mol Ther. , Forthcoming (2011).
Przedruki i uprawnienia
