W tym filmie prezentujemy technikę soft lithography z wykorzystaniem polidimetylosiloksanu (PDMS), której używamy do wykonania urządzenia mikroprzepływowego do hodowli neuronów.
Artykuł metodologiczny
Wytwarzanie urządzenia mikroprzepływowego do kompartymentacji somy i aksonów neuronów
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
W tym filmie prezentujemy technikę miękkiej litografii z wykorzystaniem polidimetylosiloksanu (PDMS), której używamy do wytwarzania urządzenia mikrofluidycznego do hodowli neuronów. Wcześniej, na waflu krzemowym, za pomocą SU-8 i fotolitografii naniesiono wzór urządzenia mikrofluidycznego do neuronów, aby stworzyć formę główną, którą nazywamy po prostu „masterem”. Następnie wylewamy polimer krzemowy PDMS na master, który jest następnie utwardzany poprzez podgrzanie PDMS do 80°C przez 1 godzinę. PDMS tworzy negatywową formę urządzenia. Następnie PDMS jest ostrożnie wycinany i oddzielany od mastera. W miejscach, gdzie znajdować się będą zbiorniki, wykonuje się otwory, a nadmiar PDMS jest odcinany od urządzenia. Do usunięcia wszelkich zanieczyszczeń z urządzenia używa się azotu. Na tym etapie urządzenia są już gotowe do użycia i mogą zostać trwale połączone z szkiełkiem podstawowym Corning No. 1 za pomocą sterylizatora/czyścika plazmowego lub mogą zostać odwracalnie połączone ze szkiełkiem poprzez zwykłe umieszczenie urządzenia na jego powierzchni. Odwracalne łączenie urządzenia ze szkłem jest omówione w osobnym filmie i wymaga uprzedniej sterylizacji urządzenia 70% etanolem lub w autoklawie. Traktowanie plazmą sterylizuje urządzenia, więc dalsza obróbka nie jest konieczna. Ważne jest jednak, aby podczas traktowania urządzeń plazmą dodać do nich ciecz w ciągu 10 minut od zabiegu, gdy powierzchnie są jeszcze hydrofilowe. Odczekanie dłużej niż 10 minut przed dodaniem cieczy utrudnia jej wprowadzenie do urządzenia. Urządzenia do neuronów są zazwyczaj łączone ze szkiełkiem podstawowym za pomocą plazmy, a następnie do urządzenia natychmiast dodaje się 0,5 mg/ml poli-L-lizyny (PLL) w buforze boratowym o pH 8.5. Po inkubacji z PLL przez minimum 3 godziny, urządzenia są płukane wodą dH2O co najmniej 3 razy, z odstępem co najmniej 15 minut między każdym płukaniem. Następnie wodę usuwa się i dodaje do urządzenia świeże medium. W tym momencie urządzenie jest gotowe do użycia. Należy pamiętać, aby od tego momentu nigdy nie usuwać całego medium z urządzenia. W kanale głównym zawsze powinno pozostać medium.
Protokół
Część 1: Przygotowanie mikroprzepływowego urządzenia neuronowego
- A Do odlewania formy mikroprzepływowej z polidimetylosiloksanu (PDMS) wykorzystuje się 3-calowy wafel krzemowy z wzorem wykonanym z SU-8 metodą fotolitografii. Wafel krzemowy z wzorem z SU-8 określamy mianem form matryc lub „matryc”.
- PDMS miesza się z utwardzaczem w stosunku masowym 10:1, co oznacza, że do 10 gramów PDMS dodaje się 1 gram utwardzacza.
- Następnie PDMS należy dokładnie wymieszać i wylać na wafel krzemowy. Wafle krzemowe znajdują się w polistyrenowej płytce Petriego o średnicy 10 cm. Do pokrycia matrycy warstwą o grubości około 4 mm potrzeba od 12 g do 15 g PDMS.
- Matrycę z PDMS umieszcza się następnie w deskrykatorze próżniowym z otwartą pokrywą szalki Petriego, a następnie przykłada próżnię. Czynność tę wykonuje się w celu usunięcia z PDMS pęcherzyków powietrza, które powstały podczas mieszania z utwardzaczem. Usunięcie pęcherzyków powietrza zajmuje około 15 minut.
- Matryca z PDMS zostaje wyjęta z eksykatora. W celu usunięcia pozostałych pęcherzyków powietrza używa się pistoletu pneumatycznego z filtrem 0,45 μm.
- Następnie matrycę umieszcza się na płycie grzejnej o temperaturze 80°C na 1 godzinę w celu utwardzenia.
Uwaga: Jeśli eksykator próżniowy jest niedostępny, mieszaninę główną można pozostawić w temperaturze pokojowej przez kilka godzin. Pęcherzyki powietrza z czasem znikną samoistnie. Jeśli płyta grzewcza jest niedostępna, PDMS utwardzi się w temperaturze pokojowej po 24 godzinach.
Uwaga: Ważne jest również upewnienie się, że matryca znajduje się w poziomie podczas procesu utwardzania.
Część 2: Wycinanie mikrofluidycznego urządzenia neuronowego
- Po utwardzeniu PDMS na matrycy, przenosi się go do komory z czystym powietrzem.
- Za pomocą skalpela wycina się okrąg wokół obrysu urządzeń. Podczas wprowadzania ostrza w PDMS ważne jest, aby stykało się ono z wafla krzemowym, ale NIE wywierać zbyt dużego nacisku na wafelek, aby nie doprowadzić do pęknięcia matrycy.
- Po wycięciu okręgu wokół urządzeń (na każdym 3" krzemowym wafelku matrycy znajdują się 4 urządzenia), PDMS ostrożnie oddziela się od matrycy. Można to rozpocząć od delikatnego obracania skalpela po wprowadzeniu go w miejsce wcześniejszego nacięcia.
- Następnie w urządzeniu wycina się otwory na zbiorniki, używając wycinaka do biopsji tkanek o średnicy 8 mm.
- Urządzenia są następnie dzielone na cztery części, a nadmiar PDMS jest przycinany tak, aby urządzenie idealnie pasowało do szkła okrywnego Corning (Nr 1) 24 mm x 40 mm. Do usunięcia resztek zanieczyszczeń używa się strumienia azotu. Uporczywe zanieczyszczenia można usunąć za pomocą winylowej taśmy 3M Scotch Brand 471.
Część 3: Bondowanie plazmowe urządzeń do szklanych kryształów.
- Oczyszczacz plazmowy firmy Harrick jest używany do łączenia urządzeń neuronowych z szkiełkami przedmiotowymi. W skrócie, urządzenia umieszcza się w oczyszczaczu plazmowym, a następnie za pomocą pompy próżniowej usuwa się powietrze z komory.
- Po osiągnięciu ciśnienia próżni na poziomie 300 milliTorr, uruchamia się cewkę elektryczną, ustawiając ją na wysoką moc.
- Cewka elektryczna wytwarza plazmę, czyli „częściowo zjonizowany gaz składający się z elektronów, jonów oraz neutralnych atomów lub cząsteczek” - http://www.harrickplasma.com/plasma_physics.php, z pozostałych w komorze cząsteczek powietrza. Plazma tworzy gatunki reaktywne na powierzchniach szkła i urządzenia, które po zetknięciu utworzą trwałe wiązanie. Plazma czyni również powierzchnie hydrofilowymi, co ułatwia wprowadzanie cieczy. Dodatkowo oczyszczacz plazmowy sterylizuje urządzenia.
Powierzchnia urządzenia PDMS zawierającego układ mikroprzepływowy jest umieszczana stroną górną do góry w oczyszczaczu plazmowym wraz ze szkiełkami szklanymi.
Wykutrowane plazmowo powierzchnie szkła i urządzenia mikroprzepływowego są łączone w kontakcie ze sobą w komorze z laminarnym przepływem powietrza, a następnie umieszczane w sterylnych szalkach o średnicy 60 mm. Przetraktowane powierzchnie tworzą szczelne, nieodwracalne wiązanie. - W ciągu 10 minut od połączenia urządzeń ze szkłem za pomocą plazmy, do urządzenia dodaje się poli-L-lizynę (PLL). Po 10 minutach hydrofilowość urządzenia spadnie, co utrudni wnikanie PLL do wnętrza urządzenia.
Uwaga: Ważne jest sprawdzenie urządzenia pod kątem pęcherzyków powietrza po dodaniu PLL. Pęcherzyki powietrza w głównym kanale są niewskazane, ponieważ mogłyby utlenić komórki. Prosta metoda usuwania istniejących pęcherzyków powietrza polega na użyciu pipety P200 wypełnionej 150 ul cieczy (w tym przypadku PLL), umieszczeniu końcówki bezpośrednio przy wlocie do głównego kanału i gwałtownym naciśnięciu tłoka pipety P200. Może to wymagać kilkukrotnego powtórzenia, ale ostatecznie siła z pipety wypchnie pęcherzyki na zewnątrz. - Urządzenia zawierające PLL inkubuje się przez noc w standardowym inkubatorze do hodowli tkanek w temperaturze 37°C przy 5% CO2.
- Następnego dnia urządzenia płucze się szybko dwukrotnie autoklawowaną dH2O. Podczas tego procesu ciecz nie jest całkowicie usuwana z głównych kanałów, a jedynie z rezerwuarów. Usunięcie cieczy z głównych kanałów spowoduje wprowadzenie pęcherzyków powietrza. Po dwóch szybkich płukaniach urządzenia wypełnia się autoklawowaną dH2O i ponownie umieszcza w inkubatorze na minimum 3 godziny lub przez noc.
- Następnego dnia urządzenia ponownie płucze się szybko 2 razy autoklawowaną dH2O. Następnie do urządzeń dodaje się podstawową pożywkę dla neuronów, zawierającą niezbędne suplementy B27 i glutamax do hodowli pierwotnych neuronów szczura. Urządzenia umieszcza się z powrotem w inkubatorze do późniejszego użycia. Urządzenia są teraz gotowe do wysiewu neuronów.
Dyskusja
W tym filmie zademonstrowaliśmy sposób wykonania i przygotowania mikrofluidycznego urządzenia z PDMS, którego używamy do hodowli neuronów. Urządzenie to pozwala na uzyskanie czystej frakcji aksonalnej oddzielonej mikrowrowCountami od komory zawierającej mieszaninę ciał komórkowych, dendrytów i aksonów. Urządzenia te umożliwiają badaczowi analizę wpływu różnych zabiegów, a także stanowią platformę do wywoływania fizycznych uszkodzeń aksonów i obserwacji efektów, jakie te zabiegi wywierają na neurony. Urządzenie zapewnia również poziom uporządkowania hodowli neuronów, który ułatwia badania transportu. Ponadto mikrowrowCounty oddzielające komorę hodowli komórkowej od komory aksonalnej zapewniają izolację fluidyczną między obiema komorami, co umożliwia traktowanie jednej strony urządzenia bez bezpośredniego oddziaływania preparatu na drugą stronę. Właściwość ta pozwala badaczowi na analizę takich efektów jak transdukcja sygnału i transport wynikające z zastosowanego zabiegu.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze | |
|---|---|---|---|---|
| PDMS | Odczynnik | Dow Corning | Sylgard 184 z utwardzaczem. Prosimy skontaktować się z firmą Dow Corning w celu znalezienia najbliższego dostawcy | |
| Oczyszczacz plazmowy | Narzędzie | Harrick Scientific Products, Inc. | http://www.harrickplasma.com/ | |
| Neural Basal Media | Odczynnik | Invitrogen | 21103-049 | Neural Basal Media jest dostarczane przez firmę Invitrogen w ramach linii odczynników do hodowli komórkowych Gibco. |
| B27 | Odczynnik | Invitrogen | 17504-044 | B27 jest zastrzeżoną suplementacją dostępną poprzez firmę Invitrogen w ramach linii odczynników do hodowli komórkowych Gibco. |
| Glutamax | Odczynnik | Invitrogen | 35050-061 | Glutamax jest dostępny poprzez firmę Invitrogen w ramach linii odczynników do hodowli komórkowych Gibco. |
| Szkiełko nakładkowe Corning No. 1 | szkiełko nakładkowe | Corning | Corning No. X2935 244 | Dostępne poprzez Fisher Scientific, numer katalogowy Fish 12-531D |
| Szalka Petriego 60 mm | Narzędzie | Fisher Scientific | 08-757-13A | Sterylne polistyrenowe szalki Petriego o średnicy 60 mm służą do przechowywania urządzenia przytwierdzonego do szkła. |
| Probówka BD Falcon 50 ml | Narzędzie | BD Biosciences | Falcon No. 352098 | Dostępna poprzez Fisher Scientific, numer katalogowy 14-959-49A |
| Probówka BD Falcon 15 ml | Narzędzie | BD Biosciences | Falcon No. 352097 | Dostępna poprzez Fisher Scientific, numer katalogowy 14-959-70C |
| Poly-L-Lysine | Odczynnik | Sigma-Aldrich | P-1274 | |
| Nowy element |
Bibliografia
- Park, J. W., Vahidi, B., , A. M., Rhee, S. W., Jeon, N. L. Microfluidic culture platform for neuroscience research. Nat Protoc. 1, 2128-2136 (2006).
- Taylor, A. M., Blurton-Jones, M., Rhee, S. W., Cribbs, D. H., Cotman, C. W., Jeon, N. L. A microfluidic culture platform for CNS axonal injury, regeneration and transport. Nat Methods. 2, 599-605 (2005).
Przedruki i uprawnienia
