Wytwarzanie urządzenia mikroprzepływowego do podziału somy neuronów i aksonów

Podsumowanie

W tym filmie demonstrujemy technikę miękkiej litografii z polidimetylosiloksanem (PDMS), której używamy do farbowania urządzenia mikroprzepływowego do hodowli neuronów.

Streszczenie

W tym filmie demonstrujemy technikę miękkiej litografii z polidimetylosiloksanem (PDMS), której używamy do produkcji urządzenia mikroprzepływowego do hodowli neuronów. Wcześniej wafel krzemowy był wzorowany na projekcie urządzenia mikroprzepływowego neuronu przy użyciu SU-8 i fotolitografii w celu stworzenia formy wzorcowej lub tego, co po prostu nazywamy "mistrzem". Następnie wylewamy polimer krzemowy PDMS na wierzch wzorca, który jest następnie utwardzany przez podgrzanie PDMS do 80°C przez 1 godzinę. PDMS tworzy ujemną formę urządzenia. PDMS jest następnie ostrożnie cięty i odnoszony od wzorca. W miejscach, w których będą znajdować się zbiorniki, wykrawane są otwory, a nadmiar PDMS jest odcinany od urządzenia. Azot służy do zdmuchiwania nadmiaru zanieczyszczeń z urządzenia. W tym momencie urządzenia są teraz gotowe do użycia i mogą być albo połączone ze szkłem nakrywkowym corning nr 1 za pomocą sterylizatora/środka czyszczącego plazmowego, albo mogą być odwracalnie związane ze szkłem nakrywkowym, po prostu umieszczając urządzenie na wierzchu szkła nakrywkowego. Odwracalne połączenie urządzenia ze szkłem jest omówione w osobnym filmie i wymaga najpierw sterylizacji urządzenia przy użyciu 70% etanolu lub autoklawowania. Obróbka plazmowa sterylizuje urządzenia, więc nie jest konieczna dalsza obróbka. Ważne jest jednak, aby podczas obróbki plazmowej urządzeń dodać płyn do urządzeń w ciągu 10 minut od obróbki plazmowej, gdy powierzchnie są jeszcze hydrofilowe. Oczekiwanie dłużej niż 10 minut na dodanie płynu do urządzenia utrudnia przedostanie się płynu do urządzenia. Urządzenia neuronowe są zazwyczaj związane z osoczem ze szkłem pokryciowym, a 0,5 mg/ml poli-L-lizyny (PLL) w buforze boranowym o pH 8,5 jest natychmiast dodawane do urządzenia. Po minimum 3 godzinach inkubacji z PLL, urządzenia myje się wodą dH2O co najmniej 3 razy z zachowaniem co najmniej 15 minut między każdym myciem. Następnie woda jest usuwana, a do urządzenia dodawane są świeże media. W tym momencie urządzenie jest gotowe do użycia. W tym momencie należy pamiętać, aby nigdy nie usuwać wszystkich multimediów z urządzenia. Zawsze zostawiaj multimedia w głównym kanale.

Protokół

Część 1: Przygotowanie urządzenia neuronów mikroprzepływowych

1. 3-calowa płytka krzemowa z wzorem wykonanym z SU-8 metodą fotolitografii służy do odlewania formy mikroprzepływowej z polidimetylosiloksanu (PDMS). Wzorzysty wafel krzemowy SU-8 nazywamy formami wzorcowymi lub "mistrzami".
2. PDMS miesza się z utwardzaczem w stosunku w/w 10:1, czyli na 10 gramów PDMS dodaje się do niego 1 gram utwardzacza.
3. PDMS jest następnie dobrze mieszany i wylewany na płytkę krzemową. Płytka krzemowa znajduje się w 10 cm polistyrenowej szalce Petriego. Potrzeba około 12 g do 15 g PDMS, aby pokryć wzorzec o grubości około 4 mm.
4. Wzorzec z PDMS jest następnie umieszczany w eksykatorze próżniowym z pokrywką zdjętą z szalki Petriego i stosuje się próżnię. Ma to na celu usunięcie pęcherzyków powietrza z PDMS, które zostały wprowadzone podczas mieszania utwardzacza.  Usunięcie pęcherzyków powietrza zajmuje około 15 minut.
5. Urządzenie nadrzędne z PDMS jest wyjmowane z eksykatora. Pistolet pneumatyczny z filtrem 0,45 um służy do usuwania wszelkich pozostałych pęcherzyków.
6. Mistrz jest następnie umieszczany na płycie grzejnej o temperaturze 80°C na 1 godzinę w celu utwardzenia.

Uwaga: Jeśli eksykator próżniowy nie jest dostępny, urządzenie główne można pozostawić w temperaturze pokojowej na kilka godzin. Pęcherzyki powietrza w końcu same się rozproszą . Jeśli płyta grzejna nie jest dostępna, PDMS utwardzi się w temperaturze pokojowej po 24 godzinach.

Uwaga: Ważne jest również, aby upewnić się, że wzorzec jest wypoziomowany podczas procesu utwardzania.

Część 2: Wyłączanie urządzenia mikroprzepływowego neuronu

1. Po utwardzeniu PDMS na urządzeniu głównym przenosi się go do czystego okapu.
2. Za pomocą ostrza chirurgicznego wycina się okrąg na obwodzie urządzeń. Po włożeniu ostrza do PDMS ważne jest, aby nawiązać kontakt z płytką krzemową, ale NIE wywierać zbyt dużego nacisku na płytkę, w przeciwnym razie mistrz pęknie.
3. Z okręgiem wyciętym dookoła urządzeń (na każdy 3-calowy Silicon Master przypadają 4 urządzenia), PDMS jest ostrożnie zdejmowany z urządzenia. Można to rozpocząć, delikatnie przekręcając ostrze chirurgiczne podczas jego wkładania do poprzedniego cięcia.
4. Następnie zbiorniki są wbijane do urządzenia za pomocą stempla do biopsji tkanek o średnicy 8 mm.
5. Urządzenia są następnie ćwiartowane, a nadmiar PDMS przycinany, tak aby urządzenie idealnie pasowało do szkła osłonowego Corning (nr 1) 24 mm x 40 mm. Powietrze azotowe służy do zdmuchiwania nadmiaru zanieczyszczeń. Uporczywe zanieczyszczenia można również usunąć za pomocą taśmy winylowej 3M Scotch Brand 471.

Część 3: Plazmowe łączenie urządzeń ze szkiełkami nakrywkowymi.

1. Plasma Cleaner służy do łączenia urządzeń neuronowych A Harrick z szkiełkami nakrywkowymi. Krótko mówiąc, urządzenia umieszcza się w myjce plazmowej, a do odprowadzania powietrza z komory służy pompa próżniowa.
2. Gdy podciśnienie osiągnie 300 militorów, cewka elektryczna jest włączana i ustawiana na wysoką wartość.
3. Cewka elektryczna tworzy plazmę, "częściowo zjonizowany gaz składający się z elektronów, jonów i neutralnych atomów lub cząsteczek" - http://www.harrickplasma.com/plasma_physics.php, z pozostałych cząsteczek powietrza pozostawionych w komorze. Plazma tworzy na powierzchni szkła i urządzenia reaktywne formy, które po umieszczeniu razem utworzą trwałe połączenie. Plazma zmienia również powierzchnie w hydrofilowe, co ułatwia dodawanie cieczy. Dodatkowo myjka plazmowa sterylizuje urządzenia.
   
   Powierzchnia urządzenia PDMS, która zawiera urządzenie mikroprzepływowe, jest umieszczana stroną do góry w myjce plazmowej wraz ze szklanymi szkiełkami.
   
   Powierzchnie szkła i urządzenia mikroprzepływowego poddane obróbce plazmowej są montowane w kontakcie ze sobą na czystym stole, Następnie umieszcza się w sterylnych naczyniach o średnicy 60 mm. Obrobione powierzchnie tworzą ścisłe, nieodwracalne połączenie.
   
4. W ciągu 10 minut od plazmowego połączenia urządzeń ze szkłem, do urządzenia dodawana jest poli-L-lizyna (PLL). Po 10 minutach hydrofilowość urządzenia zmniejszy się, co utrudni PLL wejście do urządzenia.
   
   Uwaga: Ważne jest, aby po dodaniu PLL sprawdzić, czy w urządzeniu nie ma pęcherzyków powietrza. Pęcherzyki powietrza w głównym kanale są niepożądane, ponieważ utleniają komórki. Łatwą metodą usunięcia wszelkich istniejących pęcherzyków powietrza jest użycie pipety P200 wypełnionej 150 ul płynu (w tym przypadku PLL), umieszczenie końcówki bezpośrednio przy otworze głównego kanału i mocne wciśnięcie P200. Może być konieczne powtórzenie tego kilka razy, ale w końcu siła z pipety wypchnie pęcherzyki.
   
   
5. Wyroby zawierające PLL pozostawia się do inkubacji przez noc w standardowym inkubatorze do hodowli tkankowych w temperaturze 37°C z 5%_CO2.
6. Następnego dnia urządzenia są dwukrotnie szybko płukane autoklawizowanym dH2O. Podczas tego procesu ciecz nigdy nie jest całkowicie usuwana z głównych kanałów, tylko ze zbiorników. Usunięcie cieczy z głównych kanałów wprowadzi bąbelki. Po 2 szybkich płukaniach urządzenia są napełniane autoklawowanym dH2O i umieszczane z powrotem w inkubatorze na co najmniej 3 godziny lub na noc.
7. Następnego dnia urządzenia są ponownie płukane 2 razy szybko autoklawowanym dH2O. Następnie do urządzeń dodaje się neuronalne podłoża podstawowe, zawierające niezbędne suplementy B27 i glutamax do hodowli pierwotnych neuronów szczura. Urządzenia są umieszczane z powrotem w inkubatorze w celu wykorzystania w przyszłości. Urządzenia są teraz gotowe do zasiewania neuronów.

Dyskusja

W tym filmie pokazaliśmy, jak wykonać i przygotować urządzenie mikroprzepływowe PDMS, którego używamy do hodowli neuronów. Urządzenie pozwala na uzyskanie czystej frakcji aksonalnej oddzielonej mikrorowkami od komory zawierającej mieszankę ciał komórkowych, dendrytów i aksonów. Urządzenia te pozwalają badaczowi badać efekty różnych zabiegów, a także stanowią platformę do przeprowadzania fizycznych urazów aksonów i obserwowania, jaki wpływ mają te zabiegi na neurony. Urządzenie zapewnia również poziom uporządkowania hodowli neuronów, który ułatwia badania nad transportem. Ponadto mikrorowki, które oddzielają komorę hodowli komórkowej od komory aksonowej, pozwalają na płynną izolację między dwoma komorami, co umożliwia leczenie jednej strony urządzenia bez bezpośredniego wpływu leczenia na drugą stronę urządzenia. Ta właściwość pozwala badaczowi badać efekty, takie jak transdukcja i transport sygnału, które wynikają z zabiegu.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Odczynnik PDMS		Dow Corning		Sylgard 184 ze środkiem utwardzającySkonsultuj się z Dow Corning, aby znaleźć sprzedawcę w pobliżu
Plasam	Cleaner Tool	Harrick Scientific Products, Inc.		http://www.harrickplasma.com/
neuronalnych podłoży bazowych	Invitrogen	21103-049	Odczynnik do hodowli podstawowych neuronów jest otrzymywany przez firmę Invitrogen w ramach linii odczynników do hodowli komórkowych Gibco.
Odczynnik B27		Invitrogen	17504-044	B27 to zastrzeżony suplement dostępny za pośrednictwem Invitrogen w ramach linii odczynników do hodowli komórkowych Gibco.
Odczynnik Glutamax		Invitrogen	35050-061	Glutamax jest dostępny w Invitrogen w ramach linii odczynników do hodowli komórkowych Gibco.
Cornig No. 1 Cover Glass Szkło	osłonowe	Corning	Corning No. X2935 244	Dostępne za pośrednictwem Fisher Scientific, Fish Nr katalogowy 12-531D
60 mm Szalka Petriego		Fisher Scientific	08-757-13A	Sterylne szalki Petriego z polistyrenu o średnicy 60 mm służą do umieszczenia urządzenia przymocowanego do szkła.
BD Falcon 50 ml Probówka		BD Biosciences	Falcon nr 352098	Dostępne w Fisher Scientific numer katalogowy 14-959-49A
Probówka BD Falcon 15 ml	Narzędzie	BD Biosciences	Falcon nr 352097	Dostępne w Fisher Scientific numer katalogowy 14-959-70C
Odczynnik poli-L-lizynowy		Sigma-Aldrich	P-1274
Nowy przedmiot