Niniejszy protokół przedstawia sposób wstecznego znakowania komórek zwojowych siatkówki oraz późniejsze wywołanie urazu poprzez zmiażdżenie nerwu wzrokowego w celu analizy przeżywalności i apoptozy komórek zwojowych siatkówki. Jest to eksperymentalny model choroby dla różnych typów neuropatii nerwu wzrokowego, w tym jaskry.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Mysi model urazu zmiażdżeniowego nerwu wzrokowego do badania przeżywalności komórek zwojowych siatkówki
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Uszkodzenie nerwu wzrokowego może prowadzić do degeneracji aksonalnej, a następnie do stopniowego obumierania komórek zwojowych siatkówki (RGCs), co skutkuje nieodwracalną utratą wzroku. Przykładami takich schorzeń u ludzi są urazowa neuropatia wzrokowa oraz degeneracja nerwu wzrokowego w jaskrze. Charakteryzuje się ona typowymi zmianami w głowie nerwu wzrokowego, postępującą degeneracją nerwu wzrokowego oraz utratą komórek zwojowych siatkówki, co w przypadku braku kontroli prowadzi do utraty wzroku i ślepoty.
Myszie model uszkodzenia poprzez zmiażdżenie nerwu wzrokowego (ONC) jest istotnym eksperymentalnym modelem choroby w badaniach nad urazową neuropatią wzrokową, jaskrą i innymi schorzeniami. W tym modelu zmiażdżenie nerwu wzrokowego prowadzi do stopniowej apoptozy komórek zwojowych siatkówki. Model ten może być wykorzystywany do badania ogólnych procesów i mechanizmów śmierci oraz przeżycia neuronów, co jest kluczowe dla opracowania metod terapeutycznych. Ponadto w modelu tym można stosować podejścia farmakologiczne i molekularne w celu identyfikacji i testowania potencjalnych odczynników terapeutycznych do leczenia różnych typów neuropatii wzrokowej.
W niniejszym materiale przedstawiamy szczegółową instrukcję krok po kroku dotyczącą: (I) Bazowego znakowania wstecznego komórek zwojowych siatkówki (RGCs) w 1. dniu, (II) Zmiażdżenia nerwu wzrokowego w 4. dniu, (III) Pobrania siatkówek i analizy przeżywalności RGC w 11. dniu oraz (IV) Reprezentatywnych wyników.
Protokół
Wszystkie użyte urządzenia i odczynniki są sterylne. Wszystkie eksperymenty na zwierzętach zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki i Wykorzystania Zwierząt (ACUC) w NEI/NIH (protokół badania na zwierzętach NEI-570) i były prowadzone zgodnie z wytycznymi i przepisami NIH.
1. Wyjściowe znakowanie retrogradne komórek zwojowych siatkówki (RGCs) w 1. dniu
Celem niniejszej procedury jest wsteczne znakowanie komórek zwojowych siatkówki poprzez wstrzyknięcie barwnika śledzącego neurony do wzgórza górnego myszy na trzy dni przed uszkodzeniem nerwu wzrokowego metodą zmiażdżenia. Barwnik zostanie pobrany wstecznie przez komórki zwojowe siatkówki, stanowiąc marker dla żywych RGC (Rysunek 1). Podejście to pozwala na powtarzalne znakowanie żywotnych RGC przy niewielkiej zmienności 1-5.
- Głęboko znieczul mysz. Usuń owłosienie z górnej części głowy. Umieść mysz w małym aparacie stereotaktycznym. Na oba oczy nałóż maść ochronną. Zdezynfekuj skórę głowy trzykrotnie, stosując jodofor oraz przemywanie 70% alkoholem.
- Wykonaj nacięcie skóry, aby odsłonić czaszkę; utrzymuj ją w czystości i suchości, używając 3% nadtlenku wodoru.
- Zidentyfikuj i zaznacz bregma. Wywierć otwór nad wzgórkiem górnym, w odległości 2,9 mm za bregma i 0,5 mm bocznie od linii środkowej każdej półkuli7. Podczas wiercenia aplikuj sól fizjologiczną w miejscu wiercenia otworu, aby zapobiec wtórnym uszkodzeniom termicznym.
- Używając urządzenia pomiarowego stereotaktycznego i strzykawki Hamiltona, bardzo powoli wstrzyknij barwnik do śledzenia neuronów FluoroGold (1 μl 3% fluorochromu w soli fizjologicznej) do wzgórka górnego każdej półkuli na głębokość 1,6 mm od kostnej powierzchni mózgu.
- Zszyj miejsce nacięcia. Podaj podskórnie buprenorfinę w celu zapewnienia analgezji.
- Przenieś mysz w ciepłe i suche miejsce i monitoruj ją do momentu, aż będzie w stanie utrzymać pionową postawę, a następnie zwróć ją do klatki macierzystej. Przez pierwsze trzy dni po procedurze znakowania dwa razy dziennie podawaj ogólnoustrojowe leki przeciwbólowe (np. buprenorfinę) oraz miejscową maść antybiotykową, uważnie monitorując stan myszy.
2. Zmiażdżenie nerwu wzrokowego w 4. dniu
W tej procedurze zastosujemy uraz zmiażdżeniowy nerwu wzrokowego, aby wywołać pierwotne uszkodzenie aksonów (Rycina 2), co doprowadzi do stopniowego obumierania komórek zwojowych siatkówki.
- Trzy dni po aplikacji barwnika śledzącego mysz poddaje się głębokiej anestezji. Przy użyciu mikroskopu sekcyjnego i nożyczek sprężynowych wykonuje się nacięcie spojówki jednego oka w pozycji odpowiadającej godzinie 4.
- Należy delikatnie odsunąć mięśnie gałki ocznej. Odsłania się biały nerw wzrokowy w miejscu jego wyjścia z gałki ocznej. Należy zachować szczególną ostrożność, aby nie uszkodzić naczyń krwionośnych.
- Przy użyciu pęsety krzyżowej wykonuje się zmiażdżenie nerwu wzrokowego w odległości około 2 mm od gałki ocznej, utrzymując ucisk przez około 3 s. Należy zachować szczególną ostrożność, aby nie uszkodzić tętnicy ocznej, co mogłoby spowodować krwawienie.
- Po zakończeniu procedury zmiażdżenia nacięcie zostaje zaszyte.
- Przed wybudzeniem myszy z anestezji należy podać podskórnie buprenorfinę w celu zapewnienia analgezji.
- Mysz przenosi się w ciepłe i suche miejsce i monitoruje do momentu, aż będzie w stanie utrzymać pionową posturę, a następnie umieszcza się ją z powrotem w klatce. Przez pierwsze trzy dni po procedurze zmiażdżenia dwa razy dziennie podaje się systemowe leki przeciwbólowe (np. buprenorfinę) oraz miejscową maść z antybiotykiem, a stan myszy jest ściśle monitorowany.
3. Pobranie siatkówek i analiza przeżywalności RGC w 11. dniu
Celem niniejszej procedury jest pobranie siatkówki w celu analizy przeżywalności komórek zwojowych siatkówki.
- W 11. dniu (7. dniu po ONC) mysz poddawana jest eutanazji poprzez infuzję CO2 i zwichnięcie szyi.
- Gałki oczne są enukleowane za pomocą pęsety poprzez wywieranie nacisku na oczodół.
- Oczy są utrwalane w 4% roztworze paraformaldehydu przez dwie godziny, a następnie płukane w PBS trzykrotnie. Należy wypreparować siatkówkę. Procedura preparowania siatkówki została wcześniej opublikowana przez JoVE w 2010 roku przez Gustmann, S. et al.6, w związku z czym nie będzie tutaj opisana.
- Obrazy przeżywających komórek zwojowych siatkówki są rejestrowane za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego w określonych obszarach siatkówki, a następnie można obliczyć gęstość komórek zwojowych siatkówki. Reprezentatywny wynik dla komórek zwojowych siatkówki znakowanych fluorescencyjnie, z uszkodzeniem wskutek zmiażdżenia nerwu wzrokowego lub bez niego, przedstawiono na rysunku 3.
4. Reprezentatywne wyniki:
Aby przeanalizować przeżywalność komórek zwojowych siatkówki, siedem dni po urazie zmiażdżeniowym nerwu wzrokowego, siatkówki zostały pobrane, utrwalone, spłaszczone i zamontowane. Obrazy siatkówki wykonano przy użyciu mikroskopu fluorescencyjnego. W porównaniu z nieuszkodzoną, prawidłową siatkówką (lewa, Normal), liczba żywych RGC (zielone, oznakowane retrogradnie barwnikiem neuronalnym FluoroGold wstrzykniętym do wzgórza górnego) jest znacznie niższa w siatkówkach z urazem zmiażdżeniowym nerwu wzrokowego (prawa, ONC) (Rycina 3).
Rysunek 1. Bazowe znakowanie retrogradne komórek zwojowych siatkówki
W celu policzenia żywych komórek zwojowych siatkówki w różnych punktach czasowych po uszkodzeniu nerwu wzrokowego metodą zmiażdżenia, komórki zwojowe siatkówki są znakowane retrogradnie poprzez wstrzyknięcie barwnika śledzącego neurony (kolor zielony) do wzgórka górnego w mózgu na trzy dni przed zmiażdżeniem nerwu wzrokowego (kolor czerwony). Ponieważ aksony komórek zwojowych siatkówki znajdują się we wzgórku górnym, barwnik śledzący zostanie pochłonięty przez RGC w sposób retrogradny, stanowiąc marker dla żywych RGC.
Rysunek 2. Uszkodzenie nerwu wzrokowego metodą zmiażdżenia
W celu analizy przeżywalności komórek zwojowych siatkówki, nerw wzrokowy (czerwony) poddawany jest zmiażdżeniu, aby wywołać pierwotne uszkodzenie aksonów. Prowadzi to do stopniowego obumierania komórek zwojowych siatkówki. Trzy dni po wstrzyknięciu barwnika śledzącego (zielony), mysz zostaje znieczulona. Wykonuje się nacięcie spojówki jednego oka. Mięśnie oczodołu należy odsunąć na bok. Odsłania się nerw wzrokowy w miejscu jego wyjścia z gałki ocznej. Za pomocą pęsety krzyżowej wykonuje się zmiażdżenie nerwu wzrokowego w odległości około 2 mm od gałki ocznej, utrzymując ucisk przez około 3 s.
Rysunek 3. Komórki zwojowe siatkówki znakowane fluorescencyjnie z urazem zmiażdżeniowym nerwu wzrokowego lub bez niego
W celu analizy przeżywalności komórek zwojowych siatkówki, siedem dni po urazie zmiażdżeniowym nerwu wzrokowego, siatkówki zostały pobrane, utrwalone, spłaszczone i zamontowane. Obrazy siatkówki wykonano przy użyciu mikroskopu fluorescencyjnego. W porównaniu z nieuszkodzoną, normalną siatkówką (lewa, Normal), liczba żyjących RGCs (zielone, znakowane retrogradnie barwnikiem FluoroGold wstrzykniętym do wzgórza górnego) była znacznie niższa w siatkówkach z urazem zmiażdżeniowym nerwu wzrokowego (prawa, ONC) (Rysunek 3). Pasek skali: 50 μm
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Mysi model zmiażdżenia nerwu wzrokowego jest użyteczny do badania procesu śmierci i przeżywalności RGC. Model ten jest również często stosowany do badania wpływu różnych odczynników i genów na apoptozę i przeżywalność RGC. Jedną z zalet tego modelu jest wysoki stopień powtarzalności przy minimalnych odchyleniach.
Należy jednak zachować szczególną ostrożność na kilku etapach tego modelu. Po pierwsze, podczas wykonywania zmiażdżenia nerwu wzrokowego kluczowe jest, aby nie używać zbyt dużej siły ...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Nie zgłoszono żadnych konfliktów interesów.
Podziękowania
Nasze badania są wspierane przez Wewnątrzinstytucjonalny Program Badawczy NIH, National Eye Institute.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Aparat stereotaksyczny | ASI Instruments | SAS-4100 | |
| Mikroskop sekcyjny | World Precision Instruments, Inc. | PZMIV-BS | |
| Rękojeść skalpela | Fine Science Tools | 10003-12 | |
| Ostrza skalpela nr 15 | Fine Science Tools | 10015-00 | |
| Mikrowiertło | Fine Science Tools | 18000-17 | |
| Igła chirurgiczna | Fine Science Tools | 12050-03 | |
| Nożyczki sprężynowe | Fine Science Tools | 16144-13 | |
| Pinceta Dumont nr 5 | Fine Science Tools | 11252-50 | |
| Strzykawka Hamiltona | Hamilton Co | 88400 | |
| Gazy chirurgiczne | Office Depot | 674889 | |
| Fluorochrom | Sigma-Aldrich | 39286 | |
| Alkohol | Sigma-Aldrich | 459844 | 70% |
| H2O2 | Sigma-Aldrich | H3410 | 3% |
Bibliografia
- Yoles, E. GM1 reduces injury-induced metabolic deficits and degeneration in the rat optic nerve. Investigative ophthalmology & visual science. 33, 3586-3591 (1992).
- Fisher, J. Vaccination for neuroprotection in the mouse optic nerve: implications for optic neuropathies. J Neurosci. 21, 136-142 (2001).
- Levkovitch-Verbin, H. RGC death in mice after optic nerve crush injury: oxidative stress and neuroprotection. Investigative ophthalmology & visual science. 41, 4169-4174 (2000).
- Li, Y. VEGF-B inhibits apoptosis via VEGFR-1-mediated suppression of the expression of BH3-only protein genes in mice and rats. The Journal of clinical investigation. 118, 913-923 (2008).
- Tang, Z. Survival effect of PDGF-CC rescues neurons from apoptosis in both brain and retina by regulating GSK3beta phosphorylation. The Journal of experimental medicine. 207, 867-880 (2010).
- Gustmann, S., Dunker, N. In vivo-like organotypic murine retinal wholemount culture. J Vis Exp. , (2010).
- Franklin, K., Paxinos, G. The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. , Academic Press. San Diego. (1997).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
