Opisano tutaj protokoły służące do wizualizacji dynamicznego procesu naprawy błony komórkowej zapośredniczonej przez MG53 w całych organizmach oraz na poziomie komórkowym. Metody te mogą być stosowane do badania biologii komórkowej uszczelniania błony plazmatycznej oraz w medycynie regeneracyjnej.
Artykuł metodologiczny
Wizualizacja naprawy błony komórkowej pośredniczonej przez MG53 z wykorzystaniem systemów in vivo i in vitro
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Naprawa ostrych uszkodzeń błony komórkowej jest podstawowym procesem prawidłowej fizjologii komórkowej, a zaburzenia naprawy błony wiąże się z wieloma ludzkimi chorobami degeneracyjnymi. Niedawne odkrycie białka MG53 jako kluczowego elementu mechanizmu uszczelniania błony pozwala na lepsze molekularne zrozumienie podstaw biologii naprawy tkanek, a także na potencjalne zastosowania translacyjne w medycynie regeneracyjnej. W niniejszym materiale szczegółowo opisujemy protokoły eksperymentalne służące do badania funkcji MG53 in vivo w naprawie uszkodzeń mięśni z wykorzystaniem protokołów ćwiczeń na bieżni w modelach mysich, testowania zdolności naprawy błony ex vivo poprzez pomiar wnikania barwnika do izolowanych włókien mięśniowych oraz monitorowania dynamicznego procesu transportu pęcherzykowego i naprawy błony komórkowej zależnej od MG53 w hodowlach komórkowych z wykorzystaniem konfokalnej mikroskopii żywych komórek.
Protokół
1. Bieżnia elektryczna w celu ujawnienia stopnia uszkodzenia mięśni w modelach mysich
- Ustaw kąt nachylenia powierzchni bieżni do wykorzystania podczas protokołu biegu. Zazwyczaj stosuje się poziom płaski lub kąt od 7° do 15° w dół lub w górę. Niektóre bieżnie posiadają zintegrowane urządzenie do regulacji nachylenia, podczas gdy inne wymagają uniesienia bieżni za pomocą innych środków.
- Przed umieszczeniem zwierząt na bieżni, należy położyć pod nią tacę lub niebieską matę laboratoryjną w celu zbierania odchodów zwierząt podczas protokołu biegu.
- Przed rozpoczęciem biegu myszy powinny zostać zaadaptowane do środowiska bieżni. Polega to na umieszczeniu zwierząt na bieżni na 15 minut przy wyłączonej siatce elektrycznej i włączonym silniku napędowym taśmy, ale bez ruchu taśmy (tzn. przy prędkości ustawionej na 0 m/s).
- Włącz motywującą siatkę elektryczną. Natężenie i częstotliwość stosowanych impulsów można zazwyczaj kontrolować na bieżniach, jednak różnią się one w zależności od producenta. Zazwyczaj do zmotywowania myszy do biegu nie jest wymagane maksymalne natężenie, natomiast wysoka częstotliwość (co najmniej raz na dwie sekundy) poprawi współpracę zwierząt.
- Uruchom taśmę bieżni, aby rozpocząć protokół biegu. W okresie rozgrzewki myszy należy zastosować prędkość początkową wynoszącą około 5 metrów/min. Prędkość bieżni można zwiększać powoli, zazwyczaj dodając 1-2 metrów/min w każdej minucie po uruchomieniu bieżni.
- W większości protokołów współpracę zwierząt można poprawić, przeprowadzając serię krótkich biegów (5 minut) z prędkością rozgrzewkową przez okres od 3 do 10 dni przed rozpoczęciem biegów eksperymentalnych.
- Ćwiczenia do ostrego wyczerpania zazwyczaj polegają na stopniowym zwiększaniu prędkości bieżni aż do osiągnięcia prędkości maksymalnej (zazwyczaj < 30 m/m), która jest utrzymywana do momentu, gdy myszy wykażą oznaki wyczerpania. Kryteria oceny wyczerpania są różne, ale zazwyczaj obejmują sytuację, w której mysz spędza więcej niż połowę czasu na siatce elektrycznej lub znajduje się na niej przez 5 kolejnych sekund bez powrotu na powierzchnię bieżni. Po wyczerpaniu poszczególnej myszy można ją zdjąć z bieżni i zapisać całkowity czas biegu.
- Zmiana kąta nachylenia bieżni może być stosowana w ostrych próbach biegowych w celu zwiększenia obciążenia ćwiczeniowego (przy nachyleniu pod górę) lub wywołania uszkadzających skurczów ekscentrycznych (przy nachyleniu z góry), które rozrywają błony sarkolemmalne włókien mięśniowych1. Przed takimi procedurami zwierzętom można wstrzyknąć barwnik Evans blue, który służy jako barwnik histologiczny do identyfikacji uszkodzonych włókien mięśniowych2,3.
- Protokoły biegowe treningu wytrzymałościowego dostarczają zwierzęciu obciążenia ćwiczeniowego przez dłuższy okres czasu (do wielu miesięcy) w celu wywołania przebudowy mięśni lub układu sercowo-naczyniowego. Procedura rozgrzewki jest taka sama jak opisana powyżej (krok 1.5), jednak prędkość maksymalna jest zazwyczaj niższa, a czasy biegu mogą być dość długie (>1 godzina).
- Po zakończeniu biegu myszy można zwrócić do ich klatek. Bieżnie zazwyczaj bardzo brudzą się podczas biegu myszy, szczególnie w przypadku długich protokołów. Po każdym użyciu konieczne jest oczyszczenie bieżni, zazwyczaj za pomocą sprayu z 70% etanolem.
2. Analiza ex vivo zdolności naprawy błony wyizolowanych włókien mięśniowych po uszkodzeniu laserem UV
- Wypreparuj powierzchowną warstwę mięśnia zginacza krótkiego palców (flexor digitorum brevis, FDB) z łapy myszy. Najpierw roznij skórę podeszwy wzdłuż linii pośrodkowej, uważając, aby nie uszkodzić znajdującego się pod nią mięśnia, następnie wykonaj cięcia poprzeczne i usuń skórę. Płaski, biały ścięgno mięśnia FDB (ścięgno proksymalne) jest widoczne w miejscu przyczepu do kości piętowej. Oddziel ścięgno tępym narzędziem (pincetą) i przetnij je blisko miejsca przyczepu, chwyć wolny koniec ścięgna pincetą i delikatnie pociągnij go do góry, aby oddzielić FDB od otaczających tkanek, przecinając wszelkie pozostałe tkanki łączności. Po zauważeniu rozgałęzień ścięgien dystalnych do poszczególnych palców, mięsień FDB można usunąć, przecinając miejsce, w którym ścięgna te łączą się z głębszą warstwą mięśnia.
- Umieść pęczek mięśnia FDB w 1 ml roztworu kolagenazy wstępnie ogrzanego do 37°C w probówce Eppendorf o pojemności 1,5 ml, przymocuj probówkę w pozycji poziomej w inkubatorze z wytrząsarką orbitalną w temperaturze 37°C i inkubuj przy 200 rpm przez 65 min. Czas inkubacji może wymagać dostosowania, aby zapewnić wystarczający stopień trawienia, co objawia się postrzępioną strukturą i bladym kolorem mięśnia.
- Ostrożnie przenieś strawiony pęczek FDB do probówki wirówkowej o pojemności 1,5 μl zawierającej ~600 μl roztworu 2,5 Ca2+ Tyrode, używając końcówki pipety 1 ml z odciętym końcem o średnicy umożliwiającej łatwe przejście strawionego pęczka bez jego uszkodzenia. Delikatnie obracaj probówkę, aby oddzielić luźne włókna od pęczka.
- Odetnij końcówkę pipety 30 μL tak, aby jej średnica była tylko nieco mniejsza niż pęczek mięśniowy (średnica między 15 - 20 μm). Używając pipety, delikatnie wciągnij pęczek do wnętrza końcówki, a następnie wypchnij go z powrotem do roztworu. Powtarzaj ten proces, aż większość włókien zostanie oddzielona od pęczka.
- Dobrze wymieszaj oddzielone włókna, delikatnie obracając probówkę, pobierz pożądaną ilość i nanieś na szkiełko delta T z dna szklanego. Objętość naniesionego materiału zależy od wydajności izolacji oraz liczby użytecznych włókien potrzebnych na szkiełku do konkretnego protokołu. Pozostałe włókna można przechowywać w probówce w temperaturze 4°C przez około 6 godzin do dalszych badań.
- Pozostaw szkiełko w spoczynku przez 5 minut. Pozwoli to włóknom przywrzeć do szklanego dna naczynia.
- Umieść naczynie z dna szklanego pod mikroskopem konfokalnym wyposażonym w laser UV. Obserwuj włókna w mikroskopii fazowej przy powiększeniu >100X, aby sprawdzić obecność prawidłowego wzorca prążkowania oraz prostego, pręcikowego kształtu.
- Dodaj do roztworu barwniki styrylpirydyniowe FM1-43 lub FM4-644 do stężenia końcowego 2,5 μM5.
- Aby wywołać uszkodzenie włókna, ustaw je w oknie obrazowania tak, aby włókno było zorientowane pod kątem 45° od górnego lewego do dolnego prawego rogu pola widzenia (Rysunek 1). Naświetl obszar o wielkości 5x5 pikseli (około 0,9μmx0,9μm) błony plazmatycznej za pomocą lasera UV (80 mW lub więcej, 351/364 nm) ustawionego na maksymalną moc przez 5 sekund. Obszar naświetlany powinien przecinać błonę plazmatyczną; tzn. połowa pola 5x5 powinna znajdować się wewnątrz włókna, a pozostała część na zewnątrz (Rysunek 1).
- Rejestruj obrazy wnikania barwnika do włókna w odstępach co 5 sekund przez maksymalnie 5 minut.
- Powtórz krok 2.8 dla maksymalnie 3 włókien na jednym szkiełku, ponieważ barwnik fluorescencyjny zostanie z czasem endocytowany do wnętrza włókna, co utrudni analizę danych. Po zbadaniu 3 włókien należy przygotować nowe szkiełko zgodnie z krokiem 2.5.
- Przeanalizuj dane, obliczając zmianę intensywności fluorescencji (ΔF/F0) między każdą zarejestrowaną klatką, aby zmierzyć ilość wnikającego barwnika. Wymaga to pomiaru średniej fluorescencji obszaru o powierzchni około 200 μm2 przy użyciu oprogramowania analitycznego, np. ogólnodostępnego programu ImageJ (http://rsbweb.nih.gov/ij/). Dla porównania między włóknami, dla każdej klatki należy wykonać następujące obliczenie: ΔF/F0, gdzie F0 to średnia fluorescencja obszaru zainteresowania w pierwszej zarejestrowanej klatce (t = 0; przed uszkodzeniem), a ΔF to zmiana fluorescencji w każdej kolejnej klatce (F-F0).
3. Konfokalne obrazowanie żywych komórek w celu monitorowania dynamicznego procesu naprawy błony komórkowej
- Mikropipety wykonano z kapilar PYREX. Kapilarę umieszczono w wyciągaczu mikropipet i wyciągnięto zgodnie z zaprogramowanymi parametrami (Heat=695; Pull=50; Vel.=55; Time=250).
- Mikropipetę przymocowano do 3-osiowego (xyz) mikromanipulatora.
- Komórki transfekowano plazmidowym DNA standardowymi metodami w szalce delta T z szklanym dnem. Przed rozpoczęciem eksperymentów należy zamienić pożywkę na bufor Tyrode z 2,5mM Ca2+.
- Szklane szalki zawierające transfekowane komórki umieszczono w konfokalnym mikroskopie skaningowym z obiektywem imersyjnym olejowym 40X 1,3NA.
- Ostre uszkodzenie żywej komórki wykonano poprzez wprowadzenie mikropipety w błonę komórkową, a następnie szybkie wycofanie mikropipety z komórki3,6. Kolejne obrazy żywej komórki pozyskiwano w odstępach 1,54 s/klatkę.
- W teście rozrywania błony indukowanego saponiną, 0,005% saponiny (Sigma) w buforze Tyrode z 2,5mM Ca2+ perfundowano za pomocą grawitacyjnego, niestandardowego systemu perfuzji7. Szybkość perfuzji wynosi około 1 ml/min, a końcówkę perfuzyjną należy umieścić bezpośrednio nad obrazowaną komórką.
4. Reprezentatywne wyniki:
Podczas filmowania można przygotować reprezentatywny materiał wideo z myszy biegnącej na bieżni. Film ten zilustruje obniżoną wydolność biegową myszy mg53-/- wynikającą z uszkodzenia mięśni szkieletowych.
Zakres uszkodzeń wywołanych opisanym powyżej protokołem uszkadzania laserem UV zależy od zdolności naprawy błony analizowanego włókna. Zdolność ta jest uwarunkowana genotypem myszy, z której wyizolowano włókno, warunkami zewnątrzkomórkowymi oraz wszelkimi zmianami w ekspresji białek (transfekcją lub infekcją). Normalne włókno typu dzikiego wykazuje niewielki do umiarkowanego wnikania barwnika (Rycina 2a). Włókno mięśniowe pochodzące od myszy mg53-/- o upośledzonej zdolności naprawy błony wykazuje znacznie bardziej intensywne wnikanie barwnika do wnętrza włókna (Rycina 2b).
Typowe wyniki dla uszkodzeń wywołanych mikroelektrodą wykazują translokację pęcherzyków zawierających MG53 do miejsca uszkodzenia. Rysunki 3a i 3b przedstawiają myotuby C2C12 przetransfekowane GFP-MG53, uszkodzone poprzez wprowadzenie mikropipety do błony komórkowej. W komórce przed uszkodzeniem mikropipetą GFP-MG53 znajduje się zarówno w błonie plazmatycznej, jak i w cytoplazmie3. Po penetracji mikropipetą pęcherzyki zawierające GFP-MG53 przemieściły się w stronę miejsc uszkodzenia (wskazano je grotami strzałek). Rysunek 3c przedstawia mioblasty C2C12 przetransfekowane GFP-MG53, poddane działaniu 0,005% saponiny, detergentu, który może permeabilizować błonę plazmatyczną. Po zastosowaniu saponiny GFP-MG53 przemieściło się z cytosolu do błony komórkowej.
Weisleder, et al. Rysunek 1. Orientacja włókien i definicja obszaru uszkodzenia. Prawidłowa orientacja wyizolowanego włókna mięśniowego w polu widzenia oraz definicja wskazanego obszaru uszkodzenia.
Weisleder, et al. Rysunek 2. Uszkodzenie włókna FDB laserem UV. Obrazy przedstawiają włókna przed uszkodzeniem (0 s, lewo) oraz w 200 s po uszkodzeniu (prawo). Włókna myszy typu dzikiego (a) wykazują niewielkie uszkodzenie. Włókna myszy z upośledzoną naprawą błony (b) pozwalają na przenikanie większej ilości barwnika.
Weisleder, et al. Rysunek 3. Uszkodzenia hodowanych komórek spowodowane mikroelektrodą i saponiną. Zdjęcia przedstawiają miotuby C2C12 (a, b) oraz mioblast C2C12 (c) przed uszkodzeniem (góra) i po uszkodzeniu (dół). Komórki uszkodzone mikroelektrodą (a, b) wykazują translokację MG53 do miejsc uszkodzenia (strzałki). Komórki traktowane saponiną (c) wykazują translokację MG53 do błony komórkowej.
Dyskusja
Bieganie na bieżni jest użyteczną metodą dostarczania obciążenia wysiłkowego leczonym zwierzętom. Jako metoda pomiaru funkcji mięśni lub wydolności wytrzymałościowej jest to podejście znane z dużego poziomu szumów, co utrudnia jego powtarzalne wykonanie8. Ogólnie czas do wyczerpania może być stosowany jako punkt końcowy w celu wykazania istotnych różnic między grupami eksperymentalnymi, na przykład między niektórymi liniami myszy z nokautem a myszami typu dzikiego9. Manipulacje eksperymentalne wywołujące subtelniejsze różnice, takie jak niektóre badania farmakologiczne, mogą nie wykazać różnic wykraczających poza poziom szumu związanego z tą techniką. Aby zmaksymalizować powtarzalność i czułość tych metod, ważne jest bardzo ścisłe utrzymywanie tych samych warunków dla każdej sesji. Pora dnia, w której zwierzęta są poddawane wysiłkowi, a także warunki okresu rozgrzewki są istotnymi czynnikami i powinny pozostawać niezmienne w kolejnych próbach.
Wpływ szczepu może mieć istotne znaczenie dla projektu protokołów biegowych na bieżni, ponieważ niektóre szczepy myszy mogą biegać znacznie dłużej niż inne i różnie reagować na wysiłek wytrzymałościowy10. Jako ogólną wytyczną przyjmuje się, że wiele myszy jest w stanie przebiec łącznie 200-300 metrów w badaniu wyczerpania przy stałym zwiększaniu prędkości bieżni (prędkość początkowa 5 m/m z dodatkiem 1 m/m w każdej minucie po rozpoczęciu). W przypadku ćwiczeń wytrzymałościowych myszy mogą biegać z prędkością od 9 do 12 m/m przez 30 minut, 2 lub 3 razy w tygodniu. Jednakże poszczególne badania zazwyczaj wymagają pewnej optymalizacji protokołu, aby dostosować go do indywidualnych potrzeb eksperymentalnych.
Wykazano, że procedura uszkadzania laserem UV jest skuteczną metodą pomiaru zdolności do naprawy błony włókien mięśni szkieletowych3,6,11. Kluczowym elementem sukcesu tych eksperymentów jest stosowanie wyłącznie włókien mięśniowych o prostym, pręcikowatym wyglądzie, z regularnym wzorem prążkowania i gładkim sarkolemmą, który nie wykazuje pomarszczeń. Wybór innych włókien mięśniowych może sprawić, że w komórkach tych będą już występować uszkodzenia błony, co może skomplikować interpretację wyników eksperymentów. Ważne jest również, aby orientacja włókna oraz definicja obszaru naświetlanego były zgodne z Rysunkiem 1. Zapewnia to uraz o powtarzalnej wielkości, co umożliwia porównanie poszczególnych włókien. Jeśli zdefiniowany obszar urazu znajduje się całkowicie wewnątrz włókna, powstanie uraz wewnętrzny zamiast przerwania sarkolemmy. Ponadto wartość obliczona dla ΔF/F0 jest bardzo wrażliwa na wybrany obszar zainteresowania (ROI) służący do pomiaru średniej fluorescencji. Odpowiednim jest obszar o wielkości około 200μm2, przylegający do miejsca urazu i obejmujący je. W przeciwieństwie do obszaru zdefiniowanego dla urazu, obszar ten powinien znajdować się całkowicie wewnątrz włókna. Włączenie przestrzeni poza włóknem spowoduje, że powstały pusty obszar zwiększy wartość ΔF/F0 we włóknach z niewielkim przenikaniem barwnika, jednocześnie obniżając ΔF/F0 we włóknach o cięższym fenotypie. Zmniejsza to czułość testu, utrudniając tym samym porównywanie włókien.
W przypadku testu uszkodzeń mikropipetą, kąt między mikropipetą a szklanym dnem naczynia powinien wynosić około 45 stopni, aby skutecznie uszkodzić błonę komórkową. Komórki wybrane do uszkodzenia mikropipetą powinny być ściśle przylegać do dna naczynia; nie należy używać komórek zaokrąglonych, ponieważ najprawdopodobniej odkleją się one po nakłuciu mikropipetą. Eksperymenty z permeabilizacją saponiną są mniej wymagające technicznie i stosunkowo szybsze w wykonaniu w porównaniu do testów penetracji mikropipetą. Istnieje jednak kilka ograniczeń związanych z uszkadzaniem saponiną, w tym fakt, że w jednym naczyniu można użyć tylko jednej komórki, ponieważ saponina dyfunduje i uszkadza inne komórki w tym samym naczyniu.
Oświadczenia
Nie zgłoszono konfliktów interesów.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Bieżnia dla gryzoni | Columbus Instruments Exer 3/6 lub odpowiednik | ||
| 70 % etanol | ISC Bioexpress | ||
| Narzędzia do sekcji, w tym pęsety z cienką końcówką, nożyczki sprężynowe | World Precision Instruments, Inc. | ||
| 2 mg/ml kolagenazy typu I | Sigma-Aldrich | ||
| Bufor Tyrode bez Ca2+ (140 mM NaCl, 5 mM KCl, 10 mM HEPES, 2 mM MgCl2, pH 7.2, 290 mosm) | Sigma-Aldrich | ||
| Bufor Tyrode z 2.5mM Ca2+ (140 mM NaCl, 2.5 mM CaCl2, 5 mM KCl, 10 mM HEPES, 2 mM MgCl2, pH 7.2, 290 mosm) | Sigma-Aldrich | ||
| Wstrząsarka orbitalna z kontrolą temperatury | New Brunswick Scientific | ||
| Szalka Delta TPG | Fisher Scientific | 1207133 | |
| Mikroskop konfokalny LSM 510 z laserem UV Enterprise 80 mW lub równoważny mikroskop konfokalny | Carl Zeiss, Inc. | ||
| Barwniki FM1-43 lub FM4-64 | Invitrogen | ||
| Kapilary borokrzemianowe rozmiar 0.8-1.0 X 100 mm | PYREX | Part No. 9530-2 | |
| Wytciągacz do mikropipet | Sutter Instrument Co. | model P-97 | |
| 3-osiowy mikromanipulator | Narishige International | MHW-3 | |
| Skanujący mikroskop konfokalny Radiance 2100 lub równoważny mikroskop | Bio-Rad | MHW-3 | |
| Saponina | Sigma-Aldrich | 47036 |
Bibliografia
- Armstrong, R. B., Ogilvie, R. W., Schwane, J. A. Eccentric exercise-induced injury to rat skeletal muscle. J Appl Physiol. 54, 80-93 (1983).
- Hamer, P. W., McGeachie, J. M., Davies, M. J., Grounds, M. D. Evans Blue Dye as an in vivo marker of myofibre damage: optimising parameters for detecting initial myofibre membrane permeability. J Anat. 200, 69-79 (2002).
- Cai, C. MG53 nucleates assembly of cell membrane repair machinery. Nat Cell Biol. 11, 56-64 (2009).
- Cochilla, A. J., Angleson, J. K., Betz, W. J. Monitoring secretory membrane with FM1-43 fluorescence. Annu Rev Neurosci. 22, 1-10 (1999).
- McNeil, P. L., Miyake, K., Vogel, S. S. The endomembrane requirement for cell surface repair. Proc Natl Acad Sci U S A. 100, 4592-4597 (2003).
- Cai, C. Membrane repair defects in muscular dystrophy are linked to altered interaction between MG53, caveolin-3, and dysferlin. J Biol Chem. 284, 15894-15902 (2009).
- Wang, X. Cardioprotection of ischemia/reperfusion injury by cholesterol-dependent MG53-mediated membrane repair. Circ Res. 107, 76-83 (2010).
- Knab, A. M. Repeatability of exercise behaviors in mice. Physiol Behav. 98, 433-440 (2009).
- Zhao, X. Enhanced resistance to fatigue and altered calcium handling properties of sarcalumenin knockout mice. Physiol Genomics. 23, 72-78 (2005).
- Massett, M. P., Berk, B. C. Strain-dependent differences in responses to exercise training in inbred and hybrid mice. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 288, 1006-1013 (2005).
- Bansal, D. Defective membrane repair in dysferlin-deficient muscular dystrophy. Nature. 423, 168-172 (2003).
Przedruki i uprawnienia
