Wizualizacja naprawy błony komórkowej za pośrednictwem MG53 przy użyciu systemów in vivo i in vitro

Podsumowanie

Opisane tutaj są protokoły używane do wizualizacji dynamicznego procesu naprawy błon komórkowych za pośrednictwem MG53 u całych zwierząt i na poziomie komórkowym. Metody te mogą być stosowane do badania biologii komórek w procesie uszczelniania błon plazmatycznych i medycyny regeneracyjnej.

Streszczenie

Naprawa ostrego uszkodzenia błony komórkowej jest elementarnym procesem normalnej fizjologii komórkowej, a wadliwa naprawa błony została powiązana z wieloma chorobami zwyrodnieniowymi u ludzi. Niedawne odkrycie MG53 jako kluczowego składnika maszynerii do ponownego uszczelniania błon pozwala na lepsze zrozumienie molekularne podstaw biologii naprawy tkanek, a także na potencjalne zastosowania translacyjne w medycynie regeneracyjnej. Tutaj szczegółowo opisujemy eksperymentalne protokoły badania funkcji in vivo MG53 w naprawie uszkodzeń mięśni przy użyciu protokołów ćwiczeń na bieżni na modelach mysich, testowania zdolności naprawy błony ex vivo poprzez pomiar wnikania barwnika do izolowanych włókien mięśniowych oraz monitorowania dynamicznego procesu transportu pęcherzyków za pośrednictwem MG53 i naprawy błony komórkowej w hodowanych komórkach za pomocą mikroskopii konfokalnej żywych komórek.

Protokół

1. Bieganie na bieżni w celu ujawnienia zakresu uszkodzenia mięśni w modelach mysich

1. Ustal kąt nachylenia powierzchni bieżni do użytku podczas protokołu biegowego. Ogólnie rzecz biorąc, stosuje się płaski poziom lub kąt między 7° a 15° stopni w dół lub pod górę. Niektóre bieżnie mają wbudowane urządzenie do regulacji nachylenia, podczas gdy inne wymagają podniesienia bieżni w inny sposób.
2. Umieść tacę lub niebieską podkładkę laboratoryjną pod bieżnią przed umieszczeniem zwierząt w bieżni, aby zebrać wszelkie odpady od zwierząt podczas protokołu biegowego.
3. Przed bieganiem myszy powinny zaaklimatyzować się w środowisku bieżni. Polega to na umieszczeniu zwierząt w bieżni na 15 minut przy wyłączonej sieci elektrycznej i włączonym silniku napędu pasowego, ale pasie nie poruszającym się (tj. z prędkością ustawioną na 0 m/s).
4. Włącz motywacyjną sieć elektryczną. Intensywność i częstotliwość używanych impulsów można zwykle kontrolować na bieżniach, ale różni się w zależności od producenta. Ogólnie rzecz biorąc, maksymalna intensywność nie jest wymagana, aby zmotywować myszy do biegania, podczas gdy wysoka częstotliwość (co najmniej raz na dwie sekundy) poprawi zgodność.
5. Aktywuj pas bieżni, aby rozpocząć protokół biegu. Prędkość początkowa około 5 metrów/min powinna być używana do rozgrzewki myszy. Prędkość bieżni można powoli zwiększać, zwykle dodając 1-2 metry/min na każdą minutę po uruchomieniu bieżni.
6. Przestrzeganie przez zwierzęta większości protokołów można poprawić, przeprowadzając serię krótkich przebiegów (5 minut) z prędkością rozgrzewki przez 3 do 10 dni przed rozpoczęciem eksperymentu.
7. Ćwiczenie na ostre wyczerpanie zwykle polega na zwiększaniu prędkości bieżni z czasem, aż do osiągnięcia maksymalnej prędkości (zwykle < 30 m/m) i utrzymywaniu jej, aż myszy wykażą oznaki wyczerpania. Kryteria oceny wyczerpania są różne, ale zazwyczaj obejmują mysz spędzającą ponad połowę czasu na sieci elektrycznej lub 5 kolejnych sekund na sieci elektrycznej bez powrotu na powierzchnię bieżni. Po wyczerpaniu pojedynczej myszy można ją zdjąć z bieżni i zarejestrować całkowity czas biegu.
8. Zmiana kąta nachylenia bieżni może być stosowana w ostrych próbach biegowych w celu zwiększenia obciążenia wysiłkowego (pod górę) lub wywołania szkodliwych skurczów ekscentrycznych (pod kątem zjazdu), które rozrywają błony sarkolemmalne włókien mięśniowych¹. Niebieski barwnik Evansa może być wstrzykiwany zwierzętom przed takimi zabiegami w celu stosowania jako barwnik histologiczny do identyfikacji uszkodzonych włókien mięśniowych^2,3.
9. Protokoły treningu wytrzymałościowego zapewniają zwierzęciu obciążenie treningowe przez dłuższy czas (do miesięcy) w celu przeprowadzenia przebudowy mięśni lub układu sercowo-naczyniowego. Procedura rozgrzewania jest taka sama jak powyżej (krok 1.5), jednak maksymalna prędkość jest zazwyczaj niższa, a czas pracy może być dość długi (>1 godzina).
10. Po zakończeniu biegu myszy mogą wrócić do swoich klatek. Bieżnie zwykle stają się dość brudne, gdy myszy biegają, szczególnie podczas długich protokołów. Konieczne jest czyszczenie bieżni, zwykle sprayem 70% etanolu, po każdym użyciu.

2. Test ex vivo zdolności naprawczej błony izolowanych włókien mięśniowych po uszkodzeniu przez laser UV

1. Wypreparuj powierzchowną warstwę mięśnia zginacza palca krótkiego (FDB) ze stopy myszy. Najpierw rozetnij skórę podeszwy na linii środkowej, uważając, aby nie uszkodzić mięśnia pod spodem, a następnie wykonaj poziome nacięcia i usuń skórę. Widać płaskie białe ścięgno mięśnia FDB (ścięgno proksymalne) przyczepione do kości piętowej. Dosadnie oddziel ścięgno za pomocą kleszczy i przeetnij ścięgno w pobliżu miejsca przyczepu, chwyć wolne ścięgno kleszczami i delikatnie pociągnij je do góry, aby oddzielić FDB od otaczających tkanek, jednocześnie przecinając wszelkie tkanki łączne, które pozostają przyczepione. Widząc, że dystalne ścięgna rozgałęziają się do poszczególnych palców, FDB można usunąć, przecinając miejsce, w którym te ścięgna łączą się z głębszą warstwą mięśnia.
2. Umieścić pęczek mięśniowy FDB w 1 ml roztworu kolagenazy podgrzanego do 37°C w probówce Eppendorfa o pojemności 1,5 ml, zakleić probówkę taśmą w orientacji poziomej w wytrząsarce orbitalnej o temperaturze 37°C i wstrząsać z prędkością 200 obr./min przez 65 minut. Może być konieczne dostosowanie czasu inkubacji w celu zapewnienia wystarczającego trawienia, na co wskazuje postrzępiony wygląd i blady kolor mięśnia.
3. Ostrożnie przenieś strawiony pakiet FDB do probówki wirówkowej o pojemności 1,5 μl zawierającej ~600 μl 2,5 Ca²⁺ Tyrode za pomocą końcówki pipety o pojemności 1 ml z odciętym końcem o średnicy wystarczającej do tego, aby strawiony pakiet mógł łatwo przejść bez zakłóceń. Delikatnie obróć tubę, aby strząsnąć luźne włókna z wiązki.
4. Naciąć końcówkę pipety o pojemności 30 μl tak, aby średnica była tylko nieznacznie mniejsza niż wiązka mięśni (o średnicy od 15 do 20 μm). Za pomocą pipetora delikatnie wciągnąć wiązkę do pipety, a następnie wepchnąć ją z powrotem do roztworu. Powtarzaj ten proces, aż większość włókien zostanie oddzielona od wiązki.
5. Dobrze wymieszaj oddzielone włókna, delikatnie obracając rurkę, weź żądaną ilość i upuść na szalkę delta T ze szklanym dnem. Objętość do załadowania będzie się różnić w zależności od skuteczności izolacji i liczby użytecznych włókien, które są potrzebne na naczyniu dla określonego protokołu. Pozostałe włókna można przechowywać w probówce w temperaturze 4°C przez około 6 godzin w celu przeprowadzenia dodatkowych badań.
6. Pozostaw danie w spokoju na 5 minut. Dzięki temu włókna przylegają do szklanego dna naczynia.
7. Umieść naczynie ze szklanym dnem na mikroskopii konfokalnej wyposażonej w laser UV. Obserwuj włókna pod mikroskopią fazową przy powiększeniu >100X, aby sprawdzić, czy nie ma normalnego wzoru prążkowania i prostego, przypominającego pręt kształtu.
8. Dodać barwniki styrylopirydyniowe FM1-43 lub FM4-64 4 doroztworu do końcowego stężenia 2,5^μM5.
9. Aby wywołać uszkodzenie światłowodu, umieść go w oknie obrazowania tak, aby światłowód był zorientowany pod kątem 45° od lewego górnego rogu pola widzenia do prawego dolnego rogu (rysunek 1). Naświetlić obszar piksela o wymiarach 5x5 pikseli (około 0,9 μm x 0,9 μm) błony plazmatycznej za pomocą lasera UV (80 mW lub większego, 351/364 nm) ustawionego na maksymalną moc przez 5 sekund. Napromieniany obszar powinien rozszczepić błonę plazmatyczną; oznacza to, że połowa pudełka 5x5 powinna znajdować się wewnątrz światłowodu, a pozostała część powinna znajdować się na zewnątrz światłowodu (rysunek 1).
10. Uchwyć obrazy wnikania barwnika do włókna w odstępach 5 sekund każdy przez maksymalnie 5 minut.
11. Powtórz krok 2.8 dla nie więcej niż 3 włókien na naczynie, ponieważ barwnik fluorescencyjny w końcu zostanie endocytozowany do włókna i skomplikuje analizę danych. Po 3 włóknach należy przygotować nowe danie z kroku 2.5.
12. Analizuj dane, obliczając zmianę intensywności fluorescencji (ΔF/F₀) między każdą przechwyconą klatką, aby zmierzyć ilość wnikającego barwnika. Wymaga to zmierzenia średniej fluorescencji obszaru o wielkości około 200^μm2 za pomocą oprogramowania analitycznego, takiego jak publicznie dostępne ImageJ (http://rsbweb.nih.gov/ij/). W celu porównania między włóknami należy wykonać następujące obliczenia dla każdej ramki: ΔF/F₀, gdzie F₀ jest średnią fluorescencją obszaru zainteresowania w pierwszej przechwyconej ramce (t = 0; przed uszkodzeniem), a ΔF jest zmianą fluorescencji każdej kolejnej ramki (F-F₀).

3. Obrazowanie konfokalne żywych komórek w celu monitorowania dynamicznego procesu naprawy błony komórkowej

1. Mikropipety wykonano z kapilar PYREX. Kapilarę umieszczono na ściągaczu do mikropipet i wyciągnięto za pomocą wstępnie ustawionego programu (Heat = 695; Ciągnięcie = 50; Vel.=55; Czas=250).
2. Mikropipeta została podłączona do 3-osiowego (xyz) mikromanipulatora.
3. Komórki są transfekowane plazmidowym DNA przy użyciu normalnych metod na szklanej płytce delta T. Nośnik należy przełączyć na bufor 2.5mM Ca²⁺ Tyrode przed rozpoczęciem eksperymentów.
4. Szklane naczynia zawierające transfekowane komórki umieszczono na laserowym skaningowym mikroskopie konfokalnym z obiektywem 40X 1,3NA do zanurzenia w olejku.
5. Ostre uszkodzenie żywych komórek przeprowadzono poprzez wprowadzenie mikropipety do błony komórkowej, a następnie szybkie wycofanie mikropipety z komórki^3,6. Kolejne obrazy żywych komórek uzyskano w odstępie 1,54 s/klatkę.
6. W teście rozerwania błony wywołanej saponinami, 0,005% saponiny (Sigma) w buforze 2,5 mM Ca²⁺ Tyrode zostało perfundowane przez specjalnie zmontowany system perfuzyjny^z przepływem grawitacyjnym 7. Szybkość perfuzji wynosi około 1 ml/min, a końcówka perfuzyjna powinna być umieszczona bezpośrednio nad obrazowaną komórką.

4. Reprezentatywne wyniki:

Reprezentatywny film przedstawiający bieganie na bieżni myszy można nakręcić podczas filmowania. Film zilustruje zmniejszoną zdolność biegową myszy mg53-/- z powodu uszkodzenia mięśni szkieletowych.

Zakres uszkodzeń spowodowanych przez protokół uszkodzeń laserem UV opisany powyżej zależy od zdolności naprawy membrany analizowanego włókna. Na tę zdolność ma wpływ genotyp myszy, od której wyizolowano włókno, warunki zewnątrzkomórkowe i wszelkie zmiany w ekspresji białka (transfekcja lub infekcja). Normalne włókno typu dzikiego pozwoli na lekkie lub umiarkowane wnikanie barwnika (ryc. 2a). Włókno mięśniowe pochodzące od myszy mg53-/- z upośledzoną zdolnością naprawy błony będzie wykazywać bardziej znaczące wejście barwnika do włókna (ryc. 2b).

Typowe wyniki dla uszkodzenia mikroelektrody pokazują translokację pęcherzyków zawierających MG53 do miejsca urazu. Ryciny 3a i 3b pokazują transfekowane przez GFP-MG53 miorurki C2C12 uszkodzone przez wprowadzenie mikropipety do błony komórkowej. W komórce przed uszkodzeniem mikropipety GFP-MG53 znajduje się zarówno na błonie plazmatycznej, jak i cytoplazmie³. Po penetracji mikropipety pęcherzyki zawierające GFP-MG53 przemieściły się w kierunku miejsc uszkodzenia (oznaczonych grotem strzałki). Rycina 3c przedstawia transfekowane przez GFP-MG53 mioblasty C2C12 potraktowane 0,005% saponiny, detergentu, który może przenikać przez błonę plazmatyczną. Po leczeniu saponinami GFP-MG53 uległ translokacji z cytozolu do błony komórkowej.

Weisleder, et al. Rysunek 1. Wyrównanie włókien i definicja regionu urazu. Właściwa orientacja izolowanego włókna mięśniowego w polu widzenia i określenie obszaru urazu.

Weisleder, et al. Rysunek 2. Uszkodzenie włókna FDB przez laser UV. Zdjęcia pokazują włókna przed urazem (0 sekund, po lewej) i po 200 sekundach od urazu (po prawej). Włókna myszy typu dzikiego (a) wykazują niewielkie uszkodzenie. Włókna myszy z upośledzoną naprawą błony (b) pozwalają na wnikanie większej ilości barwnika.

Weisleder, et al. Rysunek 3. Uszkodzenie mikroelektrod i saponin w hodowanych komórkach. Obrazy pokazują miotubki C2C12 (a, b) i mioblast C2C12 (c) przed urazem (powyżej) i po urazie (na dole). Ogniwa uszkodzone mikroelektrodą (a, b) wykazują translokację MG53 do miejsc uszkodzenia (strzałki). Komórki traktowane saponiną (c) wykazują translokację MG53 do błony komórkowej.

Dyskusja

Bieganie na bieżni jest przydatną metodologią w zapewnianiu obciążenia fizycznego leczonym zwierzętom. Jako metodologia pomiaru funkcji mięśni lub wydolności wytrzymałościowej jest to notorycznie hałaśliwe podejście, które jest trudne do wykonania w sposób powtarzalny⁸. Ogólnie rzecz biorąc, czasy do wyczerpania mogą być używane jako punkt końcowy do rozwiązania głównych różnic między grupami eksperymentalnymi, takich jak te między niektórymi liniami myszy z nokautem a myszami typu dzikiego⁹. Eksperymentalne manipulacje, które dają bardziej subtelne różnice, takie jak niektóre badania farmaceutyczne, mogą nie rozwiązać różnic powyżej szumu związanego z tą techniką. Aby zmaksymalizować odtwarzalność i czułość tych technik, ważne jest, aby bardzo ściśle utrzymywać warunki dla każdej sesji. Pora dnia, w której zwierzęta są ćwiczone, a także stosowane warunki okresu rozgrzewki są ważnymi czynnikami i powinny być spójne z każdej próby.

Efekty szczepu mogą mieć znaczący wpływ na projektowanie protokołów bieżni, ponieważ niektóre szczepy myszy mogą biegać na bieżni znacznie dłużej niż inne szczepy i inaczej reagować na ćwiczenia wytrzymałościowe¹⁰. Ogólnie rzecz biorąc, wiele myszy będzie w stanie przebiec łącznie 200-300 metrów w badaniu wyczerpania przy stałym wzroście prędkości bieżni (prędkość początkowa 5 m / m z 1 m dodawanym na każdą minutę po starcie). W przypadku ćwiczeń wytrzymałościowych myszy mogą biegać z prędkością od 9 do 12 m/m przez 30 minut 2 lub 3 razy w tygodniu. Jednak poszczególne badania będą zwykle wymagały pewnej optymalizacji protokołu w celu dopasowania do indywidualnych potrzeb eksperymentalnych.

Wykazano, że procedura uszkodzenia za pomocą lasera UV jest skuteczną metodą pomiaru zdolności naprawczej błon włókien mięśni szkieletowych^3,6,11. Jednym z istotnych elementów sukcesu tych eksperymentów jest użycie wyłącznie włókien mięśniowych, które mają prosty, pręcikowany wygląd z regularnym wzorem prążków i gładką sarkolemmą, która nie wydaje się pomarszczona. Jeśli wyselekcjonowane zostaną inne włókna mięśniowe, uszkodzenia błon mogą być już obecne w tych włóknach, a interpretacja wyników tych eksperymentów może być skomplikowana. Ważne jest również, aby orientacja światłowodu i definicja napromieniowanego obszaru były zgodne z rysunkiem 1. Zapewnia to uraz o powtarzalnej wielkości, umożliwiając w ten sposób porównanie między włóknami. Jeśli zdefiniowany obszar urazu leży całkowicie we włóknie, zostanie utworzony uraz wewnętrzny, a nie zakłócony sarkolemma. Dodatkowo wartość obliczona dla ΔF/F₀ jest bardzo czuła na obszar zainteresowania wybrany do pomiaru średniej fluorescencji. Odpowiedni jest obszar o powierzchni około 200^μm2, przylegający do miejsca urazu i włącznie z nim. W przeciwieństwie do obszaru zdefiniowanego dla urazu, obszar ten powinien leżeć całkowicie w obrębie włókna. Jeśli uwzględnisz przestrzeń na zewnątrz włókna, powstały ślepy obszar zwiększy ΔF/F₀ we włóknach z niewielkim wejściem barwnika, jednocześnie obniżając ΔF/F₀ we włóknach o bardziej surowym fenotypie. Zmniejsza to czułość testu, utrudniając w ten sposób porównanie między włóknami.

W przypadku testu uszkodzenia mikropipety kąt między mikropipetą a szklanym dnem powinien wynosić około 45 stopni, aby skutecznie uszkodzić błonę komórkową. Ogniwa wybrane do uszkodzenia mikropipet powinny być szczelnie przymocowane do dna naczynia, a zaokrąglone komórki nie powinny być używane, ponieważ najprawdopodobniej odczepią się po wbiciu mikropipety. Eksperymenty z przenikaniem saponin są mniej wymagające technicznie i stosunkowo szybsze do przeprowadzenia w porównaniu z testami penetracji mikropipet. Istnieje jednak kilka ograniczeń dotyczących uszkodzenia saponin, w tym to, że tylko jedna komórka może być użyta na naczynie, ponieważ saponina dyfunduje i uszkadza inne komórki w tym naczyniu.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Bieżnia dla gryzoni	Columbus Instruments Exer 3/6 lub odpowiednik
70% etanolu	ISC Bioexpress
Narzędzia do preparacji, w tym kleszcze z cienką końcówką, nożyczki sprężynowe	World Precision Instruments, Inc.
2 mg/ml kolagenaza typu I	Sigma-Aldrich
0 Ca2+ Bufor tyrolowy (140 mM NaCl, 5 mM KCl, 10 mM HEPES, 2 mM MgCl2, pH 7,2, 290 m/m/sm	Sigma-Aldrich
2,5mM Ca2+ Bufor tyrolowy (140 mM NaCl, 2,5 mM CaCl2, 5 mM KCl, 10 mM HEPES, 2 mM MgCl2, pH 7,2, 290 m²)	Sigma-Aldrich
Wytrząsarka orbitalna z regulacją temperatury	New Brunswick Scientific
Delta TPG Dish	Fisher Scientific	1207133
LSM 510 mikroskop konfokalny z laserem UV Enterprise 80 mW lub równoważnym mikroskopem konfokalnym	Carl Zeiss, Inc.
Barwniki FM1-43 lub FM4-64	Kapilary borokrzemianowe Invitrogen
Rozmiar 0,8-1,0 X 100 mm	PYREX	Nr części 9530-2
Ściągacz do mikropipet	Sutter Instrument Co.	model P-97
3-osiowy mikromanipulator	Narishige International	MHW-3
Radiance 2100 laserowy skaningowy mikroskop konfokalny lub równoważny	mikroskop Bio-Rad	MHW-3
Saponin	Sigma-Aldrich	47036