Test przesiewowy stresu oksydacyjnego w linii komórkowej astrocytów kotów, G355-5

Podsumowanie

Metodą przesiewową służącą do wykrywania utleniającego środowiska wewnątrzkomórkowego jest pomiar utleniania CM-H2DCFDA. Po utlenieniu wewnątrz komórki CM-H2DCFDA zmienia się z związku niewykazującego fluorescencji w związek fluorescencyjny. Zmianę fluorescencji mierzy się za pomocą cytometrii przepływowej, co pozwala określić liczbę komórek znajdujących się w środowisku utleniającym.

Streszczenie

Często sugerowanym mechanizmem wirusowego uszkodzenia neuronów jest stres oksydacyjny. Astrocyty pełnią istotną rolę w kontrolowaniu stresu oksydacyjnego w ośrodkowym układzie nerwowym (OUN). Astrocyty pomagają utrzymać środowisko homeostatyczne dla neuronów, a także chronią neurony przed reaktywnymi formami tlenu (RFT). CM-H2DCFDA jest przenikającym przez błony komórkowe wskaźnikiem obecności RFT. CM-H₂DCFDA wnika do komórki jako związek niewykazujący fluorescencji, a fluorescencyjny staje się po usunięciu grup octanowych przez esterazy komórkowe i utlenieniu związku. Liczba komórek wykazujących zieloną fluorescencję, mierzona za pomocą cytometrii przepływowej, jest wskaźnikiem liczby komórek znajdujących się w stanie utlenienia. CM-H₂DCFDA jest podatny na utlenianie przez liczne, różne gatunki RFT. Ten brak specyficzności w odniesieniu do tego, które RFT mogą utleniać CM-H₂DCFDA sprawia, że związek ten jest cennym odczynnikiem do stosowania we wczesnych etapach badania patogenezy, ponieważ test ten może być wykorzystany do przesiewowego wykrywania utleniającego środowiska komórkowego, niezależnie od tego, który rodnik tlenowy lub kombinacja ROS odpowiada za stan komórek. Po ustaleniu obecności ROS poprzez utlenianie CM-H₂DCFDA, a następnie można przeprowadzić dodatkowe eksperymenty w celu ustalenia, które ROS lub kombinacje ROS biorą udział w konkretnym procesie patogenezy. Wyniki niniejszego badania wykazują, że po dodaniu nadtlenku wodoru następuje wzrost CM-H₂Wykryto fluorescencję DCFDA w stosunku do kontroli solnej, co wskazuje, że analiza ta jest wartościowym testem do wykrywania środowiska oksydacyjnego w komórkach G355-5, linii komórkowej astrocytów kocich.

Protokół

1. Hodowla komórkowa astrocytów kocich i traktowanie H₂O₂

1. Hodować linię komórkową G35-5 w kolbie o powierzchni 75 cm² w pożywce DMEM z dodatkiem składników odżywczych w temperaturze 37°C i przy 5% CO₂ aż do uzyskania 60% konfluencji (˜ 5 dni). Wymieniać pożywkę co 1-2 dni lub w razie potrzeby, aby utrzymać zdrową kulturę.
2. Usunąć pożywkę i dodać 2 ml 0,25% trypsyny. Odlepić komórki poprzez pipetowanie przez 45 s - 1 min w temperaturze pokojowej (RT).
3. Szybko przenieść zawiesinę do probówki stożkowej o pojemności 15 ml zawierającej 10 ml pożywki. Delikatnie wymieszać.
4. Wirować przy 300 x g w temperaturze 23°C przez 3 min, aby uzyskać pellet. Odlać supernatant, nie naruszając pelletu.
5. Dodać 6-7 ml świeżej pożywki i resuspender komórki.
6. Dodać ˜ 1 ml komórek do każdego dołka płytki 6-dołkowej. Dodać 2-3 ml pożywki do każdego dołka i inkubować do uzyskania 80-90% konfluencji.
7. Przygotować 100μM roztwór nadtlenku wodoru (H₂O₂) w pożywce.
8. Usunąć pożywkę z każdego dołka i zastąpić ją albo 2 ml świeżej pożywki (kontrola), 2 ml H₂O₂ (próba) lub 2 ml DPBS. Inkubować w temperaturze 37°C przy 5% CO₂ przez 3 h.
9. Usunąć roztwory i dodać 1 ml trypsyny, aby odlepić komórki. Przenieść komórki do probówki Eppendorf o pojemności 1,7 ml zawierającej 0,5 ml DPBS. Krok ten należy przeprowadzać dla każdego dołka oddzielnie, aby zapobiec śmierci komórek w wyniku przedłużonej inkubacji z trypsyną.
10. Wirować przy 300 x g przez 3 min, odlać supernatant i resuspender w 1 ml DPBS.

2. Barwienie w celu wykrycia ROS

1. Wszystkie etapy barwienia należy przeprowadzać przy minimalnej ekspozycji na światło, aby zapobiec fotoblaknięciu.
2. Do kontroli pozytywnej dodać 1 μl 50 mM CCCP. Inkubować w temperaturze 37°C, przy 5% CO₂ przez 5 min.
3. Do grupy H₂O₂ dodać 5 μl 10 mM roztworu CM-H₂DCFDA. Inkubować w temperaturze 37°C, przy 5% CO₂ przez 15-30 min. Do próbki z solą fizjologiczną nie dodaje się barwnika.
4. Próbki przemyć 2 ml DPBS w celu usunięcia resztek barwnika.
5. Wirować przy 30 x g przez 3 min w celu uzyskania osadu.
6. Komórki resuspendować w 0,5 ml DPBS. Do każdej próbki, z wyjątkiem soli fizjologicznej, dodać 1 μl PI.
7. Przenieść próbki do probówek do cytometrii przepływowej o pojemności 5 ml.
8. Analizować za pomocą cytometru przepływowego.

3. Cytometria przepływowa

1. Analizę próbek należy przeprowadzić na cytometrze przepływowym Beckman Coulter FC50 (lub równoważnym), wyposażonym w laser argonowy 48 nm oraz następujące filtry pasmowe: 525, 75 i 620 nm, wszystkie z tolerancją ± 20 nm.
2. Przygotować odpowiednie kontrole: komórki niebarwione, barwione tylko CM-H₂DCFDA, barwione tylko PI oraz podwójnie barwione (kontrola negatywna).
3. Stworzyć protokół zawierający następujące histogramy dwuwymiarowe (dot-ploty): FS vs. SS oraz PI vs. CM-H₂DCFDA. Protokół powinien również zawierać następujące histogramy: liczba komórek vs. FL1, FL2 i FL3, odpowiadające poszczególnym barwnikom.
4. Przed analizą próbek sprawdzić stan urządzenia, poziomy płynów oraz pojemnik na odpady. Urządzenie należy rozgrzewać przez co najmniej 20 min.
5. Oczyścić urządzenie i przeprowadzić kalibrację przy użyciu odpowiednich kulek kalibracyjnych zgodnie ze standardami producenta.
6. Wybrać odpowiedni protokół i przeprowadzić analizę próbek.
7. Oczyścić urządzenie w sposób opisany wcześniej.
8. Oczyścić linię próżni zgodnie ze standardami producenta.
9. Wyłączyć przepływ i oczyścić głowicę oraz linię próżni.
10. Wyłączyć oprogramowanie oraz komputer.

4. Reprezentatywne wyniki:

Wyniki cytometrii przepływowej przeanalizowano przy użyciu programu FlowJo 7.6, a kontrole barwienia wykorzystano do obiektywnego ustawienia bramkowania. Na tej podstawie zdrowe komórki pojawiają się po lewej stronie histogramu, natomiast ROS (stres oksydacyjny) wykrywano jako przesunięcie komórek w prawo. Rysunek 1 przedstawia wyniki wpływu nadtlenku wodoru na zdrowe astrocyty kocie. Do pomiaru intensywności CM-H₂DCFDA, która wskazuje na obecność ROS, wykorzystano dane z kanału FL1. Zgodnie z oczekiwaniami, w próbce traktowanej H₂O₂ wykryto wyższy poziom ROS. Jest to widoczne na histogramie jako przesunięcie intensywności fluorescencji z lewej strony w prawą. Przy porównaniu zdrowych komórek traktowanych DMEM i DPBS nie stwierdzono istotnych zmian w ilości ROS (Rys. 2).

Rycina 1. Wyniki cytometrii przepływowej poziomu stresu oksydacyjnego w zdrowych astrocytach kocich oraz efekt H₂O₂ na zdrowych komórkach. Wyniki wskazują, że H₂O₂ zwiększa poziomy ROS w zdrowych komórkach w porównaniu z komórkami niepoddanymi działaniu czynnika (DMEM).

Rysunek 2. Wyniki cytometrii przepływowej poziomu ROS wykrytego w zdrowych komórkach inkubowanych przez 3 h w DPBS.

Dyskusja

Często sugerowanym mechanizmem wirusowego uszkodzenia neuronów jest stres oksydacyjny ^{1, 4, 7, 9, 13, 15, 16, 18-22, 27, 31}. W zasadzie postuluje się, że pod wpływem ekspozycji na wirusy glej (astrocyty i mikroglej) uwalnia reaktywne rodniki tlenowe, takie jak wodorotlenek, anion ponadtlenkowy, tlenek azotu i/lub nadtlenek wodoru, które są toksyczne dla neuronów. Podobnie stres oksydacyjny został wskazany jako główny mechanizm patologiczny w neurotoksyczności indukowanej przez metamfetaminę ^{2, 6, 17}...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
DMEM	Cellgro	15-013-CV
Witaminy do pożywki MEM	Cellgro	25-020-cl	1% (v/v)
L-glutamina	Hyclone	17-605E	1% (v/v)
Niezbędne aminokwasy nieistotne	Hyclone	25-025-cl	1% (v/v)
płodowa surowica bydlęca	Hyclone	SH30071.03	20% (v/v)
Niezbędne aminokwasy	Cellgro	25-030-cl	0,2% (v/v)
system do filtracji próżniowej 500 ml	VWR international	87006-076
probówki stożkowate 15 ml	Falcon BD	352097
75 cm2 kolby do hodowli tkankowych	Falcon BD	353136
płytka do hodowli tkankowej z 6 dołkami	Falcon BD	353224
CM-H2DCFDA	Invitrogen	C6827
jodek propidyny (PI)	Sigma-Aldrich	P4170-10mg
Trypsyna	Lonza Inc.	17-160F
H2O2	Sigma-Aldrich	H6520
antybiotyk HyQ	Hyclone	SV30079.01	0,1% (v/v)
komórki G355-5	ATCC	CRL-2033	Normalny mózg kota