Niniejszy artykuł opisuje kroki niezbędne do izolacji i charakterystyki wariantów polimerazy RNA o różnym stopniu wierności replikacji w przypadku wirusów RNA oraz sposób wykorzystania danych o częstotliwości mutacji do potwierdzenia zmian wierności w hodowlach tkankowych.
Artykuł metodologiczny
Izolacja wariantów wierności replikacji wirusów RNA i charakterystyka częstotliwości mutacji wirusa
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Wirusy RNA wykorzystują polimerazy RNA zależne od RNA do replikacji swoich genomów. Naturalnie wysoki wskaźnik błędów tych enzymów w dużym stopniu przyczynia się do generowania ogromnej różnorodności populacyjnej, co ułatwia adaptację i ewolucję wirusów. Coraz więcej dowodów wskazuje na to, że naturalne wskaźniki błędów i wynikające z nich częstotliwości mutacji wirusów RNA mogą być modulowane przez subtelne zmiany aminokwasowe w polimerazie wirusowej. Choć dla niektórych wirusowych polimeraz RNA istnieją testy biochemiczne umożliwiające ilościowy pomiar wierności inkorporacji, w niniejszej pracy opisujemy prostą metodę pomiaru częstotliwości mutacji wirusów RNA, która okazała się równie dokładna jak podejścia biochemiczne w identyfikacji mutacji zmieniających wierność. Podejście to wykorzystuje konwencjonalne techniki wirusologiczne i sekwencjonowanie, które mogą być przeprowadzone w większości laboratoriów biologicznych. W oparciu o nasze doświadczenia z wieloma różnymi wirusami zidentyfikowaliśmy kluczowe etapy, które muszą zostać zoptymalizowane, aby zwiększyć prawdopodobieństwo wyizolowania wariantów o zmienionej wierności i wygenerowania danych o istotności statystycznej. Izolacja i charakterystyka mutacji zmieniających wierność mogą dostarczyć nowych informacji na temat struktury i funkcji polimerazy1-3. Ponadto warianty te mogą być użytecznymi narzędziami w charakteryzowaniu mechanizmów adaptacji i ewolucji wirusów4-7.
Protokół
1. Określenie zakresu stężeń mutagenu, które są minimalnie toksyczne dla komórek
Celem niniejszego ćwiczenia jest określenie zakresu stężeń mutagenu, które można zastosować podczas infekcji bez wywoływania nadmiernej toksyczności komórkowej. W zasadzie należy odtworzyć warunki, które będą wymagane do infekcji wirusowej. W przypadku większości wirusów infekcje trwają od 2 do 7 dni. Należy przygotować odpowiednią liczbę płytek, aby pobierać próbki komórek każdego dnia. W przypadku użycia komórek nieprzytwierdzalnych należy odpowiednio zmodyfikować protokół.
- Dzień przed eksperymentem wysiać 7 x 105 komórek HeLa/studnia na płytce 6-dołkowej, aby w dniu eksperymentu uzyskać subkonfluentną (75%) monowarstwę. Każda studnia płytki zostanie poddana działaniu innego stężenia mutagenu, co pozwoli na zastosowanie zakresu 6 stężeń.
- W dniu eksperymentu przygotować rozcieńczenia mutagenu w medium do hodowli tkankowych. Dla komórek HeLa zastosować zakres od 0 do 10 μM dla analogów zasad (rybawiryna, 5-fluorouracyl, 5-azacytydyna), od 0 do 50 mM dla MgCl2 oraz od 0 do 5 mM dla MnCl2.
- Odssać medium ze studni, zastąpić je 2 ml medium z dodatkiem mutagenu i ponownie umieścić płytkę w inkubatorze.
- Co 24 godziny wykorzystać jedną płytkę z komórkami do sprawdzenia żywotności komórek. Można to osiągnąć poprzez barwienie błękitem trypanu lub stosując komercyjne testy fluorescencyjne/luminescencyjne (np. CellTiter-Glo® Luminescent Cell Viability Assay firmy Promega).
- W celu przeprowadzenia barwienia metodą wykluczania błękitu trypanu, odseparować komórki z jednej płytki (poddanej działaniu różnych stężeń mutagenu) i delikatnie osadzić komórki przez wirowanie.
- Odlać supernatant i resuspenderować komórki w PBS (serum może zakłócać barwienie).
- Zmieszać 1 objętość zawiesiny komórkowej w PBS z 1 objętością 0,4% błękitu trypanu i inkubować przez 2 minuty w temperaturze pokojowej.
- W komorze licznikowej (hemacytometrze) policzyć komórki żywe (niezbarwione) i martwe (zbarwione na niebiesko). Obliczyć procent żywych komórek dla każdego stężenia mutagenu, włącznie z kontrolą niepoddaną działaniu czynnika. Stwierdzono, że warunki prowadzące do śmierci mniej niż 50% komórek do momentu zakończenia infekcji (osiągnięcia maksymalnych mian) są idealne do izolacji oporności na mutagen.
2. Wyznaczenie optymalnego nietoksycznego stężenia mutagenu, które umiarkowanie redukuje miano wirusa (redukcja o około 0,5-2 log)
Niniejsze ćwiczenie służy do wyznaczenia stężenia mutagenu, które wywrze silną presję selekcyjną, nie powodując jednocześnie nadmiernej mutagenizacji populacji. W przypadku mutagenów RNA ustalono, że odpowiada to redukcji miana wirusa o 10,5-2 log. Przy takich stężeniach każdy genom jest zmutowany w co najmniej jednej lub dwóch pozycjach. Mutagen może wspomagać generowanie mutacji oporności, która zostanie następnie wyselekcjonowana w procesie pasażowania. Jeśli wprowadzonych zostanie zbyt wiele mutacji (przy bardzo wysokich stężeniach mutagenu), mutanty posiadające mutację oporności zostaną same poddane letalnej mutagenizacji, co uniemożliwi ich izolację.
- Zasiej płytki komórkami, stosując te same warunki co w kroku 1.
- W dniu eksperymentu przygotuj rozcieńczenia mutagenu w pożywce do hodowli tkankowych. Zastosuj ten sam zakres stężeń, który określono wcześniej, pomijając jednak stężenia, które spowodowały śmierć ponad 50% komórek. Przygotuj ilość pożywki wystarczającą do dwukrotnego pokrycia każdej studni (4 ml na studnię), aby umożliwić wstępną inkubację komórek z każdym stężeniem mutagenu przed infekcją.
- Odessaj pożywkę i przeprowadź wstępną obróbkę komórek mutagenem, inkubując je w pożywce uzupełnionej mutagenem przez 2 godziny. Dla większości typów komórek jest to czas wystarczający do pobrania mutagenu.
- Usuń pożywkę i zainfekuj wirusem przy niskiej wielokrotności zakażenia MOI (0,1 lub 0,01) w minimalnej objętości (20 μl dla płytek 6-dołkowych). Inkubuj przez 15-60 minut, aby umożliwić infekcję komórek przez wirusa. W regularnych odstępach czasu delikatnie kołysz płytką, aby zapewnić pokrycie warstwy monowarstwy komórkowej przez inokulum.
- Odessaj inokulum wirusa i przemyj dwa razy 2 ml PBS, aby usunąć jak największą ilość inokulum.
- Do każdej studni dodaj pożywkę z odpowiednimi stężeniami mutagenu i inkubuj komórki przez czas odpowiadający 3-6 cyklom replikacyjnym.
- Zabierz wirusa z każdej studni i określ efekt przeciwwirusowy na miano wirusa. Można to zrobić za pomocą standardowego testu plackowego lub metody rozcieńczeń ograniczających (TCID50). Uwaga: Ilościowe oznaczenie wirusa metodami mierzącymi wyłącznie syntezę RNA może być nieodpowiednie, ponieważ efekty mutagenne mogą nie zostać wykryte. Genomy poddane mutagenezie zawierające letalne mutacje mogą być nadal wykrywane np. za pomocą qRT-PCR, ale nie będą widoczne w testach żywotności wirusa.
- Na podstawie obliczonych mian określ stężenie mutagenu, które redukuje miana wirusa (w porównaniu z nieleczoną kontrolą infekcji) o 10,5-2 log i które nie jest jednocześnie wysoce toksyczne dla komórek (idealnie toksyczność poniżej 50%).
3. Izolacja i identyfikacja wariantów odpornych na mutagen
Przeprowadź pasażowanie w dużych populacjach przy optymalnym stężeniu mutagenu określonym powyżej i sprawdź miana wirusa w całej serii pasażowania. Jako kontrolę pasażuj wirusa w pożywce wzrostowej bez dodatku mutagenu. Jako kolejną kontrolę służącą do monitorowania potencjalnego pojawienia się defektywnych cząstek interferujących (DI), przeprowadzaj świeże zakażenia bez mutagenu na każdym etapie pasażowania (kontrola niepasażowana).
- Dzień przed infekcją, zasiać w kolbach o pojemności 25 cm2 1,5 x 106 komórek HeLa (można użyć kolb o innych rozmiarach), aby następnego dnia uzyskać subkonfluentne monowarstwy.
- W dniu infekcji poddać komórki 2-godzinnej obróbce wstępnej w medium zawierającym optymalne stężenie każdego mutagenu, określone w sekcji 2.
- Usunąć medium i zainfekować komórki minimalną objętością przy MOI równym 1 lub przy najwyższym MOI, który nie powoduje tworzenia cząsteczek wadliwych interferujących (DI) dla badanego wirusa.
- Po 30–60 minutach infekcji odessać inokulum i dwukrotnie przemyć PBS, następnie dodać świeże medium uzupełnione mutagenem w odpowiednich stężeniach.
- Inkubować przez okres czasu określony w sekcjach 1 i 2, który odpowiada maksymalnemu mianowi wirusa w tych warunkach. Zebrać wirusy potomne.
- Oznaczyć miano wirusa po każdym pasażu i powtórzyć trzy poprzednie kroki.
- Podczas pierwszych kilku pasaży miana wirusa w próbkach traktowanych mutagenem powinny odpowiednio spaść w porównaniu z pierwotnym mianem wirusa oraz mianami wirusa kontrolnego (nie traktowanego i niepasażowanego). Jeśli miana wirusa w próbkach pasażowanych z mutagenem powrócą do poziomu kontroli nietraktowanej, populacja prawdopodobnie zawiera wariant odporny na mutagen. Może być wymaganych do 20 lub 30 pasaży, choć większość naszych wariantów wierności wyizolowano między 5 a 15 pasażem.
- Gdy miana wirusa dla danej serii pasażowej osiągną taką samą wartość jak miana kontroli nietraktowanej, wyekstrahować RNA ze wszystkich próbek, w tym z kontroli nietraktowanej z tego samego numeru pasażu. Można zastosować zestawy do ekstrakcji RNA lub ekstrakcję Trizol.
- Przeprowadzić RT-PCR z użyciem starterów amplifikujących geny polimerazy lub replikazy interesującego wirusa. W drugim kroku należy zsekwencjonować cały genom (przynajmniej regiony kodujące), aby sprawdzić, czy fenotypy odporności mapują się również na inne geny wirusa. Jest to szczególnie istotne w przypadku mutagenów będących analogami zasad, takich jak rybawiryna, która wpływa na inne aspekty funkcji wirusa i komórki. W takim przypadku wariant może być odporny na jedną z tych innych aktywności przeciwwirusowych i nie będzie wariantem wierności.
- Oczyścić produkty RT-PCR za pomocą zestawu do oczyszczania PCR i zsekwencjonować w celu uzyskania sekwencji konsensusu populacji odpornej na mutagen. Uwzględnić kontrole tła dla błędów sekwencjonowania (patrz Dyskusja).
- Przy użyciu oprogramowania do dopasowania sekwencji i sekwencji konsensusu wirusa jako referencji, dopasować sekwencje. Zidentyfikować nowe mutacje punktowe, zwracając szczególną uwagę na te, które pojawiają się wyłącznie w populacji traktowanej mutagenem w pasażu, w którym miana wirusa osiągają poziomy normalne. Jeśli mutacja ta nie występuje w wcześniejszych pasażach i nie występuje w kontrolach nietraktowanych z tego samego numeru pasażu (co wskazywałoby na adaptację do pasażowania w hodowli komórkowej), to mutacja ta jest prawdopodobnie odpowiedzialna, przynajmniej w części, za odporność na mutagen. Nie polegać wyłącznie na sekwencji odczytanej (wersja tekstowa sekwencji) i oprogramowaniu do dopasowania. Sprawdzić chromatogramy pod kątem mniejszych pików, które mogły zostać pominięte przez oprogramowanie. Mutant reprezentujący 20–30% całkowitej populacji nadal będzie widoczny jako pik, ale zbyt mały, aby został zidentyfikowany jako „N” podczas standardowej analizy sekwencji.
4. Po zidentyfikowaniu mutacji należy wyizolować lub wygenerować wariant i potwierdzić fenotyp oporności na kilka mutagenów RNA
Następnie izoluje się wariant wykazujący zidentyfikowaną mutację, aby potwierdzić jego powiązanie z fenotypem oporności. Kluczowe jest, aby mutację podejrzewaną o zmianę wierności badano w czystym genetycznie tle (czyli takim, które nie wykazuje dodatkowych mutacji w innych miejscach genomu). W optymalnej sytuacji dostępny jest zakaźny klon cDNA, który umożliwiłby wygenerowanie zapasu wariantu opornego na mutagen poprzez mutogenezę celowaną w czystym tle genetycznym. W takim przypadku sekcja 4 nie jest konieczna. Jeśli jednak klon cDNA nie jest dostępny, izolację można przeprowadzić poprzez oczyszczanie wirusa metodą plackową, opisaną poniżej. Aby wyizolować wariant w czystym tle genetycznym, może być wymagane więcej niż jedna runda oczyszczania plackowego.
- Izolacja mutanta opornego na mutagen za pomocą testu plackowego.
- Aby wyizolować zidentyfikowanego mutanta, należy przeprowadzić standardowy test plackowy z warstwą agarozy (końcowe stężenie 0,5 do 1% masa/objętość) w płytkach 6-dołkowych. Przygotować rozcieńczenia seryjne wirusa, w oparciu o miana zapasów, tak aby uzyskać od 10 do 50 dobrze oddzielonych placków.
- Gdy placki staną się wyraźnie widoczne (zwykle od 2 do 5 dni po infekcji, w zależności od wirusa), należy zaznaczyć położenie placków na płytkach, a następnie za pomocą pipety p20 z końcówką z filtrem delikatnie wbić końcówkę przez warstwę agarozy, uważając, aby nie przesunąć ani nie zdezorganizować położenia warstwy (co mogłoby doprowadzić do kontaminacji krzyżowej poszczególnych placków).
- Ostrożnie wyjąć końcówkę z agarozy i przenieść zawarty w niej korek agarozy do probówki typu Eppendorf zawierającej 250 μl medium, a następnie wymieszać na wortexie. Nie należy się niepokoić, jeśli wyjęta końcówka nie zawiera agarozy; w przypadku wielu wirusów RNA średni plack zawiera 105 wirusów, a wystarczająca ilość zostanie przeniesiona samym dotknięciem końcówki powierzchni placka.
- Wybrać do 10 placków na każdą próbę z mutagenem. W zależności od chromatogramów sekwencjonowania, które pozwoliły zidentyfikować mutację, należy oszacować, jaki procent populacji zawiera pożądaną mutację. Celem jest wyizolowanie trzech lub czterech placków z tą mutacją. Niektóre z tych mutantów będą posiadać również dodatkowe, niepożądane mutacje, które zostaną później zidentyfikowane poprzez sekwencjonowanie.
- Wyekstrahować RNA z tych próbek (zachowując połowę próbki do przygotowania większego zapasu wirusa) i przeprowadzić reakcje RT-PCR, które umożliwią sekwencjonowanie całego genomu. Średnio wirusy RNA będą posiadać do dwóch różnic mutacyjnych w stosunku do sekwencji konsensus; dlatego należy sekwencjonować po 3 lub 4 wirusy oczyszczone z placków jednocześnie, aby zidentyfikować izolat zawierający pożądaną mutację bez żadnych dodatkowych mutacji.
- Po zidentyfikowaniu należy przygotować większy zapas tego wirusa do wszystkich dalszych badań, wykorzystując powyższą próbkę oczyszczoną z placków do zainfekowania większej kolby z komórkami, np. 8x106 komórek HeLa w kolbie T75.
- Potwierdzenie wrażliwości/oporności na mutagen nadanej przez zidentyfikowaną mutację.
- Używając wyizolowanego lub nowo wytworzonego klonu oraz wirusa kontrolnego typu dzikiego przygotowanego w podobnych warunkach, należy powtórzyć eksperymenty opisane w sekcji 2, stosując pełen zakres stężeń mutagenu lub stężenie, przy którym wygenerowano mutację oporności.
- Należy zastosować kilka różnych warunków mutagenu RNA (ribawiryna, 5-fluorouracyl, 5-azacytydyna, zwiększone stężenie Mg2+, Mn2+). Jeśli wariant polimerazy jest oporny na więcej niż jeden rodzaj mutagenu, bardziej prawdopodobne jest, że wariant ten charakteryzuje się wysoką wiernością (high fidelity). Alternatywnie, możliwe jest, że mutacja oporności jest specyficzna dla pojedynczego warunku mutagennego, szczególnie że niektóre z tych związków wpływają na wirusy RNA poprzez szereg różnych mechanizmów 8.
5. Sprawdzenie szybkości replikacji
Ponieważ mutacje zmieniające wierność najczęściej mapują się na polimerazę, istnieje możliwość, że ta sama mutacja polimerazy znacząco zmieni kinetykę replikacji; dlatego istotne jest określenie podobieństw i różnic w replikacji, co pozwoli na lepsze porównanie różnic w częstotliwościach mutacji przeprowadzonych poniżej. Aby to osiągnąć, należy zbadać replikację za pomocą co najmniej dwóch komplementarnych podejść – jednego badającego produkcję wirusa oraz drugiego badającego syntezę RNA.
- Jednokrokowy wzrost kinetyki wirusa
- Dzień przed eksperymentem wysiać komórki na płytki 6-dołkowe zgodnie z zapotrzebowaniem, stosując jedną płytkę na każdy badany punkt czasowy. Zaleca się stosowanie trzech powtórzeń w dołkach dla każdego mutanta oraz wirusa typu dzikiego.
- W dniu eksperymentu usunąć medium i zainfekować studzienki każdym z wirusów z MOI wynoszącym 10, aby zapewnić jednoczesną infekcję każdej komórki. Inkubować przez 30–60 minut w 37°C.
- Wstrząsać płytki co 10 minut, aby zapobiec wysychaniu monowarstwy komórek. Usunąć wirusa i przemyć dwukrotnie 2 ml PBS. Ważne jest, aby usunąć jak największą ilość inokulatu. Uzupełnić pożywką wzrostową.
- Po przeprowadzeniu infekcji w czasie t=0, pobierz wirusa z jednej płytki. Zwróć płytki do inkubatora i pobieraj wirusy w regularnych odstępach czasu obejmujących jeden cykl replikacyjny (np. po 3 h, 5 h, 7 h, 9 h, 12 h, 24 h).
- Oznacz miano wirusa zebranego w każdym punkcie czasowym (np. testem plackowym, TCID50, testem FFU) i przedstaw na wykresie krzywe wzrostu miana w funkcji czasu.
- Kinetyka syntezy RNA
Kinetykę syntezy RNA można monitorować, stosując jedno z poniższych podejść. Jeśli to możliwe, do pomiaru poziomów RNA należy wykorzystać te same próbki, które posłużyły do wyznaczenia kinetyki wzrostu jednokrokowego.- qRT-PCR. Procedura ta pozwala na uzyskanie wysoce ilościowych pomiarów replikacji w szerokim zakresie, od kilku kopii genomu do >1010, w zależności od czułości analizy. Zaprojektować primery i sondy obejmujące niewielki fragment (<20 bp) wysoce konserwowanego regionu genomicznego.
- Analiza Northern blot. Chociaż technika ta jest mniej ilościowa niż qRT-PCR, pozwala na wizualne potwierdzenie, że replikacja prowadzi do powstania pełnowymiarowych genomów i że w wyniku mutacji polimerazy nie dochodzi do istotnego przerwania łańcucha.
- Ekspresja genu reporterowego. Jeśli dostępny jest klon cDNA wykazujący ekspresję genu reporterowego (np. lucyferazy), można go wykorzystać jako substytut do badania zdolności replikacyjnych. Jednakże rekombinantowy wirus nie powinien być stosowany w innych zastosowaniach (takich jak wyznaczanie częstości mutacji), ponieważ presje selekcyjne działające na ten wirus nie będą być takie same, w szczególności ze względu na tendencję tych wirusów do delecji wstawionego genu reporterowego.
6. Pomiar częstości mutacji
Jest to krytyczny krok w potwierdzeniu, że zidentyfikowana mutacja polimerazy nadająca oporność na mutagen zmienia wierność replikacji. Należy zauważyć, że mierzone tutaj częstości mutacji nie są szybkościami mutacji. Aby wyznaczyć szybkości, należy uwzględnić bardzo precyzyjny pomiar kinetyki replikacji (ilość syntetyzowanego RNA i długość cyklu replikacyjnego). Jednak pomiar częstości mutacji, o ile monitorowana jest historia pasażowania i kinetyka replikacji, pozwala na uzyskanie powtarzalnych, ilościowych pomiarów wierności replikacji. Częstości mutacji można wyznaczać zarówno w populacji wirusa zdolnego do replikacji (klony z placków lub poprzez rozcieńczenia ograniczające), jak i w całkowitej populacji wirusa (stock wirusa lub nadpłyn). Aby wyznaczyć częstości mutacji, należy przygotować stocki wirusa z późniejszego pasażu (np. pasaż 2 lub późniejszy). Ważne jest, aby populacja wirusa miała czas na zwiększenie różnorodności genetycznej w kierunku równowagi między mutacją a selekcją.
- Częstość mutacji w populacji wirusa żywotnego
To podejście, choć bardziej pracochłonne, dostarcza informacji o tym, ile mutacji występuje średnio w genomie zachowującym zdolność do replikacji. Należy jednak zauważyć, że wystąpi stronniczość w stronę wariantów o wyższym dopasowaniu (fitness), a warianty żywotne o niższym dopasowaniu, które na przykład nie tworzą łatwo placków, mogą nie zostać wykryte. W związku z tym metoda ta pozwala również na lepsze pomiary synonimicznych (dS) i niesynonimicznych (dN) substytucji nukleotydowych, które mogą być wykorzystane do zbadania, czy w populacji zachodzi selekcja pozytywna. Jednak ze względu na to, że kwantyfikowanych będzie mniej mutacji, do analizy statystycznej będzie potrzebna większa liczba sekwencji. Technika ta opiera się na izolacji pojedynczych wirusów poprzez oczyszczanie plackowe lub rozcieńczanie ograniczające, jak opisano powyżej. Jako punkt wyjścia zalecamy izolację 48 pojedynczych „klonów” wirusa typu dzikiego oraz wariantu odpornego na mutagen. Oczekuje się, że każda populacja klonalna wyizolowana w ten sposób będzie przenosić każdą mutację, którą posiadał genom założycielski. Ilość RNA obecna w wyizolowanym placku lub studzience rozcieńczenia ograniczającego jest zazwyczaj wystarczająca do amplifikacji metodą RT-PCR. W razie potrzeby można zastosować krótką amplifikację (mniej niż jeden cykl replikacyjny) na minimalnej liczbie komórek (np. w formacie płytki 24-dołkowej), aby uzyskać więcej RNA; należy jednak przeprowadzić minimalną amplifikację, aby uniknąć akumulacji nowych mutacji. Należy pamiętać, że każdy klon i populacja poddawana porównaniu muszą przejść taką samą liczbę cykli replikacyjnych.- Wyizolować od 24 do 48 klonów wirusa poprzez oczyszczanie plackowe lub rozcieńczanie ograniczające.
- Wyekstrahować RNA z wyizolowanych populacji klonalnych.
- Przeprowadzić amplifikację RT-PCR fragmentu o długości do 3kb dla każdej próbki. Najlepiej objąć region białek strukturalnych, który ma tendencję do tolerowania większej liczby żywotnych mutacji niż bardziej konserwatywne regiony genów niestrukturalnych.
- Oczyścić produkty PCR, przeprowadzić sekwencjonowanie i analizę mutacji (rozdział 7).
- Częstość mutacji w całkowitej populacji wirusa
Zaletą tej drugiej metody jest to, że w sekwencjonowaniu zostaną uwzględnione nawet warianty o niskim dopasowaniu, co pozwala na uzyskanie szerszego obrazu spektrum mutacji. Może ona jednak nie być idealna do analiz filogenetycznych zakładających populacje wirusa żywotnego (np. wartości dN/dS) oraz do identyfikacji najważniejszych mutacji, ponieważ zmiany letalne (zmieniona struktura RNA, kodony stop, drastyczne zmiany aminokwasowe) nie mogą być w pełni zidentyfikowane i pozostałyby w analizie. Niemniej jednak technika ta pozwala badaczowi uzyskać najbardziej istotne statystycznie dane w celu potwierdzenia zmiany wierności replikacji w przypadku braku biochemicznego testu in vitro. Technika ta opiera się na amplifikacji RT-PCR całkowitego RNA wirionów, w tym genomów z mutacjami o niskim dopasowaniu lub mutacjami letalnymi, które nie tworzą placków. Częstości mutacji uzyskane tą metodą mogą być 10-krotnie wyższe niż w przypadku klonowania metodą plackową lub rozcieńczenia ograniczającego.- Wyekstrahować RNA z całkowitej populacji wirionów.
- Przeprowadzić amplifikację RT-PCR regionu od 800 do 120 nukleotydów z części kodującej sekwencji genomowej, o której wiadomo, że toleruje mutacje i wykazuje zmienność genetyczną (np. białka strukturalne). Większe fragmenty nie będą łatwo wstawiane do wektorów klonujących, takich jak TopoTA, i wyprodukują niewystarczającą liczbę transformantów. Chociaż mniejsze fragmenty są jeszcze lepsze, zakres zsekwencjonowanego genomu może być zbyt mały, aby uzyskać istotność statystyczną. Fragment o długości co najmniej 80 bp pozwala na pokrycie sekwencji za pomocą dwóch starterów i stanowi dobry kompromis między maksymalizacją zakresu sekwencji a minimalizacją kosztów sekwencjonowania. Stwierdziliśmy, że od 70 do 10 sekwencji obejmujących region 80 nukleotydów w sposób powtarzalny potwierdza zmienioną wierność wariantów badanych w naszym laboratorium. Należy zauważyć, że można z równą skutecznością stosować inne metody wektorowe/klonowania.
- Oczyścić produkt RT-PCR za pomocą komercyjnego zestawu lub standardowej ekstrakcji/precypitacji DNA.
- Jeśli używane enzymy RT-PCR nie wytwarzają nawisów A, przeprowadzić 10-minutową elongację, dodając 1 μM ATP i polimerazę Taq.
- Przeprowadzić klonowanie TopoTA zgodnie z instrukcjami producenta.
- Dla każdej badanej populacji wirusa wybrać 96 kolonii zidentyfikowanych jako posiadające pozytywny insert za pomocą selekcji niebiesko-białej na płytkach powlekanych XGal. Początkowo sprawdzić obecność insertów dla każdego klonowanego regionu genomu, aby potwierdzić poprawność selekcji niebiesko-białej poprzez badanie wielkości plazmidu na żelach agarozowych lub PCR pojedynczych kolonii. Przy zastosowaniu powyższych warunków i wielkości fragmentu uzyskujemy 90% wyników pozytywnych.
- Hodować każdą kolonię w pożywce płynnej przez noc w 1 ml pożywki LB w 96-dołkowych płytkach do hodowli bakteryjnej.
- Następnego dnia przygotować miniprepy w formacie 96-dołkowym.
- Zsekwencjonować każdą płytkę, używając wystarczającej liczby starterów (na przykład starterów użytych do RT-PCR lub starterów m13 TopoTA), aby uzyskać maksymalne pokrycie sklonowanego segmentu. Przeprowadzić analizę mutacji (rozdział 7).
7. Analiza sekwencji
Przeprowadź analizy sekwencji, wykorzystując sekwencję referencyjną lub konsensusową dla każdej populacji oraz odpowiednie oprogramowanie do dopasowania sekwencji. Rekomendujemy programy Lasergene lub Sequencher, które pozwalają na szybką identyfikację SNP w odniesieniu do konsensusu.
- Wyrównaj sekwencje przy użyciu odpowiedniego oprogramowania (np. Lasergene lub Sequencher).
- Odrzuć sekwencje słabej jakości (błędne odczyty zasad, zbyt wiele „N” lub zbyt krótka długość). Zidentyfikuj zakres nukleotydowy pokryty przez wszystkie sekwencje. Ponieważ różne regiony genomu w różnym stopniu tolerują mutacje, dla celów porównawczych niezbędne jest, aby ten sam region był w pełni pokryty dla każdego klona poddanego sekwencjonowaniu i zatrzymanego do analizy. W związku z tym, jeśli dla jednego klona wykonano kilka reakcji sekwencjonowania i jedna z nich nie powiodła się, należy odrzucić ten klon (wszystkie jego sekwencje) z analizy.
- Zidentyfikuj i policz SNP, które różnią się od szczepu referencyjnego.
- Oblicz częstotliwość mutacji, dzieląc całkowitą liczbę zidentyfikowanych SNP przez całkowitą liczbę zsekwencjonowanych nukleotydów (liczba klonów x długość zsekwencjonowanego regionu). Przedstawienie tej wartości jako średniej liczby mutacji na 10K nt zsekwencjonowanych sprawia, że liczba ta jest bardziej czytelna niż podawanie jej na pojedynczy nukleotyd. Na przykład dla populacji typu dzikiego w Tabeli 1: 5 mutacji/121 978 całkowitych nukleotydów X 10 0 = 4,51 mutacji na 10 0 zsekwencjonowanych nukleotydów.
- Jeśli ten sam SNP występuje w dużej liczbie klonów, przedstaw dwie wartości: uwzględniającą oraz wykluczającą te powtórzone mutacje. Zazwyczaj w przypadku populacji wirusa pochodzącej od jednorodnego rodzica (poprzez puryfikację plamą lub z klona infekcyjnego) i pasażowanej zaledwie kilka razy w hodowli komórkowej, selekcja pozytywna nie wywarła wystarczającego wpływu, aby spowodować akumulację tego samego SNP, a wartości częstotliwości mutacji mierzone w ten sposób lepiej odzwierciedlają częstotliwość błędów polimerazy przy minimalnym wpływie selekcji pozytywnej lub oczyszczającej.
- Określ rozkład mutacji. Stwórz listę rankingową liczby klonów w każdej populacji, które wykazują 0, 1, 2, 3 itd. mutacji w zsekwencjonowanym regionie.
- Oblicz różnorodność populacji wirusa poprzez porównanie dystansu parzystego. Z oczyszczonych i ręcznie edytowanych sekwencji przygotuj wyrównanie zawierające region referencyjny. Dostępnych jest kilka programów do wyrównywania: ClustalW/X (http://www.clustal.org/), MUSCLE (http://www.drive5.com/muscle/), EbioX dla użytkowników Mac (http://www.ebioinformatics.org/ebiox/) itp. Upewnij się, że wszystkie sekwencje mają tę samą długość; w razie potrzeby je przytnij. Zaleca się, aby początek sekwencji stanowił kodon kodujący, co ułatwi późniejszą analizę. Sugerujemy przechowywanie wszystkich wyrównań w formacie fasta, który jest łatwo odczytywany przez większość dostępnego oprogramowania.
- Aby przeprowadzić analizę dystansu parzystego, oblicz wszystkie możliwe porównania parzyste między sekwencjami należącymi do tej samej populacji. Następnie można obliczyć średnią liczbę mutacji znalezionych w porównaniach, aby określić heterogeniczność populacji.
- Wartości dla mutacji synonimicznych (dS) i niesynonimicznych (dN) w obrębie populacji można łatwo uzyskać. Do tego rodzaju analizy uważamy oprogramowanie MEGA (http://www.megasoftware.net/) za użyteczne i przyjazne dla użytkownika.
- Aby określić kierunek selekcji, proponujemy dwie możliwości, choć nie są one jedynymi dostępnymi. 1) Oblicz stosunek dN do dS. Wartości wyższe niż 1 oznaczają selekcję pozytywną. Wartości niższe niż 1 oznaczają selekcję oczyszczającą. 2) Skorzystaj z serwera internetowego Datamonkey (http://www.datamonkey.org/). Prześlij wyrównania w formacie fasta i przeanalizuj je za pomocą modułu SLAC. Pozwoli to na oszacowanie dN/dS.
- Przeprowadź analizy statystyczne. W zależności od ilości danych i liczby sekwencji można zastosować różne testy. Niektóre badania opierały się na testach chi-kwadrat całkowitej liczby mutacji w stosunku do całkowitej liczby nukleotydów konsensusowych, gdzie wszystkie klony zostały połączone 9. Inne badania przeprowadzały dokładny test Fishera, obliczany na podstawie liczby sekwencji wykazujących mutacje w stosunku do liczby sekwencji bez mutacji 10. Jeśli wygenerowano wystarczającą ilość danych mutacyjnych, zalecamy wykonanie testu sumy rang, takiego jak test U Manna-Whitneya. Aby to zrobić, uszereguj liczbę klonów w każdej populacji wirusa według liczby mutacji obecnych w każdym zsekwencjonowanym RNA. Test Manna-Whitneya pozwoli wówczas sprawdzić różnice w rozkładzie mutacji w populacjach. Z tego powodu zalecamy sekwencjonowanie co najmniej 80 par zasad, aby zwiększyć prawdopodobieństwo znalezienia klonów z wieloma mutacjami. Test ten jest odporny, ale wymaga większych prób. Z drugiej strony nie wymaga on tej samej liczebności prób dla dwóch porównywanych populacji (np. próby z Tabeli 1 to n1=148 i n2=84).
8. Reprezentatywne wyniki:
Zależny od dawki efekt stężenia mutagenu na żywotność komórek i żywotność wirusa przedstawiono na Rysunku 1. W tym przykładzie stwierdzono, że pasaż wirusa w 10 μM AZC spowodował obniżenie miana wirusa o założone 10,5-2 log, natomiast żywotność komórek HeLa nie została negatywnie dotknięta podczas 2 dni wymaganych do infekcji wirusowej. Ten eksperyment pilotażowy doprowadził do wyboru stężenia 10 μM AZC do pasażowania seryjnego wirusa w celu selekcji oporności na mutagen. Rysunek 2 ilustruje początkowy spadek miana, a następnie pojawienie się fenotypu opornego na mutagen. Podczas pierwszych kilku pasaży w obecności mutagenu, w miarę kumulacji letalnych mutacji, następuje znaczny spadek miana wirusa. Stopniowo pojawia się wariant oporny na mutagen, a jego wystąpienie zbiega się z powrotem do miana wirusa nieodróżnialnego od kontroli nieleczonych. Na tym etapie duży odsetek populacji wirusa wykazuje mutację oporności. Sekwencjonowanie tej populacji wirusa ujawnia odpowiedzialną za to zmianę (lub zmiany) aminokwasową. Po zidentyfikowaniu, wyizolowaniu lub nowym wygenerowaniu, wirus oporny na mutagen może być mniej wrażliwy niż typ dziki na różne mutageny RNA (na przykład analogi zasad o różnej strukturze). Rysunek 3 przedstawia opornego na mutageny RNA wirusa Coxsackie B3, którego miana są wyższe niż w przypadku typu dzikiego w obecności rybawiryny, 5-fluorouracylu i 5-azacytydyny oraz wysokich stężeń MgCl2 i MnCl2. Szeroka oporność na mutageny RNA jest silnym wskaźnikiem zwiększonej wierności replikacji. Weryfikacja, czy kinetyka replikacji wariantu o wysokiej wierności jest podobna do wirusa typu dzikiego, pomoże w porównaniu częstości mutacji. Rysunek 4 przedstawia kinetykę wzrostu jednokrokowego wariantu o wysokiej wierności w porównaniu z typem dzikim. Jeśli tempo replikacji i miana końcowe nie są podobne, należy podjąć kroki w celu porównania populacji wirusów o podobnej wielkości, które przeszły tę samą liczbę rund replikacji. Związek między tempem syntezy RNA a wiernością replikacji nie jest dobrze scharakteryzowany, szczególnie in vivo. Wolniejsze tempo replikacji może skutkować zmniejszoną częstością mutacji (wyższą wiernością), choć nie jest to reguła absolutna, co pokazano na Rysunku 4. Po ustaleniu powyższych parametrów można porównać częstości mutacji populacji wariantu o wysokiej wierności i typu dzikiego, aby uzyskać genetyczne potwierdzenie zmienionej wierności replikacji. Rysunek 5 przedstawia dopasowanie sekwencji typu dzikiego i wariantu o wysokiej wierności z zidentyfikowanymi mutacjami punktowymi. Mutacje są liczone, szeregowane według liczby mutacji na klon (Tabela 1) i przedstawiane jako średnia częstość mutacji na populację na 10 0 zsekwencjonowanych nukleotydów, Rysunek 6.
Rysunek 1. Wyznaczanie optymalnych warunków selekcji w kierunku oporności na mutageny RNA: utrzymanie wysokiej żywotności komórek przy umiarkowanym spadku miana wirusa (o 1–2 log). Komórki HeLa poddano działaniu wskazanych stężeń rybawiryny i zainfekowano wirusem Coxsackie B3 typu dzikiego z wielokrotnością infekcji (MOI) wynoszącą 0,01. 48 godzin po infekcji zebrano wirusy potomne, a miana określono metodą TCID.50Procent komórek przeżywających traktowanie po 48 godzinach, określony za pomocą barwienia błękitem trypanowym, wskazano poniżej osi x. Wyniki pokazują, że stężenia 10 i 200 μM zredukowano miana wirusa o 1–2 log, bez wpływu na żywotność komórek.
Rycina 2. Pasaże seryjne w obecności umiarkowanych stężeń mutagenów RNA prowadzą do selekcji populacji opornych na mutageny. Na tej rycinie wirus Chikungunya był pasażowany w komórkach HeLa w obecności 50 μM ribawiryna (szare słupki). Pasaże kontrolne przeprowadzono w obecności rybawiryny (czarne słupki). Po każdym pasażu ilość potomstwa wirusa określono za pomocą klasycznego testu plackowego na komórkach BHK. Efekt mutagenny jest widoczny podczas pierwszych pasaży (p1 i p2 w porównaniu z populacją wyjściową p0), w których miana wirusa poddanego działaniu leku spadły o 2 log. Stopniowo miana powróciły do poziomu normalnego (nieleczonego). W piątym pasażu nie zaobserwowano istotnych różnic między populacjami poddanymi działaniu mutagenu a nieleczonymi, co sugeruje selekcję wariantów opornych. Rzeczywiście, sekwencjonowanie konsensusowe populacji pozwoliło zidentyfikować unikalne mutacje w populacji wirusa poddanej leczeniu rybawiryną.
Rycina 3. Potwierdzenie szerokiej oporności na mutageny RNA o różnej strukturze. Przedstawiony tutaj wariant A372V wirusa Coxsackie B3 o wysokiej wierności, który został pierwotnie wyizolowany podczas przesiewu opisanego w sekcji 3, został wygenerowany z klonu zakaźnego i przetestowany pod kątem względnej wrażliwości na różne stężenia różnych mutagenów RNA (rybawiryny, 5-fluorouracylu, 5-azacytydyny). Komórki HeLa poddano działaniu wskazanych stężeń rybawiryny i zakażono wirusem Coxsackie B3 typu dzikiego przy MOI wynoszącym 0,01. 48 godzin po zakażeniu pobrano wirusy potomne i określono miana za pomocą metody TCID50Przedstawiono tutaj miana typu dzikiego (linie ciągłe) oraz wariantu A372V (linie przerywane) w funkcji stężenia mutagenu. Miana A372V są konsekwentnie wyższe niż w przypadku typu dzikiego we wszystkich badanych warunkach.
Rysunek 4. Szybkości replikacji i warianty wierności. W celu wyznaczenia kinetyki wzrostu jednokrokowego produkcji wirusa, komórki HeLa zainfekowano z MOI = 10 szczepem dzikim (linia ciągła), wariantem o wysokiej wierności A372V (długie kreski) lub wariantem z zaburzoną replikacją Cx64 (krótkie kreski) wirusa Coxsackie B3. W określonych punktach czasowych potomstwo wirusa pobrano z komórek i supernatantów poprzez cykle zamrażania i rozmrażania, a następnie oznaczono miareczką TCID50Wzrost wierności replikacji wariantu A372V nie wiąże się z obserwowalnym defektem replikacyjnym w hodowlach tkankowych. Wariant Cx64 wykazuje znaczące opóźnienie kinetyki replikacji i osiąga maksymalne miana 10 razy niższe niż w przypadku wirusa typu dzikiego.
Rysunek 5. Dopasowanie sekwencji sklonowanych metodą TopoTA z każdej populacji wirusów. Stosując podejście opisane w sekcji 7, każda sekwencja uzyskana z klonowanego produktu RT-PCR prawdopodobnie pochodzi z pojedynczego, unikalnego genomu w obrębie całkowitej populacji wirusa, a zatem niesie unikalne mutacje. Rysunek przedstawia typowe dopasowanie sekwencji po usunięciu sekwencji słabej jakości i wizualizacji SNP. Obliczono całkowitą liczbę SNP w populacji (10 na tym rysunku) i odnotowano liczbę SNP występujących w każdym klonie. Na przykład klon podkreślony paskiem zawiera 2 unikalne mutacje, podczas gdy 8 pozostałych klonów zawiera jedną unikalną mutację. Dane te służą do sporządzenia Tabeli 1. Aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku, należy kliknij tutaj.
Rycina 6. Graficzna reprezentacja częstości mutacji w populacjach wirusów. W celu łatwiejszej interpretacji dane liczbowe uzyskane z analiz sekwencyjnych i statystycznych można przedstawić w formie wykresu lub histogramu (pokazanego tutaj). Wirus A372V generuje mniej mutacji niż typ dziki i wykazuje znacznie niższą częstotliwość mutacji (*, p<0,01). Wariant Cx64, który replikuje się do mian 10 razy niższych niż typ dziki, wykazuje tę samą częstotliwość mutacji (ns, nieistotne statystycznie), co wskazuje na to, że szybkość i wierność replikacji niekoniecznie są ze sobą powiązane. Ta sama populacja wirusa Chikungunya (CHIKV) wykazuje podobne częstotliwości mutacji niezależnie od tego, czy analizowany jest materiał wirusowy, czy 105-krotne rozcieńczenie, stosowane do ekstrakcji RNA.
Podsumowanie rozkładu mutacji do analizy statystycznej.
Uwaga: W przypadku każdego klonu niezbędne jest, aby obejmowany był ten sam region genomowy (i długość sekwencji). W tym przypadku jest to 859 nukleotydów na klon. Jest to kluczowe dla analiz statystycznych. Z drugiej strony, testy sum rang stosowane w analizach statystycznych nie wymagają jednak identycznej liczebności prób, więc badacz może swobodnie porównywać populacje o różnej liczebności. Zatem 142 klony typu dzikiego mogą być porównywane z 84 klonami A372V.
| liczba klonów z n mutacjami | typ dziki | A372V |
| 7 mutacji | 0 | 0 |
| 6 mutacji | 0 | 0 |
| 5 mutacji | 0 | 0 |
| 4 mutacje | 0 | 0 |
| 3 mutacje | 1 | 0 |
| 2 mutacje | 6 | 2 |
| 1 mutacja | 40 | 14 |
| 0 mutacji | 95 | 68 |
| Suma mutacji | 5 | 18 |
| Suma zsekwencjonowanych klonów | 142 | 84 |
| Suma zsekwencjonowanych nukleotydów | 121,978 | 72,156 |
| Mutacje/104 nt | 4,51 | 2,49 |
Tabela 1. Podsumowanie rozkładu mutacji do analizy statystycznej. Uwaga: W przypadku każdego klonu niezbędne jest, aby objęto ten sam region genomowy (i tę samą długość sekwencji). W tym przypadku jest to 859 nukleotydów na klon. Jest to kluczowe dla analiz statystycznych. Z drugiej strony, testy sumy rang wykorzystywane w analizie statystycznej nie wymagają jednak jednakowej liczby próbek, zatem badacz może swobodnie porównywać populacje o różnej wielkości próby. W związku z tym 142 klony typu dzikiego można porównać z 84 klonami A372V.
Dyskusja
Wybór linii komórkowej. Skuteczność analogów zasad jako mutagenów RNA koreluje z ich względnym poborem przez różne typy komórek 11. Jeśli linia komórkowa zwykle stosowana do pasażowania wirusa okaże się oporna na pobór mutagenu lub zbyt wrażliwa (wysoka toksyczność komórkowa), konieczne może być zastosowanie innej linii komórkowej, która spełnia te wymagania i nadal jest dopuszczalna dla replikacji wirusa. Po wyizolowaniu wariantu opornego na mutagen, pozostałą część charakterystyki można przeprowadzić w oryginalnej, preferowanej linii komórkowej. W naszym doświadczeniu komórki HeLa łatwo pobierają mutagen; komórki BHK wymagają do 10-krotnie wyższych stężeń, a komórki Vero są oporne na pobór mutagenu.
Wybór mutagenu. Przy próbie izolacji wariantów wiernościowych poprzez traktowanie mutagenami, prawdopodobieństwo sukcesu wzrasta, jeśli zastosuje się więcej niż jeden rodzaj mutagenu. Mutageny będące analogami zasad o różnej strukturze, które są błędnie włączane do genomów podczas replikacji, będą indukować przede wszystkim specyficzny podzbiór mutacji w kolejnych cyklach replikacyjnych: traktowanie rybawiryną sprzyja mutacjom przejścia GdoA i CdoU 12; 5-azacytydyna wykazuje podobną tendencję, z dodatkiem transwersji CdoG i GdoC 13; 5-fluorouracyl preferencyjnie indukuje przejścia AtoG i UdoC 14. Alternatywnie, do pożywki można dodać wyższe stężenia Mg2+ lub Mn2+, aby zwiększyć ogólną częstość mutacji wirusów RNA bez opisywanej powyżej stronniczości 12. W zależności od sekwencji kodonów wirusa oraz zmian w kodonach wymaganych do wygenerowania wariantu wiernościowego, niektóre z tych warunków będą sprzyjać pojawieniu się tego konkretnego wariantu bardziej niż inne. W przypadku wariantów o wyższej wierności, poliovirus G64S i wirus Coxsackie A372V, traktowanie rybawiryną najskuteczniej pozwoliło na selekcję wariantów, ponieważ wymagane przejście AtoG w miejscu kodonu odpowiadało mutacjom generowanym głównie przez rybawirynę.
MOI a wielkość populacji. W wirusologii protokoły zakażania kultur tkankowych zwracają szczególną uwagę na wielokrotność zakażenia (MOI), aby na przykład uniknąć akumulacji wadliwych cząstek interferujących (niskie MOI) lub promować rekombinację między wirusami (wysokie MOI). Aby wyselekcjonować zdarzenia wyłaniania się nowych wariantów podczas seryjnego pasażowania, istotne jest również uwzględnienie wielkości populacji wirusa. Ponieważ mutant oporny występuje początkowo z niską częstotliwością, najlepiej jest przenosić jak największą populację z jednego pasażu do kolejnego (np. 105-106 wirusów), aby uniknąć utraty tych wyłaniających się wariantów przy każdym pasażu. Zwiększenie rozmiaru dołka lub kolby (liczby zakażonych komórek) może pomóc zminimalizować wzrost MOI, jeśli jest to kwestia problematyczna. Z drugiej strony, w eksperymentach badających wrażliwość wirusa na mutagen, przeprowadza się zakażenie przy niskim MOI, aby zwiększyć liczbę cykli replikacyjnych zachodzących w eksperymencie oraz uniknąć ratowania zmutagenizowanych genomów przez genomy o wyższej sprawności (fitness) poprzez komplementację w komórkach współzakażonych. Jest to ważne, ponieważ mutacje powstałe w genomach potomstwa podczas pierwszej rundy replikacji nie zostaną wykryte natychmiast. Większość tych zmutagenizowanych RNA zostanie nadal zapakowana do wirionów. Dopiero w kolejnej rundzie zakażenia mutacje letalne obecne w tych genomach spowodują przerwanie cyklu replikacyjnego i spadek miana wirusa. Może być konieczne dopuszczenie kilku rund akumulacji mutacji, zanim zaobserwuje się istotny efekt mutagenezy letalnej. Wreszcie, jeśli w serii pasażowań w obecności mutagenu miana wirusa stale spadają aż do całkowitego wygaśnięcia, badacz powinien spróbować pasażować wirusa w stopniowo zwiększanych ilościach mutagenu (zaczynając od bardzo niskiego stężenia).
Izolacja i generowanie klonu opornego na mutageny RNA z populacji opornej na mutageny RNA. Mutageny RNA wprowadzają liczne, losowe mutacje do każdego genomu, jednak selekcja w kierunku oporności wzbogaci (i utrwali w sekwencji konsensusowej) jedynie mutację odpowiedzialną za oporność. Aby zidentyfikować tę mutację, sekwencjonujemy populację oporną na mutageny (konsensus populacji), a nie poszczególne wirusy. W konsekwencji pojedyncze, losowe mutacje wywołane przez mutagen nie są wykrywane w sekwencji; odnajduje się jedynie te mutacje, które prowadzą do zmian w konsensusie po selekcji. W naszym doświadczeniu identyfikujemy zazwyczaj tylko jedną lub dwie takie zmiany w sekwencji konsensusowej. Po uzyskaniu populacji opornej na mutageny i zidentyfikowaniu mutacji oporności konieczne jest wygenerowanie czystszego zapasu tego wariantu. Powyżej opisaliśmy procedurę oczyszczania metodą płytek (plaque purification). Alternatywnie, jeśli badany wirus nie tworzy łatwo identyfikowalnych płytek, pożądany wariant można oczyścić metodą rozcieńczeń ograniczających. Podejście to jest w istocie wyznaczeniem TCID50 w formacie 96-dołkowym, gdzie zapas wirusa jest rozcieńczany tak, aby zainfekowanych zostało mniej niż 50% dołków. Przy zastosowaniu tego rozcieńczenia stosuje się taką samą metodę jak opisano powyżej, izolując do 10 pojedynczych wariantów i potwierdzając ich sekwencje. Jak wspomniano, w najlepszych przypadkach dostępny jest infekcyjny klon cDNA szczepu wirusa. Wówczas izolacja wariantu nie byłaby konieczna. Z naszego doświadczenia wynika, że warianty wierności replikacji są wynikiem pojedynczych podstawień aminokwasowych i mogą być zatem generowane przy użyciu prostych, komercyjnych zestawów do mutogenezy, takich jak Quikchange (Agilent). Drugą opcją jest wykorzystanie klona cDNA blisko spokrewnionego szczepu. Jeśli jednak używany jest szczep pokrewny, zdecydowanie zalecamy zastosowanie zarówno tego podejścia, jak i izolacji wirusa (np. oczyszczania metodą płytek), ponieważ stwierdziliśmy, że ta sama mutacja zmieniająca wierność replikacji w dwóch blisko spokrewnionych wirusach niekoniecznie wywoła ten sam efekt.
Wierność i replikacja. Selekcja wariantów RNA odpornych na mutageny doprowadziła do wyizolowania wariantów o zarówno wyższej, jak i niższej wierności, których charakterystyka wzrostu jest podobna do ich odpowiedników typu dzikiego 4,12,15. Obecnie związek między szybkością aktywności polimerazy a wiernością nie jest w pełni zrozumiały. Badania biochemiczne in vitro z użyciem oczyszczonej polimerazy RNA wykazały, że warianty o wyższej wierności charakteryzują się wolniejszą szybkością przetwarzania, podczas gdy warianty o niższej wierności mają tendencję do szybszego przetwarzania 1-3,12. W hodowlach tkankowych różnice te zazwyczaj nie są widoczne, co sugeruje, że etapem ograniczającym tempo jest dostępność zasobów, a nie wewnętrzna kinetyka aktywności polimerazy. Jeśli wariant o określonej wierności replikuje się z kinetyką, która nie różni się znacząco od typu dzikiego, można bezpośrednio porównać częstotliwości ich mutacji. W przypadku wystąpienia bardzo znaczącej zmiany w kinetyce replikacji dane należy znormalizować, aby uwzględnić różnice kinetyczne, na przykład poprzez porównanie wirusów, które przeszły tę samą liczbę cykli replikacyjnych. W naszym doświadczeniu, mimo że nie zaobserwowano znaczących różnic w kinetyce wzrostu jednokrokowego między typem dzikim a wariantami o wysokiej wierności, zauważyliśmy, że warianty o wyższej wierności konsekwentnie osiągają wyższe miana (w granicach 1 log) w porównaniu z typem dzikim, ale produkują nieco mniej RNA (w tym samym rzędzie wielkości), co dodatkowo sugeruje, że produkowane przez nie genomy zawierają mniej mutacji i są zatem bardziej zakaźne.
Przygotowanie próbek i sekwencjonowanie. W każdym z etapów opisanych w niniejszych protokołach niezbędne jest stosowanie wysokowiernych enzymów z aktywnością egzonukleazy (proof-reading) do reakcji PCR i RT-PCR, aby ograniczyć wprowadzanie dodatkowych mutacji, których nie można odróżnić od mutacji istotnych biologicznie. Kluczowe jest, aby porównywane populacje wirusów były przygotowane w tych samych warunkach (historia pasażowania, pożywka do hodowli tkankowej, temperatura, metoda ekstrakcji RNA, protokoły RT-PCR itp.). Ważne jest również upewnienie się, że z ekstrakcji RNA uzyskano wystarczającą ilość materiału wyjściowego, tak aby w wyniku RT-PCR powstał wyraźny prążek. Rozcieńczenie próbki RNA 1/100 powinno również dawać wykrywalny prążek w RT-PCR, co wskazuje, że próbka zawiera wystarczającą liczbę cząsteczek RNA, aby uniknąć błędu reprezentatywności (wielokrotnej amplifikacji tego samego genomu). Ponieważ częstość mutacji jest rozkładem, można oczekiwać uzyskania podobnych wartości niezależnie od wielkości populacji, pod warunkiem, że nie występuje wspomniany błąd. Jak pokazano na rysunku 6, 105-krotne rozcieńczenie zapasu wirusa daje częstość mutacji, która nie różni się znacząco od zapasu wyjściowego.
Do czasu ustalenia optymalnych warunków klonowania TopoTA, obecność wstawek po selekcji niebiesko-białej należy potwierdzić za pomocą kolonialnej PCR przed sekwencjonowaniem. W celu kontroli szumu mutacyjnego (mutacji wprowadzonych podczas RT-PCR i sekwencjonowania) należy sklonować produkt PCR z plazmidu zawierającego tę samą sekwencję wirusową i/lub sklonować oraz zsekwencjonować produkty RT-PCR z RNA przetranskrybowanego in vitro, odpowiadającego genomowi wirusa (należy pamiętać, że różne enzymy do transkrypcji in vitro mają różny stopień błędów i mogą nie dostarczyć przydatnych informacji na temat rzeczywistego poziomu błędów tła w danej procedurze). Niektóre sekwencje wirusowe mogą być toksyczne dla bakterii, dlatego ważne jest zweryfikowanie tego faktu przed wyborem regionu genomu wirusa do sekwencjonowania w celu oznaczenia częstości mutacji. Podczas analizy sekwencji uzyskanych metodą TopoTA należy pamiętać, że każdy klon powinien zawierać tylko jedną wstawkę/sekwencję. Jeśli zaobserwowany zostanie podwójny piki, co sugeruje mieszaną populację, możliwe jest, że wybrano dwie sąsiadujące kolonie bakteryjne. Możliwe jest również, choć wysoce nieprawdopodobne ze względu na niską częstotliwość mutacji podczas replikacji bakteryjnej, że mutacja została wprowadzona podczas amplifikacji plazmidu w kulturze bakteryjnej. W populacjach oczyszczonych metodą plackową podwójny piki może reprezentować nakładające się placki lub wirusa, który nabywa nową mutację bądź ulega rewersji mutacji podczas rozwoju placka. Należy zachować konsekwencję i zdecydować, czy uwzględniać takie mutacje w obliczeniach, czy nie.
Na koniec należy pamiętać, że wykorzystane tutaj częstotliwości mutacji są wartościami względnymi. Są one poprawne wyłącznie przy porównywaniu populacji wirusów hodowanych w tych samych warunkach i sekwencjonowanych w tym samym regionie! Nie należy ich traktować jako bezwzględnych wartości tempa mutacji ani częstotliwości mutacji całego genomu. Niemniej jednak, przy kontrolowanych warunkach, pozwalają one na powtarzalne, ilościowe porównania różnic w rozkładzie i częstotliwości mutacji.
Oświadczenia
Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.
Podziękowania
Praca ta była wspierana finansowo z grantu Medical and Health Research przyznanego przez miasto Paryż, francuskiego grantu narodowego ANR-09-JCJC-0118-1 oraz grantu ERC Starting Grant RNAvirusPopDivNVax, projekt nr 242719.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| rybawiryna | Sigma-Aldrich | R9644-10MG | |
| 5-fluorouracyl | Sigma-Aldrich | F6627-1G | |
| 5-azacytydyna | Sigma-Aldrich | A2385-100MG | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M1028-100ML | |
| MnCl2 | Sigma-Aldrich | M1787 | |
| Błękit trypanu | Sigma-Aldrich | T8154-20ML | |
| zestaw do klonowania TopoTA | Invitrogen | 10351021 | |
| zestaw do mutagenezy Quikchange | Agilent Technologies | 200516 | Jeśli dostępny jest infekcyjny klon cDNA |
| zestaw do minipreparatyki w 96 dołkach | Macherey-Nagel | 740625 | |
| Lasergene, Sequencher | DNASTAR | www.dnastar.com www.genecodes.com | Lub inne oprogramowanie do dopasowania sekwencji |
Bibliografia
- Arias, A. Determinants of RNA-dependent RNA polymerase (in)fidelity revealed by kinetic analysis of the polymerase encoded by a foot-and-mouth disease virus mutant with reduced sensitivity to ribavirin. J Virol. 82, 12346-12355 (2008).
- Arnold, J. J., Vignuzzi, M., Stone, J. K., Andino, R., Cameron, C. E. Remote site control of an active site fidelity checkpoint in a viral RNA-dependent RNA polymerase. J Biol Chem. 280, 25706-25716 (2005).
- Korneeva, V. S., Cameron, C. E. Structure-function relationships of the viral RNA-dependent RNA polymerase: fidelity, replication speed, and initiation mechanism determined by a residue in the ribose-binding pocket. J Biol Chem. 282, 16135-16145 (2007).
- Pfeiffer, J. K., Kirkegaard, K. A single mutation in poliovirus RNA-dependent RNA polymerase confers resistance to mutagenic nucleotide analogs via increased fidelity. Proc Natl Acad Sci U S A. 100, 7289-7294 (2003).
- Pfeiffer, J. K., Kirkegaard, K. Increased fidelity reduces poliovirus fitness and virulence under selective pressure in mice. PLoS Pathog. 1, e11-e11 (2005).
- Vignuzzi, M., Stone, J. K., Arnold, J. J., Cameron, C. E., Andino, R. Quasispecies diversity determines pathogenesis through cooperative interactions in a viral population. Nature. 439, 344-348 (2006).
- Vignuzzi, M., Wendt, E., Andino, R. Engineering attenuated virus vaccines by controlling replication fidelity. Nat Med. 14, 154-161 (2008).
- Crotty, S., Cameron, C., Andino, R. Ribavirin's antiviral mechanism of action: lethal mutagenesis. J Mol Med. 80, 86-95 (2002).
- Coffey, L. L., Vignuzzi, M. Host alternation of chikungunya virus increases fitness while restricting population diversity and adaptability to novel selective pressures. J Virol. 85, 1025-1035 (2011).
- Ciota, A. T. Role of the mutant spectrum in adaptation and replication of West Nile virus. J Gen Virol. 88, 865-874 (2007).
- Ibarra, K. D., Pfeiffer, J. K. Reduced ribavirin antiviral efficacy via nucleoside transporter-mediated drug resistance. J Virol. 83, 4538-4547 (2009).
- Levi, L. I. Fidelity variants of RNA dependent RNA polymerases uncover an indirect, mutagenic activity of amiloride compounds. PLoS Pathog. 6, e1001163-e1001163 (2010).
- Sierra, S., Dávila, M., Lowenstein, P. R., Domingo, E. Response of foot-and-mouth disease virus to increased mutagenesis: influence of viral load and fitness in loss of infectivity. J Virol. 74, 8316-8323 (2000).
- Ruiz-Jarabo, C. M., Ly, C., Domingo, E., de la Torre, J. C. Lethal mutagenesis of the prototypic arenavirus lymphocytic choriomeningitis virus (LCMV). Virology. 308, 37-47 (2003).
- Sierra, M. Foot-and-mouth disease virus mutant with decreased sensitivity to ribavirin: implications for error catastrophe. J Virol. 81, 2012-2024 (2007).
Przedruki i uprawnienia
