Niniejszy artykuł opisuje kroki niezbędne do izolacji i charakterystyki wariantów polimerazy RNA o różnym stopniu wierności replikacji w przypadku wirusów RNA oraz sposób wykorzystania danych o częstotliwości mutacji do potwierdzenia zmian wierności w hodowlach tkankowych.
Artykuł metodologiczny
Izolacja wariantów wierności replikacji wirusów RNA i charakterystyka częstotliwości mutacji wirusa
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Wirusy RNA wykorzystują polimerazy RNA zależne od RNA do replikacji swoich genomów. Naturalnie wysoki wskaźnik błędów tych enzymów w dużym stopniu przyczynia się do generowania ogromnej różnorodności populacyjnej, co ułatwia adaptację i ewolucję wirusów. Coraz więcej dowodów wskazuje na to, że naturalne wskaźniki błędów i wynikające z nich częstotliwości mutacji wirusów RNA mogą być modulowane przez subtelne zmiany aminokwasowe w polimerazie wirusowej. Choć dla niektórych wirusowych polimeraz RNA istnieją testy biochemiczne umożliwiające ilościowy pomiar wierności inkorporacji, w niniejszej pracy opisujemy prostą metodę pomiaru częstotliwości mutacji wirusów RNA, która okazała się równie dokładna jak podejścia biochemiczne w identyfikacji mutacji zmieniających wierność. Podejście to wykorzystuje konwencjonalne techniki wirusologiczne i sekwencjonowanie, które mogą być przeprowadzone w większości laboratoriów biologicznych. W oparciu o nasze doświadczenia z wieloma różnymi wirusami zidentyfikowaliśmy kluczowe etapy, które muszą zostać zoptymalizowane, aby zwiększyć prawdopodobieństwo wyizolowania wariantów o zmienionej wierności i wygenerowania danych o istotności statystycznej. Izolacja i charakterystyka mutacji zmieniających wierność mogą dostarczyć nowych informacji na temat struktury i funkcji polimerazy1-3. Ponadto warianty te mogą być użytecznymi narzędziami w charakteryzowaniu mechanizmów adaptacji i ewolucji wirusów4-7.
Protokół
1. Określenie zakresu stężeń mutagenu, który jest minimalnie toksyczny dla komórek
Celem niniejszego ćwiczenia jest określenie zakresu stężeń mutagenu, które można zastosować podczas infekcji bez wywoływania nadmiernej toksyczności komórkowej. W istocie należy odtworzyć warunki, które będą wymagane do infekcji wirusowej. W przypadku większości wirusów infekcje trwają od 2 do 7 dni. Należy przygotować odpowiednią liczbę płytek, aby pobierać próbki komórek każdego dnia. W przypadku użycia komórek nieprzylegających należy odpowiednio zmodyfikować protokół.
- Dzień przed eksperymentem wysiać 7 x 105 komórek HeLa/do dołka w płytce 6-dołkowej, aby w dniu eksperymentu uzyskać subkonfluencyjną (75%) monowarstwę. Każdy dołek płytki zostanie poddany działaniu innej koncentracji mutagenu, co pozwoli na zastosowanie zakresu 6 stężeń.
- W dniu eksperymentu przygotować rozcieńczenia mutagenu w pożywce do hodowli tkankowych. Dla komórek HeLa zastosować zakres od 0 do 1000 μM dla analogów zasad (rybawiryna, 5-fluorouracyl, 5-azacytydyna), od 0 do 50 mM dla MgCl2 oraz od 0 do 5 mM dla MnCl2.
- Odssać pożywkę z dołków, zastąpić ją 2 ml pożywki z dodatkiem mutagenu i zwrócić płytkę do inkubatora.
- Co 24 godziny używać jednej płytki z komórkami do sprawdzenia żywotności komórek. Można to osiągnąć poprzez barwienie błękitem trypanu lub za pomocą komercyjnych testów fluorescencyjnych/luminescencyjnych (np. CellTiter-Glo® Luminescent Cell Viability Assay firmy Promega).
- W przypadku barwienia metodą wykluczania błękitu trypanu, odseparować komórki z jednej płytki (poddanej działaniu różnych stężeń mutagenu) i delikatnie osadzić komórki poprzez wirowanie.
- Odlać nadsącz i resuspenderć komórki w PBS (surowica może zakłócać barwienie).
- Zmieszać 1 objętość zawiesiny komórkowej w PBS z 1 objętością 0,4% błękitu trypanu i inkubować przez 2 minuty w temperaturze pokojowej.
- Za pomocą hemocytometru policzyć komórki żywe (niezabarwione) i nieżywe (zabarwione na niebiesko). Obliczyć procent żywych komórek dla każdego stężenia mutagenu, w tym dla kontroli nieleczonej. Uznajemy, że warunki skutkujące śmiercią mniej niż 50% komórek do momentu zakończenia infekcji (gdy osiągnięte zostaną maksymalne miana) są idealne do izolacji oporności na mutagen.
2. Wyznaczenie optymalnego, nietoksycznego stężenia mutagenu, które umiarkowanie obniża miana wirusa (redukcja o około 0,5-2 log)
Celem tego ćwiczenia jest określenie stężenia mutagenu, które wywrze silną presję selekcyjną, nie doprowadzając jednocześnie do nadmiernej mutagenezy populacji. W przypadku mutagenów RNA ustalono, że odpowiada to redukcji miana wirusa o 10,5-2 log. Przy takich stężeniach każdy genom ulega mutacji w co najmniej jednej lub dwóch pozycjach. Mutagen może wspomóc powstanie mutacji oporności, która zostanie następnie wyselekcjonowana w trakcie pasażowania. Jeśli wprowadzonych zostanie zbyt wiele mutacji (przy bardzo wysokich stężeniach mutagenu), mutanty niosące mutację oporności zostaną same poddane letalnej mutagenezie, co uniemożliwi ich izolację.
- Wysiać komórki na płytki, stosując te same warunki co w kroku 1
- W dniu eksperymentu przygotować rozcieńczenia mutagenu w pożywce do hodowli tkankowych. Należy zastosować ten sam zakres stężeń, który określono powyżej, z wyłączeniem stężeń, które spowodowały śmierć ponad 50% komórek. Przygotować wystarczającą ilość pożywki, aby dwukrotnie pokryć każde dołeczki (4 ml na dołeczkę), co umożliwi wstępną obróbkę komórek przed infekcją dla każdego stężenia mutagenu.
- Odssać pożywkę i poddać komórki wstępnej obróbce mutagenem poprzez inkubację w pożywce z dodatkiem mutagenu przez 2 godziny. Dla większości typów komórek jest to czas wystarczający do pobrania mutagenu.
- Usunąć pożywkę i zainfekować wirusem przy niskiej wielokrotności infekcji MOI (0,1 lub 0,01) w minimalnej objętości (200 μl dla płytek 6-dołkowych). Inkubować przez 15–60 minut, aby umożliwić zainfekowanie komórek przez wirusa. Kołysać płytką w regularnych odstępach czasu, aby upewnić się, że inokulum pokrywa monowarstwę komórek.
- Odssać inokulum wirusa i przemyć dwukrotnie 2 ml PBS, aby usunąć jak największą ilość inokulum.
- Dodać do każdej dołeczki pożywkę z odpowiednimi stężeniami mutagenu i inkubować komórki przez czas odpowiadający 3–6 cyklom replikacyjnym.
- Zebrać wirusa z każdej dołeczki i określić efekt przeciwwirusowy na miano wirusa. Można to zrobić za pomocą standardowego testu plackowego lub metody rozcieńczeń granicznych (TCID50). Uwaga: Ilościowe oznaczanie wirusa metodami mierzącymi wyłącznie syntezę RNA może być nieodpowiednie, ponieważ efekty mutagenne mogą nie zostać wykryte. Genomy poddane mutagenezie zawierające mutacje letalne mogą być nadal wykrywane np. za pomocą qRT-PCR, ale nie byłyby widoczne w testach żywotności wirusa.
- Na podstawie obliczonych mian zidentyfikować stężenie mutagenu, które obniża miana wirusa (w porównaniu z nieleczoną kontrolą infekcji) o 10,5–2 logi, a jednocześnie nie jest wysoce toksyczne dla komórek (idealnie toksyczność poniżej 50%).
3. Izolacja i identyfikacja wariantów odpornych na mutageny
Przeprowadź pasażowanie przy dużej wielkości populacji w optymalnym stężeniu mutagenu określonym powyżej i sprawdź miana wirusa w całej serii pasażowań. W ramach kontroli pasażuj wirusa w pożywce wzrostowej bez dodatku mutagenu. Jako kolejną kontrolę służącą do monitorowania potencjalnego pojawienia się defektywnych cząstek interferujących (DI), przeprowadzaj świeże infekcje w obecności mutagenu na każdym etapie pasażowania (kontrola niepasażowana).
- Dzień przed infekcją wysiać do kolb o powierzchni 25 cm2 1,5 x 106 komórek HeLa (można stosować kolby o innych rozmiarach), aby następnego dnia uzyskać monowarstwy poniżej pełnej konfluencji.
- W dniu infekcji poddać komórki 2-godzinnej obróbce wstępnej w medium zawierającym optymalne stężenie każdego mutagenu, określone w sekcji 2.
- Usunąć medium i zainfekować komórki minimalną objętością w MOI wynoszącym 1 lub w najwyższym MOI, który nie prowadzi do tworzenia cząsteczek defektywnych interferujących (DI) dla badanego wirusa.
- Po 30–60 minutach infekcji odessać inokulum i dwukrotnie przemyć PBS, a następnie dodać świeże medium uzupełnione mutagenem w odpowiednich stężeniach.
- Inkubować przez okres czasu określony w sekcjach 1 i 2, odpowiadający maksymalnemu mianrowi wirusa w tych warunkach. Zebrać wirusy potomne.
- Oznaczyć miano wirusa w każdym pasażu i powtórzyć 3 poprzednie kroki.
- Podczas pierwszych kilku pasaży miana wirusa w próbkach traktowanych mutagenem powinny odpowiednio spaść w porównaniu z pierwotnym mianem wirusa oraz mianami wirusa w kontroli (nietraktowanej i niepasażowanej). Jeśli miana wirusa w próbkach pasażowanych z mutagenem powrócą do poziomów zbliżonych do kontroli nietraktowanej, populacja prawdopodobnie zawiera wariant oporny na mutagen. Może być wymaganych do 20 lub 30 pasaży, choć większość naszych wariantów wierności wyizolowano między 5 a 15 pasażem.
- Gdy miana wirusa dla danej serii pasaży osiągną tę samą wartość co miana w kontroli nietraktowanej, wyekstrahować RNA ze wszystkich próbek, w tym z kontroli nietraktowanej z tego samego numeru pasażu. Można zastosować zestawy do ekstrakcji RNA lub ekstrakcję Trizol.
- Przeprowadzić RT-PCR przy użyciu starterów amplifikujących geny polimerazy lub replikazy badanego wirusa. W drugim kroku należy zsekwencjonować cały genom (przynajmniej regiony kodujące), aby sprawdzić, czy fenotypy oporności mapują się również na inne geny wirusa. Jest to szczególnie istotne w przypadku mutagenów będących analogami zasad, takich jak rybawiryna, która wpływa na inne aspekty funkcji wirusa i komórki. W takim przypadku wariant może być oporny na jedną z tych innych aktywności przeciwwirusowych i nie będzie wariantem wierności.
- Oczyścić produkty RT-PCR za pomocą zestawu do oczyszczania PCR i zsekwencjonować je, aby uzyskać sekwencję konsensusu populacji opornej na mutagen. Uwzględnić kontrole tła dla błędów sekwencjonowania (patrz sekcja Dyskusja).
- Za pomocą oprogramowania do dopasowania sekwencji i używając sekwencji konsensusu wirusa jako referencji, dopasować sekwencje. Zidentyfikować nowe mutacje punktowe, zwracając szczególną uwagę na te, które pojawiają się wyłącznie w populacji traktowanej mutagenem w pasażu, w którym miana wirusa osiągają poziomy normalne. Jeśli mutacja ta nie występuje w wcześniejszych pasażach ani w kontrolach nietraktowanych z tego samego numeru pasażu (co wskazywałoby na adaptację do pasażowania w hodowli komórkowej), to prawdopodobnie jest ona odpowiedzialna, przynajmniej częściowo, za oporność na mutagen. Nie polegać wyłącznie na sekwencji odczytanej (tekstowej wersji sekwencji) i oprogramowaniu do dopasowania. Sprawdzić chromatogramy pod kątem mniejszych pików, które mogły zostać pominięte przez oprogramowanie. Mutant stanowiący 20–30% całkowitej populacji nadal będzie widoczny jako pik, lecz zbyt mały, by został zidentyfikowany jako „N” w standardowej analizie sekwencji.
4. Po zidentyfikowaniu mutacji należy wyizolować lub wygenerować wariant i potwierdzić fenotyp oporności na kilka mutagenów RNA
Następnie izoluje się wariant wykazujący zidentyfikowaną mutację, aby potwierdzić jego związek z fenotypem oporności. Niezbędne jest, aby mutację podejrzewaną o zmianę wierności replikacji badano w czystym genetycznie tle (czyli takim, które nie wykazuje dodatkowych mutacji w innych miejscach genomu). W optymalnej sytuacji dostępny jest infekcyjny klon cDNA, który pozwala na stworzenie zapasu wariantu opornego na mutagen poprzez mutogenezę celowaną w czystym tle genetycznym. W takim przypadku sekcja 4 nie jest konieczna. Jeśli jednak klon cDNA nie jest dostępny, izolację można przeprowadzić za pomocą oczyszczania wirusa metodą plackową, opisaną poniżej. Aby wyizolować wariant w czystym tle genetycznym, może być wymaganych więcej niż jedna runda oczyszczania metodą plackową.
- Izolacja mutantu odpornego na mutagen za pomocą testu plackowego.
- Aby wyizolować zidentyfikowanego mutanta, należy przeprowadzić standardowy test plackowy z nakładką z agarozy (końcowe stężenie 0,5 do 1% mas/obj) w płytkach 6-dołkowych. Przygotować rozcieńczenia seryjne wirusa, w oparciu o miana zapasu, do rozcieńczeń, które wyprodukują od 10 do 50 dobrze oddzielonych placków.
- Gdy placki będą wyraźnie widoczne (zazwyczaj od 2 do 5 dni po infekcji, w zależności od wirusa), należy zaznaczyć położenie placków na płytkach i za pomocą pipety p200 z końcówką z filtrem delikatnie wprowadzić końcówkę przez nakładkę z agarozy, uważając, aby nie przesunąć pozycji nakładki (co mogłoby doprowadzić do kontaminacji krzyżowej poszczególnych placków).
- Ostrożnie wyjąć końcówkę z nakładki i przenieść zawarty w niej korek z agarozy do probówki Eppendorf zawierającej 250 μl medium, a następnie wymieszać na wirówce typu vortex. Nie należy się niepokoić, jeśli wyjęta końcówka nie zawiera agarozy; w przypadku wielu wirusów RNA średni plack zawiera 105 wirusów i wystarczająca ilość zostanie przeniesiona samym dotknięciem końcówki powierzchni placka.
- Wybrać do 10 placków na jedną obróbkę mutagenem. W zależności od chromatogramów z sekwencjonowania, które zidentyfikowały mutację, należy oszacować, jaki mniej więcej procent populacji zawiera pożądaną mutację. Celem jest wyizolowanie trzech lub czterech placków z mutacją. Niektóre z tych mutantów będą posiadać również dodatkowe, niepożądane mutacje, które zostaną później zidentyfikowane poprzez sekwencjonowanie.
- Wyekstrahować RNA z tych próbek (zachowując połowę próbki do przygotowania większego zapasu wirusa) i przeprowadzić reakcje RT-PCR, które umożliwią sekwencjonowanie całego genomu. Średnio wirusy RNA będą zawierać do dwóch różnic mutacyjnych w stosunku do sekwencji konsensusowej; zatem należy sekwencjonować 3 lub 4 wirusy oczyszczone z placków jednocześnie, aby zidentyfikować izolat zawierający pożądaną mutację bez żadnych dodatkowych mutacji.
- Po zidentyfikowaniu należy przygotować większy zapas tego wirusa do wszystkich dalszych badań, wykorzystując powyższą próbkę oczyszczoną z placków do zainfekowania większej kolby z komórkami, np. 8x106 komórek HeLa w kolbie T75.
- Potwierdzenie wrażliwości/odporności na mutagen nadanej przez zidentyfikowaną mutację.
- Używając wyizolowanego lub nowo wygenerowanego klonu oraz wirusa kontrolnego typu dzikiego przygotowanego w podobnych warunkach, należy powtórzyć eksperymenty opisane w sekcji 2, stosując pełny zakres stężeń mutagenu lub stężenie, przy którym wygenerowano mutację odporności.
- Zastosować kilka różnych warunków mutagennych dla RNA (rybawiryna, 5-fluorouracyl, 5-azacytydyna, zwiększone stężenie Mg2+, Mn2+). Jeśli wariant polimerazy jest odporny na więcej niż jeden rodzaj mutagenu, bardziej prawdopodobne jest, że wariant ten charakteryzuje się wysoką wiernością (high fidelity). Alternatywnie, możliwe jest, że mutacja odporności jest specyficzna dla pojedynczego warunku mutagennego, szczególnie że niektóre z tych związków oddziałują na wirusy RNA poprzez szereg mechanizmów 8.
5. Sprawdzenie szybkości replikacji
Ponieważ mutacje zmieniające wierność najczęściej mapują się na polimerazę, możliwe jest, że ta sama mutacja polimerazy znacząco zmieni kinetykę replikacji; ważne jest zatem określenie podobieństw i różnic w replikacji, co pozwoli na lepsze porównanie różnic w częstościach mutacji przeprowadzonych poniżej. W tym celu należy zbadać replikację za pomocą co najmniej dwóch komplementarnych podejść – jednego badającego produkcję wirusa i drugiego badającego syntezę RNA.
- Jednokrokowa kinetyka wzrostu wirusa
- Dzień przed eksperymentem wysiać komórki na płytki 6-dołkowe zgodnie z potrzebami, jedną płytkę na każdy badany punkt czasowy. Zaleca się zastosowanie trzech powtórzeń w dołkach dla każdego mutanta oraz dla wirusa typu dzikiego.
- W dniu eksperymentu usunąć medium i zainfekować dołki każdym z wirusów z MOI wynoszącym 10, aby zapewnić jednoczesną infekcję każdej komórki. Inkubować przez 30-60 minut w 37°C.
- Kołysać płytkami co 10 minut, aby zapobiec wysychaniu monowarstwy komórek. Usunąć wirusa i przemyć dwukrotnie 2 ml PBS. Ważne jest, aby usunąć jak największą ilość inokulum. Zastąpić medium wzrostowym.
- Po infekcji w czasie t=0, zebrać wirusa z jednej płytki. Przenieść płytki z powrotem do inkubatora i zbierać wirusy w regularnych odstępach czasu obejmujących jeden cykl replikacyjny (np. 3h, 5h, 7h, 9h, 12h, 24h).
- Oznaczyć miano wirusa zebranego w każdym punkcie czasowym (np. test plackowy, TCID50, test FFU) i wykreślić krzywe wzrostu miana w funkcji czasu.
- Kinetyka syntezy RNA
Kinetykę syntezy RNA można monitorować, stosując jedną z poniższych metod. Jeśli to możliwe, do pomiaru poziomów RNA należy użyć tych samych próbek, które posłużyły do wyznaczenia jednokrokowej kinetyki wzrostu.- qRT-PCR. Procedura ta pozwala na uzyskanie precyzyjnych ilościowych pomiarów replikacji w szerokim zakresie, od kilku kopii genomu do >1010, w zależności od czułości testu. Zaprojektować primery i sondy obejmujące krótki fragment (<200 bp) wysoce konserwatywnego regionu genomowego.
- Analiza Northern blot. Choć jest ona mniej ilościowa niż qRT-PCR, technika ta umożliwia wizualne potwierdzenie, że replikacja prowadzi do powstania pełnowymiarowych genomów i że w wyniku mutacji polimerazy nie dochodzi do znaczącej terminacji łańcucha.
- Ekspresja genu reporterowego. Jeśli dostępny jest klon cDNA wykazujący ekspresję genu reporterowego (np. lucyferazy), można go wykorzystać jako zamiennik do badania zdolności replikacyjnych. Jednak rekombinowanego wirusa nie należy stosować w innych zastosowaniach (takich jak wyznaczanie częstotliwości mutacji), ponieważ presje selekcyjne działające na ten wirus nie będą takie same, zwłaszcza że wirusy te mają tendencję do delecji wstawionego genu reporterowego.
6. Pomiar częstotliwości mutacji
Jest to krytyczny krok w potwierdzeniu, że zidentyfikowana mutacja polimerazy nadająca oporność na mutagen zmienia wierność replikacji. Należy zauważyć, że mierzone tutaj częstotliwości mutacji nie są szybkościami mutacji. Aby określić szybkości, należy uwzględnić bardzo precyzyjny pomiar kinetyki replikacji (ilość syntetyzowanego RNA oraz długość cyklu replikacyjnego). Pomiar częstotliwości mutacji, o ile monitorowana jest historia pasażowania i kinetyka replikacji, dostarcza powtarzalnych i ilościowych miar wierności replikacji. Częstotliwości mutacji można określić albo w populacji wirusa zdolnego do replikacji (klony płytek lub rozcieńczenia ograniczające), albo w całkowitej populacji wirusa (stok wirusa lub nadsącz). Aby określić częstotliwości mutacji, należy przygotować stoki wirusa z późniejszego pasażu (np. pasaż 2 lub późniejsze). Ważne jest, aby populacja wirusa miała czas na zwiększenie swojej różnorodności genetycznej w kierunku równowagi mutacyjno-selekcyjnej.
- Częstość mutacji w populacji wirusów żywotnych
Podejście to, choć bardziej pracochłonne, dostarcza informacji o tym, ile mutacji występuje średnio w genomie zachowującym zdolność do replikacji. Należy jednak zauważyć, że wystąpi błąd systematyczny na korzyść wariantów o wyższym dostosowaniu, a warianty żywotne o niższym dostosowaniu, które np. nie tworzą łatwo placków, mogą nie zostać wykryte. Metoda ta pozwala jednak na dokładniejsze określenie synonimicznych (dS) i niesynonimicznych (dN) substytucji nukleotydowych, co może być wykorzystane do zbadania, czy w populacji działa selekcja pozytywna. Ponieważ jednak ilościowo określonych zostanie mniej mutacji, do analizy statystycznej będzie potrzebna większa liczba sekwencji. Technika ta opiera się na izolacji pojedynczych wirusów poprzez oczyszczanie plackowe lub rozcieńczenia ograniczające, jak opisano powyżej. Jako punkt wyjścia zalecamy izolację 48 pojedynczych „klonów” wirusa typu dzikiego oraz wariantu odpornego na mutagen. Przewiduje się, że każda populacja klonalna wyizolowana w ten sposób będzie przenosić te mutacje, które występowały w genomie założycielu. Ilość RNA obecna w wyizolowanym placku lub studzience z rozcieńczeniem ograniczającym jest zazwyczaj wystarczająca do amplifikacji metodą RT-PCR. W razie potrzeby, w celu uzyskania większej ilości RNA, można zastosować krótką amplifikację (mniej niż jeden cykl replikacji) na minimalnej liczbie komórek (np. w formacie płytki 24-dołkowej); należy jednak przeprowadzić minimalną amplifikację, aby uniknąć kumulacji nowych mutacji. Należy pamiętać, że każdy klon i populacja przeznaczona do porównania muszą przejść taką samą liczbę cykli replikacji.- Wyizolować od 24 do 48 klonów wirusa poprzez oczyszczanie plackowe lub rozcieńczenia ograniczające.
- Wyekstrahować RNA z wyizolowanych populacji klonalnych.
- Amplifikować metodą RT-PCR fragment o długości do 3kb dla każdej próbki. Najlepiej objąć region białek strukturalnych, który wykazuje większą tolerancję na mutacje żywotne niż bardziej konserwatywne regiony genów niestrukturalnych.
- Oczyścić produkty PCR, zsekwencjonować je i przeprowadzić analizę mutacji (rozdział 7).
- Częstość mutacji w całkowitej populacji wirusów
Zaletą tej drugiej metody jest to, że w sekwencjonowaniu zostaną uwzględnione nawet warianty o niskim dostosowaniu, co pozwala na uzyskanie szerszego obrazu spektrum mutacji. Może ona jednak nie być idealna do analiz filogenetycznych zakładających żywotność populacji wirusów (np. wartości dN/dS) oraz do identyfikacji najważniejszych mutacji, ponieważ zmiany letalne (zmiana struktury RNA, kodony stop, drastyczne zmiany aminokwasowe) nie mogą zostać w pełni zidentyfikowane i pozostałyby w analizie. Niemniej jednak technika ta pozwala badaczowi na uzyskanie najbardziej istotnych statystycznie danych w celu potwierdzenia zmiany wierności replikacji w przypadku braku biochemicznego testu in vitro. Metoda ta opiera się na amplifikacji RT-PCR całkowitego RNA wirionów, w tym genomów z mutacjami o niskim dostosowaniu lub letalnymi, które nie tworzą placków. Częstość mutacji uzyskana tą metodą może być 10-krotnie wyższa niż w przypadku klonowania plackowego lub rozcieńczeń ograniczających.- Wyekstrahować RNA z całkowitej populacji wirionów.
- Amplifikować metodą RT-PCR region od 800 do 1200 nukleotydów z części genomicznej sekwencji kodującej, o której wiadomo, że toleruje mutacje i wykazuje zmienność genetyczną (np. białka strukturalne). Większe fragmenty nie będą łatwo wstawiane do wektorów klonujących, takich jak TopoTA, i przyniosą niewystarczającą liczbę transformantów. Choć mniejsze fragmenty są jeszcze lepsze, zakres zsekwencjonowanego genomu może być zbyt mały, aby uzyskać istotność statystyczną. Fragment o długości co najmniej 800 bp pozwala na pokrycie sekwencji za pomocą dwóch starterów i stanowi dobry kompromis między maksymalizacją zakresu sekwencji a minimalizacją kosztów sekwencjonowania. Stwierdziliśmy, że od 70 do 100 sekwencji obejmujących region 800 nukleotydów w sposób powtarzalny potwierdza zmienioną wierność wariantów badanych w naszym laboratorium. Należy zauważyć, że z równą skutecznością można stosować inne metody wektorowe/klonowania.
- Oczyścić produkt RT-PCR za pomocą komercyjnego zestawu lub standardowej ekstrakcji/precypitacji DNA.
- Jeśli używane enzymy RT-PCR nie tworzą nawisów A, przeprowadzić 10-minutową elongację po dodaniu 1 μM ATP i polimerazy Taq.
- Przeprowadzić klonowanie TopoTA zgodnie z instrukcjami producenta.
- Dla każdej badanej populacji wirusa wybrać 96 kolonii, zidentyfikowanych jako posiadające pozytywny insert za pomocą przesiewania niebiesko-białego na płytkach pokrytych XGal. Początkowo należy sprawdzić obecność insertów dla każdego klonowanego regionu genomu, aby potwierdzić poprawność przesiewania niebiesko-białego poprzez analizę wielkości plazmidów na żelach agarozowych lub PCR z pojedynczej kolonii. Przy zastosowaniu powyższego rozmiaru fragmentu i warunków uzyskujemy 90% wyników pozytywnych.
- Hodować każdą kolonię przez noc w pożywce płynnej w 1 ml medium LB w 96-dołkowych płytkach do hodowli bakteryjnych.
- Następnego dnia przygotować miniprepy w formacie 96-dołkowym.
- Zsekwencjonować każdą płytkę, używając odpowiedniej liczby starterów (np. starterów użytych do RT-PCR lub starterów TopoTA m13), aby uzyskać maksymalne pokrycie sklonowanego segmentu. Przeprowadzić analizę mutacji (rozdział 7).
7. Analiza sekwencji
Przeprowadź analizy sekwencji, wykorzystując sekwencję referencyjną lub konsensusową dla każdej populacji oraz odpowiednie oprogramowanie do dopasowania sekwencji. Zalecamy programy Lasergene lub Sequencher, które umożliwiają łatwą identyfikację SNP w odniesieniu do konsensusu.
- Wyrównaj sekwencje za pomocą odpowiedniego oprogramowania (np. Lasergene lub Sequencher).
- Odrzuć sekwencje słabej jakości (błędne odczyty zasad, zbyt wiele „N” lub zbyt krótka długość). Określ zakres nukleotydów, który jest pokryty przez wszystkie sekwencje. Ponieważ różne regiony genomu w różnym stopniu tolerują mutacje, ze względów porównawczych niezbędne jest, aby ten sam region był w pełni pokryty dla każdego klonu zsekwencjonowanego i zatrzymanego do analizy. Zatem, jeśli dla jednego klonu wykonano kilka reakcji sekwencjonowania i jedna z nich nie powiodła się, należy odrzucić ten klon (wszystkie jego sekwencje) z analizy.
- Zidentyfikuj i policz SNP, które różnią się od szczepu referencyjnego.
- Oblicz częstotliwość mutacji, dzieląc całkowitą liczbę zidentyfikowanych SNP przez całkowitą liczbę zsekwencjonowanych nukleotydów (liczba klonów x długość zsekwencjonowanego regionu). Przedstawienie tej wartości jako średniej liczby mutacji na 10K nt zsekwencjonowanych sprawia, że wynik jest bardziej przejrzysty niż pozostawienie go w przeliczeniu na jeden nukleotyd. Na przykład dla populacji typu dzikiego w Tabeli 1: 55 mutacji/121 978 wszystkich nukleotydów X 10 000 = 4,51 mutacji na 10 000 zsekwencjonowanych nukleotydów.
- Jeśli ten sam SNP występuje w dużej liczbie klonów, przedstaw dwie wartości: jedną uwzględniającą, a drugą wykluczającą te powtarzające się mutacje. Zazwyczaj w przypadku populacji wirusów pochodzącej od jednorodnego rodzica (poprzez oczyszczanie plackami lub z klonu infekcyjnego) i pasażowanej tylko kilka razy w hodowli komórkowej, selekcja pozytywna nie wywarła wystarczającego wpływu, aby spowodować akumulację tego samego SNP, a wartości częstotliwości mutacji mierzone w ten sposób lepiej odzwierciedlają częstotliwość błędów polimerazy przy minimalnym wpływie selekcji pozytywnej lub oczyszczającej.
- Określ rozkład mutacji. Sporządź listę rankingową liczby klonów w każdej populacji, które posiadają 0, 1, 2, 3 itd. mutacji w zsekwencjonowanym regionie.
- Oblicz różnorodność populacji wirusa poprzez porównanie dystansu parzystego. Z oczyszczonych i ręcznie edytowanych sekwencji przygotuj wyrównanie obejmujące region referencyjny. Dostępnych jest kilka programów do wyrównywania: ClustalW/X (http://www.clustal.org/), MUSCLE (http://www.drive5.com/muscle/), EbioX dla użytkowników Mac (http://www.ebioinformatics.org/ebiox/) itd. Upewnij się, że wszystkie sekwencje mają tę samą długość; w razie potrzeby je przytnij. Zaleca się, aby sekwencje rozpoczynały się od kodonu kodującego, co ułatwi późniejszą analizę. Sugerujemy zapisywanie wszystkich wyrównań w formacie fasta, który jest łatwo odczytywany przez większość dostępnego oprogramowania.
- Aby przeprowadzić analizę dystansu parzystego, oblicz wszystkie możliwe porównania parzyste między sekwencjami należącymi do tej samej populacji. Następnie można obliczyć średnią liczbę mutacji znalezionych w porównaniach, aby określić heterogeniczność populacji.
- Wartości dla mutacji synonimicznych (dS) i niesynonimicznych (dN) w obrębie populacji można łatwo uzyskać. W tego rodzaju analizach za przydatne i przyjazne dla użytkownika uważamy oprogramowanie MEGA (http://www.megasoftware.net/).
- Aby określić kierunek selekcji, przedstawiamy dwie możliwości, choć nie są one jedynymi dostępnymi. 1) Oblicz stosunek dN do dS. Wartości wyższe niż 1 oznaczają selekcję pozytywną. Wartości niższe niż 1 oznaczają selekcję oczyszczającą. 2) Skorzystaj z serwera internetowego Datamonkey (http://www.datamonkey.org/). Prześlij wyrównania w formacie fasta i przeanalizuj je za pomocą modułu SLAC. Pozwoli to na oszacowanie dN/dS.
- Przeprowadź analizy statystyczne. W zależności od ilości danych i liczby sekwencji można zastosować różne testy. Niektóre badania opierały się na testach chi-kwadrat całkowitej liczby mutacji w stosunku do całkowitej liczby nukleotydów konsensusowych, w których połączono wszystkie klony 9. Inne badania wykorzystywały dokładny test Fishera, obliczany na podstawie liczby sekwencji z mutacjami w stosunku do liczby sekwencji bez mutacji 10. Jeśli wygenerowano wystarczającą liczbę danych mutacyjnych, zalecamy przeprowadzenie testu sum rang, takiego jak test U Manna-Whitneya. Aby to zrobić, uszereguj liczbę klonów w każdej populacji wirusa według liczby mutacji obecnych w każdym zsekwencjonowanym RNA. Test Manna-Whitneya pozwoli wówczas sprawdzić różnice w rozkładzie mutacji w populacjach. Z tego powodu zalecamy sekwencjonowanie co najmniej 800 par zasad, aby zwiększyć prawdopodobieństwo znalezienia klonów z wieloma mutacjami. Test ten jest odporny, ale wymaga większych prób. Z drugiej strony nie wymaga on takiej samej wielkości próby dla dwóch porównywanych populacji (np. próbki z Tabeli 1 to n1=148 i n2=84).
8. Reprezentatywne wyniki:
Zależny od dawki wpływ stężenia mutagenu na żywotność komórek i żywotność wirusa przedstawiono na Rysunku 1. W tym przykładzie stwierdzono, że pasaż wirusa w 100 μM AZC spowodował obniżenie miana wirusa o zakładane 10,5-2 log, natomiast żywotność komórek HeLa nie została negatywnie wpłynięta podczas 2 dni wymaganych do infekcji wirusowej. Ten eksperyment pilotażowy doprowadził do wyboru stężenia 100 μM AZC do pasażowania seryjnego wirusa w celu selekcji oporności na mutagen. Rysunek 2 ilustruje początkową redukcję miana, po której następuje pojawienie się fenotypu opornego na mutagen. Podczas pierwszych kilku pasaży w mutagenie, w miarę gromadzenia się letalnych mutacji, dochodzi do znacznego spadku mian wirusa. Stopniowo pojawia się wariant oporny na mutagen, a jego wystąpienie zbiega się z powrotem mian wirusa do poziomu nieodróżnialnego od nieleczonych kontroli. Na tym etapie duży odsetek populacji wirusa wykazuje mutację oporności. Sekwencjonowanie tej populacji wirusa ujawnia odpowiedzialne za to zmiany aminokwasowe. Po zidentyfikowaniu i wyizolowaniu lub nowym wygenerowaniu, wirus oporny na mutagen może być mniej wrażliwy niż typ dziki na różne mutageny RNA (na przykład analogi zasad o innej strukturze). Rysunek 3 przedstawia opornego na mutageny RNA wirusa Coxsackie B3, którego miana w obecności rybawiryny, 5-fluorouracylu i 5-azacytydyny oraz wysokich stężeń MgCl2 i MnCl2 są wyższe niż w przypadku typu dzikiego. Szeroka oporność na mutageny RNA jest silnym wskaźnikiem zwiększonej wierności replikacji. Potwierdzenie, że kinetyka replikacji wariantu o wysokiej wierności jest podobna do wirusa typu dzikiego, pomoże w porównaniu częstości mutacji. Rysunek 4 przedstawia kinetykę wzrostu jednokrokowego wariantu o wysokiej wierności w porównaniu z typem dzikim. Jeśli tempo replikacji i miana końcowe nie są podobne, należy podjąć kroki w celu porównania populacji wirusów o podobnej liczebności, które przeszły tę samą liczbę rund replikacji. Związek między tempem syntezy RNA a wiernością replikacji nie jest dobrze scharakteryzowany, szczególnie in vivo. Wolniejsze tempo replikacji może skutkować zmniejszeniem częstości mutacji (wyższą wiernością), choć nie jest to zasada absolutna, co pokazano na Rysunku 4. Po ustaleniu powyższych parametrów można porównać częstości mutacji w populacjach wariantu o wysokiej wierności i typu dzikiego, aby uzyskać genetyczne potwierdzenie zmienionej wierności replikacji. Rysunek 5 przedstawia dopasowanie sekwencji typu dzikiego i wariantu o wysokiej wierności z zidentyfikowanymi mutacjami punktowymi. Mutacje są liczone, szeregowane zgodnie z liczbą mutacji na klon (Tabela 1) i przedstawiane jako średnia częstość mutacji na populację na 10 000 zsekwencjonowanych nukleotydów, Rysunek 6.
Rycina 1. Wyznaczanie optymalnych warunków selekcji oporności na mutageny RNA: zachowanie wysokiej żywotności komórek przy umiarkowanym (1-2 log) spadku miana wirusa. Komórki HeLa poddano działaniu wskazanych stężeń rybawiryny i zainfekowano wirusem Coxsackie B3 typu dzikiego przy MOI wynoszącym 0,01. 48 godzin po infekcji zebrano wirus potomne i wyznaczono miana metodą TCID50. Procent komórek, które przeżyły traktowanie po 48 godzinach, określony za pomocą barwienia błękitem trypanu, jest wskazany pod osią x. Wyniki pokazują, że stężenia 100 i 200 μM redukują miana wirusa o 1-2 log, nie wpływając na żywotność komórek.
Rysunek 2. Seryjne pasażowanie w obecności umiarkowanych stężeń mutagenów RNA prowadzi do selekcji populacji odpornych na mutageny. Na tym rysunku wirus Chikungunya był pasażowany w komórkach HeLa w obecności 50 μM rybawiryny (szare słupki). Pasaże kontrolne przeprowadzono bez dodatku rybawiryny (czarne słupki). Po każdym pasażu miano potomstwa wirusa oznaczano klasyczną metodą płytkową na komórkach BHK. Efekt mutagenny jest widoczny podczas pierwszych pasaży (p1 i p2 w porównaniu z populacją wyjściową p0), w których miana wirusa poddanego działaniu leku spadają o 2 log. Stopniowo miana powracają do poziomów normalnych (nieleczonych). W pasażu 5 nie obserwuje się istotnych różnic w populacjach traktowanych mutagenem w porównaniu z nieleczonymi, co sugeruje selekcję wariantów opornych. Rzeczywiście, sekwencjonowanie konsensusowe populacji pozwoliło zidentyfikować unikalne mutacje w populacji wirusa poddanej działaniu rybawiryny.
Rycina 3. Potwierdzenie szerokiej oporności na mutageny RNA o różnej strukturze. Przedstawiono tutaj wariant A372V wirusa Coxsackie B3 o wysokiej wierności replikacji, który został pierwotnie wyizolowany podczas przesiewu opisanego w sekcji 3; wariant ten wygenerowano z klonu infekcyjnego i przetestowano pod kątem względnej wrażliwości na różne stężenia różnych mutagenów RNA (rybawiryna, 5-fluorouracyl, 5-azacytydyna). Komórki HeLa poddano działaniu wskazanych stężeń rybawiryny i zainfekowano wirusem Coxsackie B3 typu dzikiego przy MOI wynoszącym 0,01. 48 godzin po infekcji zebrano wirusy potomne i określono miana metodą TCID50. Przedstawiono miana typu dzikiego (linie ciągłe) oraz wariantu A372V (linie przerywane) w funkcji stężenia mutagenu. Wariant A372V konsekwentnie wykazywał wyższe miana niż typ dziki we wszystkich testowanych warunkach.
Rysunek 4. Tempo replikacji i warianty wierności. Aby określić kinetykę wzrostu jednofazowego produkcji wirusa, komórki HeLa zainfekowano z MOI = 10 albo wirusem typu dzikiego (linia ciągła), wariantem o wysokiej wierności A372V (długie przerywane) lub wariantem z defektem replikacji Cx64 (krótkie przerywane) wirusa Coxsackie B3. W zaznaczonych punktach czasowych potomstwo wirusa pobrano z komórek i supernatantów poprzez zamrażanie i rozmrażanie, a następnie zmierzono miano metodą TCID50. Wzrost wierności wariantu A372V nie wiąże się z zauważalnym defektem replikacji w hodowli tkankowej. Wariant Cx64 wykazuje znaczne opóźnienie kinetyki replikacji i osiąga maksymalne miana 1000-krotnie niższe niż wirus typu dzikiego.
Rysunek 5. Dopasowanie sekwencji sklonowanych metodą TopoTA z każdej populacji wirusa. Stosując podejście opisane w sekcji 7, każda sekwencja uzyskana z Produktu RT-PCR prawdopodobnie pochodzi z jednego, unikalnego genomu w całkowitej populacji wirusów i w związku z tym niesie unikalne mutacje. Rysunek przedstawia typowe dopasowanie po usunięciu sekwencji słabej jakości i wizualizacji SNP. Oblicza się całkowitą liczbę SNP (10 na tym rysunku) w obrębie populacji i odnotowuje liczbę SNP występujących w każdym klonie. Na przykład klon podkreślony paskiem zawiera 2 unikalne mutacje, podczas gdy 8 innych klonów zawiera jedną unikalną mutację. Dane te są wykorzystywane do sporządzenia Tabeli 1. Aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku, prosimy kliknąć tutaj.
Rycina 6. Graficzna reprezentacja częstotliwości mutacji w populacjach wirusa. W celu ułatwienia interpretacji, dane liczbowe uzyskane z analiz sekwencyjnych i statystycznych mogą być przedstawione w formie wykresu lub histogramu (pokazanego tutaj). Wirus A372V generuje mniej mutacji niż typ dziki i wykazuje istotnie niższą częstotliwość mutacji (*, p<0.01). Wariant Cx64, który replikuje się do mian 1000-krotnie niższych niż typ dziki, wykazuje taką samą częstotliwość mutacji (ns, brak istotności), co wskazuje, że szybkość i wierność replikacji nie są ze sobą koniecznie powiązane. Ta sama populacja wirusa Chikungunya (CHIKV) daje podobne częstotliwości mutacji niezależnie od tego, czy do ekstrakcji RNA użyto zapasu wirusa, czy jego 105-krotnego rozcieńczenia.
Podsumowanie rozkładu mutacji do analizy statystycznej.
Uwaga: W przypadku każdego klonu niezbędne jest objęcie tego samego regionu genomowego (i tej samej długości sekwencji). W tym przypadku jest to 859 nukleotydów na klon. Jest to kwestia krytyczna dla analiz statystycznych. Z drugiej strony, testy sum rang wykorzystywane w analizie statystycznej nie wymagają jednak jednakowej wielkości prób, zatem badacz może swobodnie porównywać populacje o różnej liczebności. W związku z tym 142 klony typu dzikiego mogą być porównane z 84 klonami A372V.
| liczba klonów z n mutacjami | typ dziki | A372V |
| 7 mutacji | 0 | 0 |
| 6 mutacji | 0 | 0 |
| 5 mutacji | 0 | 0 |
| 4 mutacje | 0 | 0 |
| 3 mutacje | 1 | 0 |
| 2 mutacje | 6 | 2 |
| 1 mutacja | 40 | 14 |
| 0 mutacji | 95 | 68 |
| Łączna liczba mutacji | 55 | 18 |
| Łączna liczba zsekwencjonowanych klonów | 142 | 84 |
| Łączna liczba zsekwencjonowanych nukleotydów | 121,978 | 72,156 |
| Mutacje/104 nt | 4.51 | 2.49 |
Tabela 1. Podsumowanie rozkładu mutacji do analizy statystycznej. Uwaga: W przypadku każdego klonu niezbędne jest objęcie tego samego regionu genomowego (i długości sekwencji). W tym przypadku jest to 859 nukleotydów na klon. Jest to kluczowe dla analiz statystycznych. Z drugiej strony, testy sum rang stosowane w analizie statystycznej nie wymagają jednak jednakowych wielkości prób; badacz może swobodnie porównywać populacje o różnej liczebności próby. Zatem 142 klony typu dzikiego mogą być porównane z 84 klonami A372V.
Dyskusja
Wybór linii komórkowej. Skuteczność analogów zasad jako mutagenów RNA koreluje z ich względnym poborem przez różne typy komórek 11. Jeśli linia komórkowa zwykle stosowana do pasażowania wirusa okaże się oporna na pobór mutagenu lub zbyt wrażliwa (wysoka toksyczność komórkowa), konieczne może być zastosowanie innej linii komórkowej, która spełnia te wymagania i nadal jest dopuszczalna dla replikacji wirusa. Po wyizolowaniu wariantu opornego na mutagen, pozostałą część charakterystyki można przeprowadzić w oryginalnej, preferowanej linii komórkowej. W naszym doświadczeniu komórki HeLa łatwo pobierają mutagen; komórki BHK wymagają do 10-krotnie wyższych stężeń, a komórki Vero są oporne na pobór mutagenu.
Wybór mutagenu. Przy próbie izolacji wariantów wiernościowych poprzez traktowanie mutagenami, prawdopodobieństwo sukcesu wzrasta, jeśli zastosuje się więcej niż jeden rodzaj mutagenu. Mutageny będące analogami zasad o różnej strukturze, które są błędnie włączane do genomów podczas replikacji, będą indukować przede wszystkim specyficzny podzbiór mutacji w kolejnych cyklach replikacyjnych: traktowanie rybawiryną sprzyja mutacjom przejścia GdoA i CdoU 12; 5-azacytydyna wykazuje podobną tendencję, z dodatkiem transwersji CdoG i GdoC 13; 5-fluorouracyl preferencyjnie indukuje przejścia AtoG i UdoC 14. Alternatywnie, do pożywki można dodać wyższe stężenia Mg2+ lub Mn2+, aby zwiększyć ogólną częstość mutacji wirusów RNA bez opisywanej powyżej stronniczości 12. W zależności od sekwencji kodonów wirusa oraz zmian w kodonach wymaganych do wygenerowania wariantu wiernościowego, niektóre z tych warunków będą sprzyjać pojawieniu się tego konkretnego wariantu bardziej niż inne. W przypadku wariantów o wyższej wierności, poliovirus G64S i wirus Coxsackie A372V, traktowanie rybawiryną najskuteczniej pozwoliło na selekcję wariantów, ponieważ wymagane przejście AtoG w miejscu kodonu odpowiadało mutacjom generowanym głównie przez rybawirynę.
MOI a wielkość populacji. W wirusologii protokoły zakażania kultur tkankowych zwracają szczególną uwagę na wielokrotność zakażenia (MOI), aby na przykład uniknąć akumulacji wadliwych cząstek interferujących (niskie MOI) lub promować rekombinację między wirusami (wysokie MOI). Aby wyselekcjonować zdarzenia wyłaniania się nowych wariantów podczas seryjnego pasażowania, istotne jest również uwzględnienie wielkości populacji wirusa. Ponieważ mutant oporny występuje początkowo z niską częstotliwością, najlepiej jest przenosić jak największą populację z jednego pasażu do kolejnego (np. 105-106 wirusów), aby uniknąć utraty tych wyłaniających się wariantów przy każdym pasażu. Zwiększenie rozmiaru dołka lub kolby (liczby zakażonych komórek) może pomóc zminimalizować wzrost MOI, jeśli jest to kwestia problematyczna. Z drugiej strony, w eksperymentach badających wrażliwość wirusa na mutagen, przeprowadza się zakażenie przy niskim MOI, aby zwiększyć liczbę cykli replikacyjnych zachodzących w eksperymencie oraz uniknąć ratowania zmutagenizowanych genomów przez genomy o wyższej sprawności (fitness) poprzez komplementację w komórkach współzakażonych. Jest to ważne, ponieważ mutacje powstałe w genomach potomstwa podczas pierwszej rundy replikacji nie zostaną wykryte natychmiast. Większość tych zmutagenizowanych RNA zostanie nadal zapakowana do wirionów. Dopiero w kolejnej rundzie zakażenia mutacje letalne obecne w tych genomach spowodują przerwanie cyklu replikacyjnego i spadek miana wirusa. Może być konieczne dopuszczenie kilku rund akumulacji mutacji, zanim zaobserwuje się istotny efekt mutagenezy letalnej. Wreszcie, jeśli w serii pasażowań w obecności mutagenu miana wirusa stale spadają aż do całkowitego wygaśnięcia, badacz powinien spróbować pasażować wirusa w stopniowo zwiększanych ilościach mutagenu (zaczynając od bardzo niskiego stężenia).
Izolacja i generowanie klonu opornego na mutageny RNA z populacji opornej na mutageny RNA. Mutageny RNA wprowadzają liczne, losowe mutacje do każdego genomu, jednak selekcja w kierunku oporności wzbogaci (i utrwali w sekwencji konsensusowej) jedynie mutację odpowiedzialną za oporność. Aby zidentyfikować tę mutację, sekwencjonujemy populację oporną na mutageny (konsensus populacji), a nie poszczególne wirusy. W konsekwencji pojedyncze, losowe mutacje wywołane przez mutagen nie są wykrywane w sekwencji; odnajduje się jedynie te mutacje, które prowadzą do zmian w konsensusie po selekcji. W naszym doświadczeniu identyfikujemy zazwyczaj tylko jedną lub dwie takie zmiany w sekwencji konsensusowej. Po uzyskaniu populacji opornej na mutageny i zidentyfikowaniu mutacji oporności konieczne jest wygenerowanie czystszego zapasu tego wariantu. Powyżej opisaliśmy procedurę oczyszczania metodą płytek (plaque purification). Alternatywnie, jeśli badany wirus nie tworzy łatwo identyfikowalnych płytek, pożądany wariant można oczyścić metodą rozcieńczeń ograniczających. Podejście to jest w istocie wyznaczeniem TCID50 w formacie 96-dołkowym, gdzie zapas wirusa jest rozcieńczany tak, aby zainfekowanych zostało mniej niż 50% dołków. Przy zastosowaniu tego rozcieńczenia stosuje się taką samą metodę jak opisano powyżej, izolując do 10 pojedynczych wariantów i potwierdzając ich sekwencje. Jak wspomniano, w najlepszych przypadkach dostępny jest infekcyjny klon cDNA szczepu wirusa. Wówczas izolacja wariantu nie byłaby konieczna. Z naszego doświadczenia wynika, że warianty wierności replikacji są wynikiem pojedynczych podstawień aminokwasowych i mogą być zatem generowane przy użyciu prostych, komercyjnych zestawów do mutogenezy, takich jak Quikchange (Agilent). Drugą opcją jest wykorzystanie klona cDNA blisko spokrewnionego szczepu. Jeśli jednak używany jest szczep pokrewny, zdecydowanie zalecamy zastosowanie zarówno tego podejścia, jak i izolacji wirusa (np. oczyszczania metodą płytek), ponieważ stwierdziliśmy, że ta sama mutacja zmieniająca wierność replikacji w dwóch blisko spokrewnionych wirusach niekoniecznie wywoła ten sam efekt.
Wierność i replikacja. Selekcja wariantów RNA odpornych na mutageny doprowadziła do wyizolowania wariantów o zarówno wyższej, jak i niższej wierności, których charakterystyka wzrostu jest podobna do ich odpowiedników typu dzikiego 4,12,15. Obecnie związek między szybkością aktywności polimerazy a wiernością nie jest w pełni zrozumiały. Badania biochemiczne in vitro z użyciem oczyszczonej polimerazy RNA wykazały, że warianty o wyższej wierności charakteryzują się wolniejszą szybkością przetwarzania, podczas gdy warianty o niższej wierności mają tendencję do szybszego przetwarzania 1-3,12. W hodowlach tkankowych różnice te zazwyczaj nie są widoczne, co sugeruje, że etapem ograniczającym tempo jest dostępność zasobów, a nie wewnętrzna kinetyka aktywności polimerazy. Jeśli wariant o określonej wierności replikuje się z kinetyką, która nie różni się znacząco od typu dzikiego, można bezpośrednio porównać częstotliwości ich mutacji. W przypadku wystąpienia bardzo znaczącej zmiany w kinetyce replikacji dane należy znormalizować, aby uwzględnić różnice kinetyczne, na przykład poprzez porównanie wirusów, które przeszły tę samą liczbę cykli replikacyjnych. W naszym doświadczeniu, mimo że nie zaobserwowano znaczących różnic w kinetyce wzrostu jednokrokowego między typem dzikim a wariantami o wysokiej wierności, zauważyliśmy, że warianty o wyższej wierności konsekwentnie osiągają wyższe miana (w granicach 1 log) w porównaniu z typem dzikim, ale produkują nieco mniej RNA (w tym samym rzędzie wielkości), co dodatkowo sugeruje, że produkowane przez nie genomy zawierają mniej mutacji i są zatem bardziej zakaźne.
Przygotowanie próbek i sekwencjonowanie. W każdym z etapów opisanych w niniejszych protokołach niezbędne jest stosowanie wysokowiernych enzymów z aktywnością egzonukleazy (proof-reading) do reakcji PCR i RT-PCR, aby ograniczyć wprowadzanie dodatkowych mutacji, których nie można odróżnić od mutacji istotnych biologicznie. Kluczowe jest, aby porównywane populacje wirusów były przygotowane w tych samych warunkach (historia pasażowania, pożywka do hodowli tkankowej, temperatura, metoda ekstrakcji RNA, protokoły RT-PCR itp.). Ważne jest również upewnienie się, że z ekstrakcji RNA uzyskano wystarczającą ilość materiału wyjściowego, tak aby w wyniku RT-PCR powstał wyraźny prążek. Rozcieńczenie próbki RNA 1/100 powinno również dawać wykrywalny prążek w RT-PCR, co wskazuje, że próbka zawiera wystarczającą liczbę cząsteczek RNA, aby uniknąć błędu reprezentatywności (wielokrotnej amplifikacji tego samego genomu). Ponieważ częstość mutacji jest rozkładem, można oczekiwać uzyskania podobnych wartości niezależnie od wielkości populacji, pod warunkiem, że nie występuje wspomniany błąd. Jak pokazano na rysunku 6, 105-krotne rozcieńczenie zapasu wirusa daje częstość mutacji, która nie różni się znacząco od zapasu wyjściowego.
Do czasu ustalenia optymalnych warunków klonowania TopoTA, obecność wstawek po selekcji niebiesko-białej należy potwierdzić za pomocą kolonialnej PCR przed sekwencjonowaniem. W celu kontroli szumu mutacyjnego (mutacji wprowadzonych podczas RT-PCR i sekwencjonowania) należy sklonować produkt PCR z plazmidu zawierającego tę samą sekwencję wirusową i/lub sklonować oraz zsekwencjonować produkty RT-PCR z RNA przetranskrybowanego in vitro, odpowiadającego genomowi wirusa (należy pamiętać, że różne enzymy do transkrypcji in vitro mają różny stopień błędów i mogą nie dostarczyć przydatnych informacji na temat rzeczywistego poziomu błędów tła w danej procedurze). Niektóre sekwencje wirusowe mogą być toksyczne dla bakterii, dlatego ważne jest zweryfikowanie tego faktu przed wyborem regionu genomu wirusa do sekwencjonowania w celu oznaczenia częstości mutacji. Podczas analizy sekwencji uzyskanych metodą TopoTA należy pamiętać, że każdy klon powinien zawierać tylko jedną wstawkę/sekwencję. Jeśli zaobserwowany zostanie podwójny piki, co sugeruje mieszaną populację, możliwe jest, że wybrano dwie sąsiadujące kolonie bakteryjne. Możliwe jest również, choć wysoce nieprawdopodobne ze względu na niską częstotliwość mutacji podczas replikacji bakteryjnej, że mutacja została wprowadzona podczas amplifikacji plazmidu w kulturze bakteryjnej. W populacjach oczyszczonych metodą plackową podwójny piki może reprezentować nakładające się placki lub wirusa, który nabywa nową mutację bądź ulega rewersji mutacji podczas rozwoju placka. Należy zachować konsekwencję i zdecydować, czy uwzględniać takie mutacje w obliczeniach, czy nie.
Na koniec należy pamiętać, że wykorzystane tutaj częstotliwości mutacji są wartościami względnymi. Są one poprawne wyłącznie przy porównywaniu populacji wirusów hodowanych w tych samych warunkach i sekwencjonowanych w tym samym regionie! Nie należy ich traktować jako bezwzględnych wartości tempa mutacji ani częstotliwości mutacji całego genomu. Niemniej jednak, przy kontrolowanych warunkach, pozwalają one na powtarzalne, ilościowe porównania różnic w rozkładzie i częstotliwości mutacji.
Oświadczenia
Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.
Podziękowania
Praca ta była wspierana finansowo z grantu Medical and Health Research przyznanego przez miasto Paryż, francuskiego grantu narodowego ANR-09-JCJC-0118-1 oraz grantu ERC Starting Grant RNAvirusPopDivNVax, projekt nr 242719.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| rybawiryna | Sigma-Aldrich | R9644-10MG | |
| 5-fluorouracyl | Sigma-Aldrich | F6627-1G | |
| 5-azacytydyna | Sigma-Aldrich | A2385-100MG | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M1028-100ML | |
| MnCl2 | Sigma-Aldrich | M1787 | |
| Błękit trypanu | Sigma-Aldrich | T8154-20ML | |
| zestaw do klonowania TopoTA | Invitrogen | 10351021 | |
| zestaw do mutagenezy Quikchange | Agilent Technologies | 200516 | Jeśli dostępny jest infekcyjny klon cDNA |
| zestaw do minipreparatyki w 96 dołkach | Macherey-Nagel | 740625 | |
| Lasergene, Sequencher | DNASTAR | www.dnastar.com www.genecodes.com | Lub inne oprogramowanie do dopasowania sekwencji |
Bibliografia
- Arias, A. Determinants of RNA-dependent RNA polymerase (in)fidelity revealed by kinetic analysis of the polymerase encoded by a foot-and-mouth disease virus mutant with reduced sensitivity to ribavirin. J Virol. 82, 12346-12355 (2008).
- Arnold, J. J., Vignuzzi, M., Stone, J. K., Andino, R., Cameron, C. E. Remote site control of an active site fidelity checkpoint in a viral RNA-dependent RNA polymerase. J Biol Chem. 280, 25706-25716 (2005).
- Korneeva, V. S., Cameron, C. E. Structure-function relationships of the viral RNA-dependent RNA polymerase: fidelity, replication speed, and initiation mechanism determined by a residue in the ribose-binding pocket. J Biol Chem. 282, 16135-16145 (2007).
- Pfeiffer, J. K., Kirkegaard, K. A single mutation in poliovirus RNA-dependent RNA polymerase confers resistance to mutagenic nucleotide analogs via increased fidelity. Proc Natl Acad Sci U S A. 100, 7289-7294 (2003).
- Pfeiffer, J. K., Kirkegaard, K. Increased fidelity reduces poliovirus fitness and virulence under selective pressure in mice. PLoS Pathog. 1, e11-e11 (2005).
- Vignuzzi, M., Stone, J. K., Arnold, J. J., Cameron, C. E., Andino, R. Quasispecies diversity determines pathogenesis through cooperative interactions in a viral population. Nature. 439, 344-348 (2006).
- Vignuzzi, M., Wendt, E., Andino, R. Engineering attenuated virus vaccines by controlling replication fidelity. Nat Med. 14, 154-161 (2008).
- Crotty, S., Cameron, C., Andino, R. Ribavirin's antiviral mechanism of action: lethal mutagenesis. J Mol Med. 80, 86-95 (2002).
- Coffey, L. L., Vignuzzi, M. Host alternation of chikungunya virus increases fitness while restricting population diversity and adaptability to novel selective pressures. J Virol. 85, 1025-1035 (2011).
- Ciota, A. T. Role of the mutant spectrum in adaptation and replication of West Nile virus. J Gen Virol. 88, 865-874 (2007).
- Ibarra, K. D., Pfeiffer, J. K. Reduced ribavirin antiviral efficacy via nucleoside transporter-mediated drug resistance. J Virol. 83, 4538-4547 (2009).
- Levi, L. I. Fidelity variants of RNA dependent RNA polymerases uncover an indirect, mutagenic activity of amiloride compounds. PLoS Pathog. 6, e1001163-e1001163 (2010).
- Sierra, S., Dávila, M., Lowenstein, P. R., Domingo, E. Response of foot-and-mouth disease virus to increased mutagenesis: influence of viral load and fitness in loss of infectivity. J Virol. 74, 8316-8323 (2000).
- Ruiz-Jarabo, C. M., Ly, C., Domingo, E., de la Torre, J. C. Lethal mutagenesis of the prototypic arenavirus lymphocytic choriomeningitis virus (LCMV). Virology. 308, 37-47 (2003).
- Sierra, M. Foot-and-mouth disease virus mutant with decreased sensitivity to ribavirin: implications for error catastrophe. J Virol. 81, 2012-2024 (2007).
Przedruki i uprawnienia
Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE
Poproś o pozwolenie