Ilościowe oznaczenie poziomu RNA HIV-1 w osoczu oraz sekwencjonowanie pojedynczych genomów HIV-1 u osób z wiremią poniżej granicy wykrywalności (50-75 kopii/ml) jest trudne. W niniejszym materiale opisujemy sposób izolacji i oznaczania ilościowego wirusowego RNA z osocza przy użyciu testu real-time PCR, który wiarygodnie mierzy poziom RNA HIV-1 aż do 0,3 kopii/ml, a także metodę amplifikacji genomów wirusowych poprzez sekwencjonowanie pojedynczych genomów z próbek o bardzo niskiej ładunku wirusowym.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Amplifikacja i kwantyfikacja RNA HIV-1 u osób zakażonych HIV z ładunkiem wirusowym poniżej granicy wykrywalności standardowych testów klinicznych
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Amplifikacja genów wirusowych oraz ilościowe oznaczanie RNA HIV-1 u osób zakażonych HIV-1, u których miano wirusa znajduje się poniżej granicy wykrywalności standardowych testów (poniżej 50-75 kopii/ml), jest niezbędne do zrozumienia dynamiki wirusa oraz interakcji wirus-gospodarz u pacjentów, którzy naturalnie kontrolują infekcję, a także u osób przyjmujących złożoną terapię antyretrowirusową (cART).
W niniejszej pracy opisujemy sposób amplifikacji genomów wirusowych za pomocą sekwencjonowania pojedynczych genomów (protokół SGS) 13, 19 oraz metodę dokładnego oznaczania ilości RNA HIV-1 u pacjentów z niską wiremią (protokół testu pojedynczej kopii (SCA)) 12, 20.
Test jednej kopii (single-copy assay) jest testem real-time PCR, którego czułość zależy od objętości analizowanej plazmy. Jeśli w 7 ml plazmy zostanie wykryty pojedynczy genom wirusa, liczba kopii RNA jest raportowana jako 0,3 kopii/ml. Test posiada kontrolę wewnętrzną sprawdzającą wydajność ekstrakcji RNA oraz kontrole pod kątem możliwej amplifikacji z DNA lub kontaminacji. Próbki pacjentów są mierzone w trzech powtórzeniach.
Analiza sekwencjonowania pojedynczego genomu (SGS), obecnie powszechnie stosowana i uznawana za mało pracochłonną 3, 7, 12, 14, 15, jest analizą ograniczającego rozcieńczenia, w której produkt cDNA rozcieńczony do punktu końcowego jest rozprowadzany na płytce 96-dołkowej. Zgodnie z rozkładem Poissona, gdy mniej niż 1/3 dołków wykazuje obecność produktu, istnieje 80% prawdopodobieństwa, że produkt PCR jest wynikiem amplifikacji z pojedynczej cząsteczki cDNA. Przewagą SGS nad klonowaniem jest brak podatności na ponowne próbkowanie oraz brak błędu wynikającego z rekombinacji wprowadzonej przez PCR 19. Jednakże sukces amplifikacji w SCA i SGS zależy od projektu starterów. Obie analizy zostały opracowane dla HIV-1 podtypu B, ale mogą zostać dostosowane do innych podtypów i innych regionów genomu poprzez zmianę starterów, sond i standardów.
Protokół
1. Ekstrakcja RNA z dużych objętości osocza
Przegląd testu pojedynczej kopii (SCA) oraz protokołu sekwencjonowania pojedynczego genomu (SGS) przedstawiono na rysunkach 1 i 2.
- Aby uzyskać 7 ml osocza, odwirować około 14 ml krwi pobranej do probówek z EDTA (nie z heparyną) o pojemności 15 ml przy 2 600 ×g przez 15 minut bez hamowania. Przenieść osocze pipetą (uważając, aby nie pobrać warstwy tzw. buffy coat) do probówek o pojemności 15 ml.
- Jeśli RNA jest ekstrahowane do analizy pojedynczej kopii (SCA), do osocza dodać 30 000 kopii wewnętrznej kontroli wirionowej wirusa sarkomowego ptaków (RCAS). Wirus RCAS jest przygotowywany przed wykonaniem SCA zgodnie z wcześniejszym opisem (20). W skrócie: wirus RCAS z supernatantu kultury komórkowej jest kwantyfikowany za pomocą aktywności RT, rozcieńczany do końcowego stężenia 30 000 wirionów na 200 µl w pożywce do kultur tkankowych RPMI z 5% FBS i przechowywany w temperaturze -80°C w alikwotach do jednorazowego użytku. Wirus RCAS nie powinien być zamrażany i rozmrażany przed użyciem w analizie. RCAS dodaje się do osocza pacjenta w celu kontroli wydajności ekstrakcji RNA oraz dokładności kwantyfikacji PCR. Więcej informacji o RCAS znajduje się pod następującym linkiem: http://home.ncifcrf.gov/hivdrp/RCAS/.
- Osocze w stożkowych probówkach wirówkowych o pojemności 15 ml poddać „wstępnemu wirowaniu” przy 2 600 ×g przez 15 minut, aby oddzielić lipidy i szczątki komórkowe, które mogą zakłócać dokładną kwantyfikację RNA.
- Oznaczyć probówki wirówkowe Seton Easy-Seal trwałym markerem, aby zidentyfikować numer próbki oraz miejsce, w którym w probówce utworzy się pellet. Po wstępnym wirowaniu przenieść osocze do probówek Seton Easy-Seal za pomocą pipety, unikając pobierania szczątków komórkowych i/lub lipidów znajdujących się na powierzchni. Zapisać objętość wejściową osocza.
- Dodać bufor solny z Tris (TBS), aby wypełnić pozostałą objętość probówki Seton-Easy Seal do dolnej krawędzi gwintu. Upewnić się, że w probówce NIE MA PĘCHYRKÓW powietrza, w przeciwnym razie probówka może ulec zmiażdżeniu w ultrawirowce. Upewnić się, że podczas umieszczania probówek w rotorze oznaczenie na probówkach jest skierowane na zewnątrz.
- Zamknąć probówki wielorazowymi nakrętkami, umieścić próbki w schłodzonym rotorze Sorval T1270 i wirować w ultrawirowce Sorval 90SE przy 170 000 ×g (50 000 rpm) w temperaturze 4°C przez 30 min.
- Po wirowaniu usunąć supernatant i dodać do pelletu wirusowego (który nie będzie widoczny) 90 µl wody klasy molekularnej oraz 10 µl proteinazy K (20 mg/ml).
- Umieścić probówki w kąpieli wodnej o temperaturze 55°C i inkubować przez 30 minut. Ustawić probówki pod kątem tak, aby strona z pelletem była zanurzona w mieszaninie proteinazy K i wody.
- Po inkubacji krótko odwirować probówkę w wirówce stołowej, aby zebrać cały płyn na dnie probówki (około 5 sekund), a następnie dodać 315 µl 6M roztworu tiocyjanianu guanydyny oraz 10 µl glikogenu o stężeniu 20 mg/ml (Uwaga: Należy przestrzegać odpowiednich wytycznych dotyczących utylizacji tego materiału niebezpiecznego; nie mieszać z wybielaczem ani kwasami i utylizować w osobnym pojemniku).
- Lekko wymieszać na wortexie i krótko odwirować (przez około 5 sekund). Inkubować przez 10 minut w temperaturze pokojowej, a następnie przenieść zawartość każdej probówki do nowo oznakowanych, wolnych od RNazy probówek wirówkowych o pojemności 1,5 ml.
- Do każdej probówki dodać 495 µl izopropanolu klasy molekularnej, mieszać na wortexie przez 10 sekund i wirować przy 21 000 ×g przez 30 minut w temperaturze pokojowej.
- Usunąć supernatant i dodać 500 µl 70% etanolu.
- Mieszać na wortexie przez 10 sekund i wirować przy 21 000 ×g przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Usunąć etanol za pomocą pipety transferowej. Wirować ponownie i usunąć resztki etanolu pipetą. Suszyć na powietrzu przez 10 minut. (W przypadku protokołu SGS rozpuścić RNA w 40 µl 5 mM Tris-HCl pH 8,0 i kontynuować zgodnie z protokołem SGS).
- Rozpuścić pellet w 55 µl buforu RNA. Bufor RNA przygotowuje się poprzez dodanie 10 µl 100 mM DTT i 25 µl Rnasin (40 U/µl) do 965 µl Tris-HCl (pH 8,0, 5 mM). Przechowywać na lodzie.
2. Analiza pojedynczej kopii (Single Copy assay)
Płytka 96-dołkowa zawiera 8 próbek pacjentów, w tym standardy i kontrole HIV oraz RCAS. Niniejszy protokół opisuje przygotowanie pojedynczej płytki.
- Należy rozpocząć od przygotowania 2 aliquotów po 1 ml buforu do RNA, w którym zostaną rozcieńczone transkrypty RNA HIV-1 oraz RNA RCAS w celu sporządzenia krzywych wzorcowych RNA. Bufor do RNA został opisany w punkcie 1.13.
- Przygotować rozcieńczenia w temperaturze 0°C w probówkach wirówkowych o pojemności 2 ml. Wykonać rozcieńczenia półlogarytmiczne transkryptów RNA HIV-1 w buforze do RNA, dodając 25 µl roztworu zapasowego RNA HIV-1 (1x106 kopii/µl) do 54 µl buforu do RNA, co daje 3x105 kopii/µl.
- Następnie należy wykonać kolejne rozcieńczenia o połowę logarytmu (25 µl + 54 µl), aż do stężenia 0,3 kopii na 10 µl (Uwaga: rozcieńczenia 0,3, 1 i 3 nie będą stanowić części krzywej wzorcowej podczas analizy, ponieważ są one wykorzystywane jako wartości do ekstrapolacji i podczas analizy powinny zostać ustawione jako próbki nieznane). Transkrypty RCAS są przechowywane w stężeniu 1x106 kopii/µl. W podobny sposób należy przygotować rozcieńczenia transkrypcyjnych kopii RCAS w buforze do RNA, stosując rozcieńczenia połowiczne w skali logarytmicznej aż do stężenia 100 kopii na 10 µl.
- Przygotować koktajl do odwrotnej transkrypcji (RT) dla syntezy cDNA zgodnie z Tabelą 1. Przygotować reakcje RT oraz NRT zgodnie z Tabelą 1, pamiętając o przygotowaniu niewielkiej nadwyżki, aby zrekompensować ewentualne straty podczas przenoszenia. Uwaga: w koktajlu NRT enzym RT zastępuje się wodą, aby kontrolować amplifikację z DNA.
Uwaga: Krok ten został niedawno zautomatyzowany, podobnie jak przygotowanie płytek, z wykorzystaniem robota Qiagen (pierwotnie Corbett). - Przygotuj optyczną płytkę 96-dołkową (jak pokazano na rysunku 3), dodając 20 $\mu$l mieszaniny reakcyjnej RT do każdego dołka. Do 8 dołków oznaczonych jako „NRT” dodaj koktajl bez odwrotnej transkryptazy (mieszanina reakcyjna NRT). Po dodaniu koktajli do płytki, dodaj 10 $\mu$l wody do dołków oznaczonych jako „Kontrole bez matrycy (NTC)”. Do dołków oznaczonych jako „HIV” dodaj 10 $\mu$l transkryptów HIV w stężeniach przedstawionych na rysunku 3. Do dołków oznaczonych jako „RCAS” dodaj 10 $\mu$l transkryptów RCAS w odpowiednich stężeniach. Do 3 sąsiednich dołków oznaczonych jako „Próbka” na schemacie płytki dodaj 10 $\mu$l próbki pacjenta. Do dołków oznaczonych jako „NRT” dodaj 10 $\mu$l wyelowanej próbki. Do dołków oznaczonych jako „kontrola wewnętrzna” dodaj 5 $\mu$l tej samej próbki oraz 5 $\mu$l wody.
- Uszczelnić płytkę i inkubować w termocyklerze w następujących warunkach: 25°C przez 15 minut, 42°C przez 40 minut, 85°C przez 10 minut, 25°C przez 30 minut, a następnie 5°C wstrzymaj
- Przygotować mieszaniny PCR (master mixy) zgodnie z Tabelą 2.
- Po zakończeniu syntezy cDNA należy przenieść się do obszaru wyznaczonego do pracy z cDNA. W wyznaczonym obszarze do każdego dołka płytki z cDNA, zarówno dla HIV, jak i RCAS, należy dodać 20 $\mu$l mieszaniny PCR (master mix). Ważne jest, aby ten etap przeprowadzić w wyznaczonym obszarze, aby uniknąć ewentualnej kontaminacji.
- Wirować płytkę, zamknąć pokrywą optyczną ABI lub Roche i przykryć kocem optycznym (koc jest wymagany tylko dla ABI 7700). Przeprowadzić reakcję na urządzeniu Roche 480 lub ABI 7700. Warunki PCR: 95°C przez 10 minut, a następnie 45 cykli 95°C przez 15 sekund, 60°C przez 1 min. Wymagana jest oddzielna analiza dla RCAS i HIV. Przykładowe wyniki przedstawiono na rysunku 4. Nachylenie krzywej standardowej będzie zależne od normalnego rozkładu Poissona dla transkryptów o niskiej liczbie kopii. Aby zapewnić najdokładniejsze nachylenie krzywej standardowej, standardy o niskiej liczbie kopii (0,3, 1 i 3 kopie) ustawiono jako „nieznane”.17
3. Sekwencjonowanie pojedynczego genomu
- Synteza cDNA. Do dołka w 96-dołkowej płytce PCR (Biorad) dodaj 5 µl dNTPs o stężeniu 10 mM oraz 5 µl specyficznego dla genu primera (pol lub env) o stężeniu 2 mM. Dodaj 40 µl ekstrahowanego RNA. Uszczelnij płytkę.
- Denaturuj mieszaninę RNA w termocyklerze w temperaturze 65°C przez 10 min.
- Wymieszaj odczynniki do syntezy cDNA wymienione w Tabeli 3. Po etapie denaturacji umieść płytkę PCR na lodzie i dodaj 50 µl mieszaniny do syntezy cDNA do każdej próbki.
- Uruchom program w termocyklerze dla płytki PCR: 45°C przez 50 min, 85°C przez 10 min i inkubacja w 4°C.
- Pierwsza PCR, reakcje 10 µl. Przygotuj mieszaninę reakcyjną PCR w kuwecie z odczynnikami, używając primerów do pierwszej rundy amplifikacji p6-rt lub env (odczynniki wymienione w Tabeli 3, primery wymienione w Tabeli 5).
- Za pomocą pipety wielokanałowej nanieś 8,0 µl mieszaniny PCR do 73 dołków na 96-dołkowej płytce PCR (70 próbek i 3 kontrole negatywne).
- Po zakończeniu syntezy cDNA przenieś cDNA oraz płytkę PCR zawierającą mieszaninę reakcyjną do obszaru przeznaczonego do pracy z cDNA. W wyznaczonym obszarze dodaj 40 µl Tris-HCl pH 8,0 do każdej próbki cDNA, tak aby uzyskać objętość końcową 140 µl. Dodaj 2,0 µl cDNA do każdego z 70 dołków oraz 2,0 µl wody do każdej z kontrol negatywnych. Uszczelnij płytkę PCR. Uruchom w termocyklerze zgodnie z programem w Tabeli 4.
- Nested PCR – reakcje 20 µl. Wymieszaj odczynniki do nested PCR w kuwecie z odczynnikami (odczynniki wymienione w Tabeli 3, primery wymienione w Tabeli 5).
- Za pomocą pipety wielokanałowej dodaj 18 µl mieszaniny nested PCR do 73 dołków na 96-dołkowej płytce PCR.
- Rozcieńcz produkt pierwszej PCR w stosunku 1:5 i dodaj 2 µl produktu z pierwszej rundy PCR do reakcji nested PCR. Przeprowadź reakcję PCR w termocyklerze w warunkach wymienionych w Tabeli 4.
- Rozdziel próbki na 1% żelu agarozy. Aby upewnić się, że większość produktów PCR jest wynikiem jednej cząsteczki cDNA, nie więcej niż 30% dołków powinno być pozytywnych. Proces ten został zautomatyzowany przy użyciu robota Beckman Coulter Biomek FM w celu naniesienia zawartości płytek PCR na 1% żel E-gel z 96 dołkami (Invitrogen). Żele E-gel są prowadzone przez 7 minut na urządzeniu E-base. Sekwencjonuj produkty, używając primerów wymienionych w Tabeli 5.
4. Reprezentatywne wyniki:
SCA:
Wszystkie kontrole powinny zostać zaliczone, aby uznać pomiar HIV-1 RNA za prawidłowy. Jeśli kontrola negatywna wykaże wynik dodatni, przebieg badania należy odrzucić ze względu na możliwe zanieczyszczenie. Aby kontrolować straty RNA podczas etapu ekstrakcji, należy odzyskać co najmniej 50% RCAS dodanego do osocza. Jeśli średnia wartość RCAS wynosi <15 000 kopii, próbka zostaje odrzucona i nie powinna być brana pod uwagę, ponieważ podczas ekstrakcji lub innych etapów protokołu mogło dojść do utraty znacznej ilości RNA. Dzieje się tak w około 10% wszystkich badanych próbek pacjentów, prawdopodobnie ze względu na wysoką zawartość lipidów w osoczu6. Odzysk wirusa RCAS służy do kontroli jakości ekstrakcji oraz wydajności syntezy cDNA i amplifikacji PCR. Nie jest on używany do korekty odzysku HIV, ponieważ HIV prawdopodobnie wiąże się z immunoglobulinami i innymi ludzkimi białkami, co czyni go nieco innym od wirusa izolowanego z kultur tkankowych. Odzysk RCAS w naszym laboratorium wynosił średnio 25 716 +/- 4 057 kopii/mieszanina reakcyjna, czyli około 95% +/-15% dodanego RNA RCAS17. Kontrola NRT (bez odwrotnej transkryptazy) jest przeprowadzana równolegle w celu sprawdzenia amplifikacji z DNA. Wartość NRT odejmuje się od każdej z trzech wartości HIV-1 RNA, następnie oblicza średnią i jeśli liczba ta jest mniejsza od zera (amplifikacja DNA przewyższa amplifikację RNA), wynik zostaje uznany za błędny i powinien być odrzucony ze względu na ryzyko amplifikacji z DNA zamiast z RNA. Jeśli HIV-1 RNA zostanie amplifikowany tylko w 1 z 3 studzienek, zaleca się ponowne przebadanie próbki, aby upewnić się, że amplifikacja jest charakterystyczna dla badanej próbki, a nie wynika z możliwego zanieczyszczenia.
Jeśli wszystkie kontrole zostaną zaliczone, można obliczyć średnią liczbę kopii RNA HIV-1 w osoczu.
Przykład 1: Jeśli średnia liczba kopii HIV-1 wynosi zero, granica wykrywalności jest obliczana na podstawie objętości analizowanej osocza. Przyjmijmy na przykład, że analizowano 7 ml osocza. Najmniejszą ilością RNA, która mogłaby zostać wykryta w tym badaniu, byłaby 1 kopia w jednej z studni i 0 kopii w dwóch pozostałych studniach, co daje średnio 0,33 kopii na studnię. Średnią liczbę kopii należy następnie pomnożyć przez współczynnik 5,5, aby otrzymać całkowitą liczbę kopii w eluate RNA (w każdej studni znajduje się 10 µl, ale całkowita objętość eluata wynosiła 55 µl). Dolna granica wykrywalności wynosi zatem: 5,5 x 0,33 kopii podzielone przez 7 ml = 1,83/7 = 0,3 kopii/ml. Stężenie RNA HIV-1 w osoczu w tym przykładzie wynosiło <0,3 kopii/ml.
Przykład 2: RNA HIV-1 jest wykrywalne. RNA wyekstrahowano z 7 ml osocza. Średnia liczba kopii RNA HIV-1 na studzienkę wynosi 2,0 kopii na studzienkę. Wówczas średnia liczba kopii na ml osocza wynosi 5,5 x 2,0 kopii/7 ml = 1,6 RNA HIV-1/ml osocza.
Szablon arkusza Excel służący do obliczania liczby kopii można pobrać ze strony internetowej.
SGS:
Jeśli jedna z kontroli negatywnych okaże się pozytywna, wynik serii należy odrzucić ze względu na możliwe zanieczyszczenie. Ilość produktu z każdej serii będzie zależeć od ładunku wirusowego w każdej próbce oraz stanu próbki. Z naszego doświadczenia wynika, że duża zawartość lipidów lub komórek w osoczu zmniejsza szansę na uzyskanie produktu. Warunki przechowywania oraz wcześniejsze zamrażanie i rozmrażanie próbki również w znacznym stopniu wpływają na odzysk RNA. Ogólnie rzecz biorąc, przy pracy z próbkami o ładunku wirusowym poniżej 50 copies/ml, produktu (prążków w żelu) można oczekiwać w około 1/3 – 1/2 przetworzonych próbek. W zależności od wyżej wymienionych czynników, 1-5 prążków na płytkę należy uznać za dobry wynik ze względu na niski ładunek wirusowy u tych pacjentów.
| synteza cDNA (koktajl RT/reakcja cDNA) | 1 reakcja | koktajl bez odwrotnej transkryptazy (NRT)/reakcja cDNA (1 reakcja) |
| H2O klasy molekularnej | 8.1 ul | 8.2 ul |
| 25 mM MgCl2 | 6 ul | 6 ul |
| 25 mM dNTPs | 0.6 ul | 0.6 ul |
| 100 mM DTT | 0.2 ul | 0.2 ul |
| losowe heksamery (0.1 ug/ul) | 1.5 ul | 1.5 ul |
| 10X TaqMan Buffer A | 3.0 ul | 3.0 ul |
| Rnasin (40 U/uL) | 0.5 ul | 0.5 ul |
| Strategene RT (200 U/ul) | 0.1 ul | nie dodawać |
| Suma | 20 ul | 20 ul |
| RNA z próbki | 10 ul | 10 ul |
| Objętość całkowita | 30 ul | 30 ul |
Tabela 1. Mieszaniny reakcyjne do syntezy cDNA w teście pojedynczej kopii (Single Copy Assay).
| Mieszanina PCR master mix | 1 reakcja | Startery |
| H2O | 15.1 ul | HIV Forward Primer 5'-CATGTTTTCAGCATTATCAGAAGGA-3' |
| 10X PCR Gold Buffer | 2.0 ul | HIV Reverse Primer 5'-TGCTTGATGTCCCCCCACT-3' |
| 25 mM MgCl2 | 2.0 ul | HIV Probe 5'FAM-CCACCCCACAAGATTTAAACACCATGCTAA-TAMRA 3' |
| *Starter Forward (100 um) | 0.3 ul | |
| *Starter Reverse (100 um) | 0.3 ul | RCAS Forward Primer 5'-GTCAATAGAGAGAGGGATGGACAAA-3' |
| *Sonda (100 um) | 0.05 ul | RCAS Reverse Primer 5'-TCCACAAGTGTAGCAGAGCCC-3' |
| TaqGold (5 U/ul) | 0.25 ul | RCAS Probe 5'FAM-TGGGTCGGGTGGTCGTGCC-TAMRA 3' |
| Suma | 20.0 ul |
Tabela 2. Mieszanina PCR (master mix) i startery do testu pojedynczej kopii (Single Copy Assay).
| Koktajl cDNA/reakcje cDNA | 1 próbka RNA | Pierwszy koktajl PCR | 1 płytka (75 reakcji) | Koktajl Nested PCR | 1 płytka (75 reakcji) |
| 10X RT Buffer (Invitrogen) | 10 ul | 10X PCR buffer (Invitrogen) | 75 ul | 10X PCR buffer | 150 ul |
| 25 mM MgCl2 | 20 ul | 50 mM MgSO4 | 30 ul | 50 mM MgSO4 | 60 ul |
| 0.1M DTT | 1 ul | 10 mM dNTPs | 15 ul | 10 mM dNTPs | 30 ul |
| Woda wolna od RNaz | 17.5 ul | 50 uM starterów (każdy) | 3 ul | 50 uM starterów (każdy) | 6 ul |
| Rnase-Out (Invitrogen) | 1 ul | Platinum Taq Hi Fi Enzyme (invitrogen) | 6 ul | Platinum Taq Hi Fi Enzyme (Invitrogen) | 12 ul |
| Superscript III (200 U/ul) (invitrogen) | 0.5 ul | Woda klasy molekularnej | 468 ul | Woda klasy molekularnej | 1086 ul |
Tabela 1. Mieszaniny cDNA i PCR do sekwencjonowania pojedynczego genomu.
| Program PCR P6-RT 1 | Program PCR Env 1 |
| 1. 94°C przez 2 minute | 1. 94°C przez 2 minute |
| 2. 94°C przez 30 seconds | 2. 94°C przez 30 seconds |
| 2. 94°C przez 30 seconds | 3. 52°C przez 30 seconds |
| 4. 72°C przez 1 minute 30 seconds | 4. 72°C przez 1 minute |
| 5. Powrót do kroku #2, 44 cycles | 5. Powrót do kroku #2, 44 cycles |
| 6. 72°C przez 3 minutes | 6. 72°C przez 3 minutes |
| 7. Inkubacja w 4°C | 7. Inkubacja w 4°C |
| Program PCR P6-RT 2 | Program PCR Env 2 |
| 1. 94°C przez 2 minutes | 1. 94°C przez 2 minutes |
| 2. 94°C przez 30 seconds | 2. 94°C przez 30 seconds |
| 3. 55°C przez 30 seconds | 3. 56°C przez 30 seconds |
| 4. 72°C przez 1 minute | 4. 72°C przez 45 seconds |
| 5. Powrót do kroku #1, 40 (łącznie 41 cycles) | 5. Powrót do kroku #1, 40 (łącznie 41 cycles) |
| 6. 72°C przez 3 minutes | 6. 72°C przez 3 minutes |
| 7. Inkubacja w 4°C | 7. Inkubacja w 4°C |
Tabela 4. Warunki termocyklera dla testu sekwencjonowania pojedynczego genomu.
| Reakcja | Starter | Sekwencja |
| P6-RT cDNA | 3500- | 5' CTATTAAGTATTTTGATGGGTCATAA 3' |
| env cDNA | E115- | 5'AGAAAAATTCCCCTCCACAATTAA 3' |
| P6-RT 1. PCR | 3500- | 5' CTATTAAGTATTTTGATGGGTCATAA 3' |
| P6-RT 1. PCR | 1849+ | 5' GATGACAGCATGTCAGGGAG 3' |
| P6-RT 2.PCR | 1870+ | 5' GAGTTTTGGCTGAGGCAATGAG 3' |
| P6-RT 2.PCR | 3410- | 5' CAGTTAGTGGTATTACTTCTGTTAGTGCTT 3' |
| env 1. PCR | E115- | 5'AGAAAAATTCCCCTCCACAATTAA 3' |
| env 1. PCR | E20+ | 5'GGGCCACACATGCCTGTGTACCCACAG 3' |
| env 2. PCR | E30+ | 5'GTGTACCCACAGACCCCAGCCCACAAG3' |
| env 2. PCR | E125- | 5'CAATTTCTGGGTCCCCTCCTGAGG 3' |
| Sekwencjonowanie P6-RT | 2030+ | 5'TGTTGGAAATGTGGAAAGGAAGGAC 3' |
| Sekwencjonowanie P6-RT | 2600+ | 5'ATGGCCCAAAAGTTAAACAATGGC3' |
| Sekwencjonowanie P6-RT | 2610- | 5'TTCTTCTGTCAATGGCCATTGTTTAAC3' |
| Sekwencjonowanie P6-RT | 3330- | 5'TTGCCCAATTCAATTTTCCCACTAA 3' |
| Sekwencjonowanie env | E30+ | 5'GTGTACCCACAGACCCCAGCCCACAAG3' |
| Sekwencjonowanie env | E125- | 5'CAATTTCTGGGTCCCCTCCTGAGG 3' |
Tabela 5. Primery do analizy sekwencjonowania pojedynczego genomu.
Rysunek 1. Przegląd analizy sekwencjonowania pojedynczych genomów (SGS).
Rycina 2. Przegląd analizy pojedynczej kopii (SCA).
Rycina 3. Układ płytki dla testu Single Copy Assay.
Rysunek 4. Zrzut ekranu z urządzenia ABI 7700. A. przedstawiający krzywą wzorcową RNA HIV-1 z próbkami pacjentów oraz B. przedstawiający krzywą wzorcową RCAS z wzbogaconymi próbkami pacjentów.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Osoby zakażone HIV-1 przyjmujące złożoną terapię antyretrowirusową (cART) lub naturalnie kontrolujące infekcję wykazują bardzo niską wiremię, zazwyczaj około 1 kopii na ml osocza4, 11, 12, 17, 18. Wiremia u pacjentów z naturalną kontrolą często fluktuuje wokół indywidualnego punktu nastawczego1, 2, 17. Czułość opisanych tutaj testów jest w dużym stopniu zależna od objętości użytego osocza. Zazwyczaj pracujemy z 7 ml osocza, jednak w zależności od rzeczywistej wiremii w osoczu, pozytywne wyniki można...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.
Podziękowania
Autorzy pragną podziękować pacjentom, którzy wzięli udział w licznych badaniach nad HIV-1.
J.M.C. był profesorem badawczym American Cancer Society przy wsparciu F.M. Kirby Foundation.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Losowe heksamery (500 µg/ml) | Promega Corp. | C118A | |
| bufor TaqMan A | Applied Biosystems | 4304441 | |
| RNAsin (40 U/μl) | Promega Corp. | N211B | |
| enzym RT (200 J/µl) | Stratagene, Agilent Technologies | 600107-51 | |
| polimeraza DNA Amplitaq Gold | Applied Biosystems | 4311814 | opakowanie 6 sztuk |
| bufor PCR Amplitaq 10X Gold PCR buffer II | Applied Biosystems | 4311814 | dołączony do enzymu |
| Chlorek magnezu 25 mM | Applied Biosystems | 4311814 | zawiera enzym |
| bufor Tris-HCl 1 M, pH 8,0, 5 mM | Invitrogen | AM9855G | |
| enzym odwrotna transkryptaza Superscript III, 200 U/ul | Invitrogen | 18080-044 | |
| bufor 10X Superscript III | Invitrogen | dołączony do enzymu | |
| DTT 100 mM | Invitrogen | dołączony do enzymu | |
| Polimeraza DNA Platinum Taq High Fidelity 5 U/ul | Invitrogen | 11304-102 | |
| Bufor do PCR o wysokiej wierności 10X | Invitrogen | 11304-102 | dołączony do enzymu |
| Proteinaza K 20 mg/ml | Ambion | 2546 | |
| Roztwór tiocyjanianu guanidynium 6M | Fluka | 50983 | |
| Glikogen 20 mg/ml | Grupa Roche | 10901393001 | |
| Izopropanol | Sigma-Aldrich | 19516 | |
| Etanol 70% | Sigma-Aldrich | E702-3 | |
| Woda klasy molekularnej | GIBCO, by Life Technologies | 10977-015 | |
| dNTP (po 25 mmol każdego) | Bioline | BIO-39025 | |
| Probówki wirówkowe Easy Seal (16x73 mm) | Seaton Scientific | 6041 | |
| Korony z białego Delrinu | Seaton Scientific | 4020 | Nakrętki do probówek Easy Seal |
| Statyw na probówki Optiseal Bell-Top, 8,9 ml | Beckman Coulter Inc. | 361642 | |
| Klucz imbusowy ½ otwarcie nacięcia | Seaton Scientific | 4013 | |
| probówka z nakrętką do usunięcia | Seaton Scientific | 4014 | |
| pipety serologiczne 5 ml | Costar | 4051 | |
| Pipetboy | Dowolny dostawca | ||
| Pipety transferowe 15 ml | ISC Bioexpress | P-5005-7 | |
| Jednorazowe pipety transferowe 5,8 ml, z cienką końcówką | VWR international | 14670-329 | |
| probówki wirówkowe 15 ml | Falcon BD | ||
| probówki do wirówki o pojemności 1 ml | Dowolny dostawca | ||
| tabletki soli buforu Tris | Sigma-Aldrich | T5030-100TAB | |
| Ultrawirówka i rotor | Sorvall, Thermo Scientific | 90SE i T-1270 | |
| płytki PCR 96-dołkowe | Bio-Rad | HSS-9601 | |
| Zbiornik na odczynniki 50 ml | Costar | 4870 | |
| Optyczna płytka reakcyjna Microamp z 96 dołkami | Applied Biosystems | N801-0560 | |
| Pokrywy do płytek optycznych | Applied Biosystems | 4333183 | |
| Podkładka kompresyjna MicroAmp Optical | Applied Biosystems | 4312639 | |
| folia Microseal A | Bio-Rad | MSA-5001 | |
| probówki do wirowania o pojemności 2 ml | Dowolny dostawca | ||
| żele agarozy 1% (E-gel, Invitrogen) | Invitrogen | G-7008-01 | |
| E-base (Invitrogen) | Invitrogen | EB-M03 | |
| Probówki do pobierania krwi z EDTA dowolnej marki |
Bibliografia
- Amara, R. R., Villinger, F., Altman, J. D., Lydy, S. L., O'Neil, S. P., Staprans, S. I., Montefiori, D. C., Xu, Y., Herndon, J. G., Wyatt, L. S. Control of a mucosal challenge and prevention of AIDS by a multiprotein DNA/MVA vaccine. Vaccine. 20, 1949-1955 (2002).
- Dinoso, J., Kim, S., Blankson, J., Siliciano, R. F. Viral Dynamics of Elite Suppressors in HIV-1 Infection. Conference on Retroviruses and Opportunistic Infections. , (2008).
- Dinoso, J. B., Kim, S. Y., Wiegand, A. M., Palmer, S. E., Gange, S. J., Cranmer, L., O'Shea, A., Callender, M., Spivak, A., Brennan, T., Kearney, Treatment intensification does not reduce residual HIV-1 viremia in patients on highly active antiretroviral therapy. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 9403-9408 (2009).
- Doria-Rose, N. A., Klein, R. M., Manion, M. M., O'Dell, S., Phogat, A., Chakrabarti, B., Hallahan, C. W., Migueles, S. A., Wrammert, J., Ahmed, R., Nason, M., Wyatt, R. T., Mascola, J. R., Connors, M. Frequency and phenotype of human immunodeficiency virus envelope-specific B cells from patients with broadly cross-neutralizing antibodies. J. Virol. 83, 188-199 (2009).
- Dornadula, G., Zhang, H., Uitert, B. V. an, Stern, J., Livornese, L., Ingerman, M. J., Witek, J., Kedanis, R. J., Natkin, J., DeSimone, J., Pomerantz, R. J. Residual HIV-1 RNA in blood plasma of patients taking suppressive highly active antiretroviral therapy. JAMA. 282, 1627-1632 (1999).
- Gandhi, R. T., Zheng, L., Bosch, R. J., Chan, E. S., Margolis, D. M., Read, S., Kallungal, B., Palmer, S., Medvik, K., Lederman, M. M., Alatrakchi, N., Jacobson, J. M., Wiegand, A., Kearney, M., Coffin, J. M., Mellors, J. W., Eron, J. J. The effect of raltegravir intensification on low-level residual viremia in HIV-infected patients on antiretroviral therapy: a randomized controlled trial. PLoS medicine. 7, (2010).
- Gay, C., Dibben, O., Anderson, J. A., Stacey, A., Mayo, A. J., Norris, P. J., Kuruc, J. D., Salazar-Gonzalez, J. F., Li, H., Keele, B. F., Hicks, C., Margolis, D., Ferrari, G., Haynes, B., Swanstrom, R. Cross-sectional detection of acute HIV infection: timing of transmission, inflammation and antiretroviral therapy. PLoS One. 6, 19617-19617 (2011).
- Hatano, H., Delwart, E. L., Norris, P. J., Lee, T. H., Dunn-Williams, J., Hunt, P. W., Hoh, R., Stramer, S. L., Linnen, J. M., McCune, J. M., Martin, J. N., Busch, M. P., Deeks, S. G. Evidence for persistent low-level viremia in individuals who control human immunodeficiency virus in the absence of antiretroviral therapy. J. Virol. 83, 329-335 (2009).
- Havlir, D. V., Bassett, R., Levitan, D., Gilbert, P., Tebas, P., Collier, A. C., Hirsch, M. S., Ignacio, C., Condra, J., Gunthard, H. F., Richman, D. D., Wong, J. K. Prevalence and predictive value of intermittent viremia with combination hiv therapy. JAMA. 286, 171-179 (2001).
- Jordan, M. R., Kearney, M., Palmer, S., Shao, W., Maldarelli, F., Coakley, E. P., Chappey, C., Wanke, C., Coffin, J. M. Comparison of standard PCR/cloning to single genome sequencing for analysis of HIV-1 populations. J Virol Methods. 168, 114-120 (2010).
- Kaufmann, D. E., Kavanagh, D. G., Pereyra, F., Zaunders, J. J., Mackey, E. W., Miura, T., Palmer, S., Brockman, M., Rathod, A., Piechocka-Trocha, A., Baker, B., Zhu, B., Gall, S. L. e, Waring, M. T., Ahern, R., Moss, K., Kelleher, A. D. Upregulation of CTLA-4 by HIV-specific CD4+ T cells correlates with disease progression and defines a reversible immune dysfunction. Nat Immunol. 8, 1246-1254 (2007).
- Kearney, M., Maldarelli, F., Shao, W., Margolick, J. B., Daar, E. S., Mellors, J. W., Rao, V., Coffin, J. M., Palmer, S. HIV-1 Population Genetics and Adaptation in Newly Infected Individuals. J. Virol. 83, 2715-2727 (2008).
- Kearney, M., Palmer, S., Maldarelli, F., Shao, W., Polis, M. A., Mican, J., Rock-Kress, D., Margolick, J. B., Coffin, J. M., Mellors, J. W. Frequent polymorphism at drug resistance sites in HIV-1 protease and reverse transcriptase. AIDS. 22, 497-501 (2008).
- Kearney, M., Spindler, J., Shao, W., Maldarelli, F., Palmer, S., Hu, S. L., Lifson, J. D., Kewal Ramani, V. N., Mellors, J. W., Coffin, J. M., Ambrose, Z. Genetic diversity of simian immunodeficiency virus encoding HIV-1 reverse transcriptase persists in macaques despite antiretroviral therapy. Journal of Virology. 85, 1067-1076 (2011).
- Keele, B. F., Giorgi, E. E., Salazar-Gonzalez, J. F., Decker, J. M., Pham, K. T., Salazar, M. G., Sun, C., Grayson, T., Wang, S., Li, H., Wei, X., Jiang, C., Kirchherr, J. L., Gao, F., Anderson, J. A., Ping, L. H., Swanstrom, R. Identification and characterization of transmitted and early founder virus envelopes in primary HIV-1 infection. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. , 105-7552 (2008).
- Liu, S. L., Rodrigo, A. G., Shankarappa, R. G., Learn, H., Hsu, L., Davidov, O., Zhao, L. P., Mullins, J. I. HIV quasispecies and resampling. Science. 273, 415-416 (1996).
- Mahalanabis, M., Jayaraman, P., Miura, T., Pereyra, F., Chester, E. M., Richardson, B., Walker, B., Haigwood, N. L. Continuous viral escape and selection by autologous neutralizing antibodies in drug-naive human immunodeficiency virus controllers. J. Virol. 83, 662-672 (2009).
- Migueles, S. A., Connors, M. The Role of CD4(+) and CD8(+) T Cells in Controlling HIV Infection. Curr. Infect. Dis. Rep. 4, 461-467 (2002).
- Palmer, S., Kearney, M., Maldarelli, F., Halvas, E. K., Bixby, C. J., Bazmi, H., Rock, D., Falloon, J., Davey, R. T., Dewar, R. L., Metcalf, J. A., Hammer, S., Mellors, J. W., Coffin, J. M. Multiple, linked human immunodeficiency virus type 1 drug resistance mutations in treatment-experienced patients are missed by standard genotype analysis. J. Clin. Microbiol. 43, 406-413 (2005).
- Palmer, S., Wiegand, A. P., Maldarelli, F., Bazmi, H., Mican, J. M., Polis, M., Dewar, R. L., Planta, A., Liu, S., Metcalf, J. A., Mellors, J. W., Coffin, J. M. New real-time reverse transcriptase-initiated PCR assay with single-copy sensitivity for human immunodeficiency virus type 1 RNA in plasma. J. Clin. Microbiol. 41, 4531-4536 (2003).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
