Podawanie substancji terapeutycznych poprzez wstrzyknięcia dopłaczkowe (ICV) i dożylne (IV) u myszy

Podsumowanie

W niniejszym artykule zaprezentowano dwie bardzo różne metody iniekcji: 1) do mózgu (do komór mózgu) oraz 2) systemową (dożylną), w celu wprowadzenia czynników terapeutycznych do ośrodkowego układu nerwowego noworodków myszy.

Streszczenie

Mimo ochronnej roli, jaką pełni bariera krew-mózg w osłanianiu mózgu, ogranicza ona dostęp do ośrodkowego układu nerwowego (OUN), co najczęściej prowadzi do niepowodzeń w przypadku potencjalnych terapii opracowanych w celu leczenia schorzeń neurodegeneracyjnych ^1,2. Choroby neurodegeneracyjne, takie jak rdzeniowy zanik mięśni (SMA), w których dotknięte są dolne motoneurony, mogą przynieść znaczne korzyści dzięki wprowadzeniu środków terapeutycznych do OUN. Celem niniejszego filmu jest zaprezentowanie dwóch różnych schematów iniekcji w celu dostarczenia materiałów terapeutycznych do noworodkowych myszy wkrótce po urodzeniu. Jedną z tych metod jest wstrzykiwanie bezpośrednio do bocznych komór mózgowia (dojamaszkowo), co skutkuje dostarczeniem materiałów do OUN poprzez płyn mózgowo-rdzeniowy ^3,4. Drugą metodą jest iniekcja do żyły skroniowej (dożylnie), która pozwala na wprowadzenie różnych środków terapeutycznych do układu krwionośnego, prowadząc do dostarczenia systemowego, w tym do OUN ⁵. Szeroka transdukcja OUN jest możliwa do osiągnięcia przy zastosowaniu odpowiedniego wektora wirusowego i serotypu wirusa. Wizualizacja i wykorzystanie żyły skroniowej do iniekcji jest wykonalne do 6. dnia po urodzeniu. Jednakże, jeśli dostarczany materiał ma dotrzeć do OUN, iniekcje te powinny odbyć się w czasie, gdy bariera krew-mózg jest bardziej przepuszczalna ze względu na jej niedojrzałość, najlepiej przed 2. dniem po urodzeniu. W pełni rozwinięta bariera krew-mózg znacznie ogranicza skuteczność dostarczania dożylnego. Oba systemy dostarczania są proste i skuteczne po osiągnięciu odpowiedniej sprawności chirurgicznej. Nie wymagają one żadnych rozbudowanych urządzeń chirurgicznych i mogą być wykonane przez jedną osobę. Niemniej jednak techniki te nie są pozbawione trudności. Mały rozmiar szczeniąt w 2. dniu po urodzeniu i wynikające z tego małe obszary docelowe mogą sprawić, że iniekcje będą trudne do wykonania i początkowo trudne do powtórzenia.

Protokół

1. Iniekcja do komór mózgu

1. Pierwszym krokiem jest przygotowanie roztworów zapasowych do iniekcji; są to roztwory wektora wirusowego, plazmidowego DNA oraz leków, które należy wstrzykiwać w warunkach sterylnych.
2. Wymieszać pożądany miano wektora wirusowego (łącznie 5-7 μL) z 0,05% w/v błękitem trypanowym w PBS w celu wizualizacji miejsca iniekcji.
3. Roztwór plazmidowego DNA (łącznie 5 μL) zawiera D-(+)-glukozę 20% (w/v) (1 μL), błękit trypanowy (0,05%) w PBS (1 μL), plazmid (˜5 μg/μL) (2 μL) oraz liniowy homopolimer PEI 2,5 kDa (150 mM) (1 μL).
4. Unieruchomić noworodki w dniu PND 2 poprzez krioanestezję przez 1-2 minuty.
5. Igłą używaną do tej iniekcji jest wysterylizowana szklana mikropipeta z kalibracją mikrolitrową, przymocowana do strzykawki Hamilton 3 mL za pomocą długiej rurki.
6. Odłamać końcówkę igły (za pomocą szpatułki), aby dostosować ją do penetracji czaszki na głębokość 2 mm. Umieścić igłę ukośnie w probówce do mikrocentryfugi zawierającej roztwór do iniekcji. Nabrać roztwór do igły, ostrożnie odciągając tłok strzykawki.
7. Po pobraniu roztworu oddzielić strzykawkę od probówki, odciągnąć tłok nieco wyżej, a następnie ponownie połączyć go z igłą.
8. Trzymać igłę w prawej ręce między kciukiem a palcem wskazującym, a strzykawkę umieścić między palcem środkowym a serdecznym tak, aby tłok dotykał wnętrza dłoni prawej ręki.
9. Mocno chwycić unieruchomioną mysz lewą ręką za skórę za głową i umieścić ją na świetle światłowodowym, aby oświetlić odpowiednie struktury anatomiczne, które mogą służyć jako punkty orientacyjne.
10. Wprowadzić igłę na głębokość 2 mm, prostopadle do powierzchni czaszki, w miejscu oddalonym o około 0,25 mm bocznie od szwu strzałkowego i 0,50–0,75 mm rostralnie od noworodkowego szwu wieńcowego (Ryc. 1A). Następnie, bardzo powoli i ostrożnie pchnąć tłok wnętrzem dłoni prawej ręki. Monitorować pod kątem pęknięcia naczyń lub obrzęku twarzy.
11. Wyjąć igłę 15 sekund po zaprzestaniu ruchu tłoka, aby zapobiec cofaniu się roztworu.
12. W celu rekonwalescencji trzymać myszy przez 5–10 minut w ogrzewanym pojemniku, aż do czasu powrotu ruchomości i ogólnej responsywności.

2. Iniekcja dożylna poprzez żyłę skroniową/twarzową

1. Roztwór do wstrzyknięcia należy przygotować i uzupełnić przefiltrowanym zielonym barwnikiem spożywczym w rozcieńczeniu 1:100, a następnie wstrzyknąć w warunkach sterylnych.
2. Do końca szklanej strzykawki Hamiltona o pojemności 100 μL przymocować mały plastikowy łącznik luer. Do łącznika luer przymocować igłę hipodermiczną o rozmiarze 33 gauge i długości 0,25 cala. Należy upewnić się, że wszystkie elementy są szczelnie połączone.
3. Napełnić strzykawkę objętością do wstrzyknięcia, upewniając się, że w strzykawce nie ma powietrza, ponieważ wstrzyknięcie powietrza do naczynia jest śmiertelne. Często pomocne jest nanieienie pipetą objętości do wstrzyknięcia na kawałek parafilmu. Pozwala to na wyraźną wizualizację pobierania roztworu do strzykawki.
4. Do łatwej wizualizacji powierzchownej żyły skroniowej lub żyły twarzowej u noworodka stosuje się transluminator Wee Sight (rycina 2A). Przed wstrzyknięciem należy przymocować noworodka do transluminatora za pomocą taśmy chirurgicznej. Między noworodka a taśmę należy umieścić gazę, aby zapobiec uszkodzeniu skóry zwierzęcia przez taśmę. Zwierzę należy przymocować do transluminatora na boku, dbając o to, aby taśma nie utrudniała oddychania. Szyję noworodka należy delikatnie obrócić tak, aby żyła twarzowa była łatwo widoczna, a nos przykleić taśmą w celu stabilizacji głowy.
5. Używając powiększalnika na opasce o powiększeniu 2,25X w celu łatwiejszej wizualizacji, powoli wprowadzić igłę do żyły. Żyła jest bardzo powierzchowna, więc igła powinna pozostać widoczna pod skórą.
6. Powoli wprowadzić objętość roztworu do żyły. Zielony barwnik umożliwia łatwą wizualizację wstrzyknięcia.
7. Odczekać 15 sekund przed wyjęciem igły, ponieważ ze względu na ekstremalnie wąski światło igły występuje opóźnienie między pełnym wciśnięciem tłoka strzykawki a wypchnięciem pozostałego roztworu.
8. Po wyjęciu igły użyć gazy, aby wywrzeć ucisk w miejscu wstrzyknięcia, aż do ustąpienia krwawienia.
9. Monitorować noworodka pod kątem oznak stresu. Po prawidłowym wstrzyknięciu nie powinny być obserwowane żadne wyraźne oznaki stresu. Noworodkowi należy dać około 5 minut na regenerację przed powrotem do klatki.
10. Między wstrzyknięciami przemyć zestaw igła/strzykawka roztworem PBS, ponieważ krew w igle szybko ją zapcha ze względu na małe światło.

3. Reprezentatywne wyniki:

Iniekcja ICV: Mózg można pobrać w różnych punktach czasowych po iniekcji i poddać wizualizacji, aby zademonstrować poprawność techniki wstrzykiwania. Jeśli do roztworu do iniekcji nie zostanie dodany barwnik, trudne będzie sprawdzenie precyzji podania. Prawidłowa iniekcja do jednego z komór pozwoli na rozprowadzenie błękitu trypanu po wstrzykniętej stronie mózgu około 10-15 minut po iniekcji (Rycina 1B). Jednolity rozkład błękitu trypanu w prawej i lewej półkuli mózgu oraz w opuszkach węchowych będzie widoczny około 60 minut po iniekcji (Rycina 1C). Wynika to z połączenia komór mózgu, co umożliwia rozprzestrzenienie się niebieskiego barwnika do sąsiedniej komory. Precyzyjne iniekcje można również zweryfikować poprzez rozproszenie niebieskiego barwnika w rostralnej części centralnego kanału rdzeniowego w ciągu około 12 godzin po iniekcji (Rycina 1D). Nieprawidłowe iniekcje można rozpoznać po braku niebieskiego zabarwienia w półkulach mózgu. W takim przypadku głębokość wprowadzenia igły była niewystarczająca i roztwór do iniekcji prawdopodobnie rozprzestrzenił się pod skórą. Inną możliwością jest zbyt głębokie wprowadzenie igły do mózgu, co spowodowało przejście poza komorę i wylanie roztworu pod komory mózgu.

Iniekcja dożylna (IV): Prawidłowe i efektywne wstrzyknięcie do żyły skroniowej/twarzowej można zwizualizować bezpośrednio po wykonaniu zabiegu. W miarę wstrzykiwania roztworu, zielony barwnik pozwala na obserwację wprowadzania i przepływu cieczy przez żyłę twarzową (Rycina 2A). Dodatkowo, po iniekcji zaobserwowana zostanie zmiana koloru skóry myszy. Naturalny różowy kolor noworodka zmienia się w zielony ze względu na obecność zielonego barwnika spożywczego w roztworze wstrzykiwanym (Rycina 2B). Stopień zaobserwowanej zmiany koloru noworodka na zielony zależy od zastosowanego stężenia barwnika. W celu prostej wizualizacji iniekcji oraz w okresie ćwiczeń zaleca się rozcieńczenie 1:50. Jednakże, gwałtowna zmiana koloru skóry często prowadzi do odrzucenia szczeniaka przez matkę, dlatego podczas procedur eksperymentalnych należy rozważyć rezygnację z barwnika lub znaczne zmniejszenie jego stężenia. Nieprawidłowa iniekcja spowoduje gromadzenie się zielonego barwnika pod skórą w miejscu wkłucia. Niepełna iniekcja, która występuje, gdy otwór igły nie jest całkowicie wprowadzony do żyły, objawia się przepływem części roztworu do żyły i gromadzeniem się pozostałej części pod skórą. W takim przypadku igłę należy wprowadzić głębiej do naczynia.

Rysunek 1. Demonstracja pomyślnych iniekcji I.C.V. u myszy PDN2. A) Schemat miejsc iniekcji wykorzystanych podczas iniekcji I.C.V. do komór mózgu. B) Mózg szczenięcia po iniekcji I.C.V. błękitu trypanu w PBS do lewej komory, zdjęcie wykonane 15 minut po iniekcji. C) Mózg szczenięcia po iniekcji I.C.V. błękitu trypanu w PBS do lewej komory, zdjęcie wykonane 60 minut po iniekcji. D) Przednia część centralnego kanału kręgowego pokazana u szczenięcia po iniekcji I.C.V. błękitu trypanu w PBS do lewej komory, zdjęcie wykonane 12 godzin po iniekcji.

Rycina 2. Demonstracja prawidłowego wykonywania wstrzyknięć dożylnych u myszy PDN2. A) Schemat żyły twarzowej wykorzystywanej do iniekcji dożylnych. B) Szczenię z dożylnym wtryskiem zielonego barwnika w PBS w porównaniu z niewtryśniętym rówieśnikiem z tego samego miotu. Zdjęcie wykonane bezpośrednio po wtryśnięciu.

Dyskusja

Badania z wykorzystaniem mysich modeli chorób często wymagają podawania leków lub innych substancji noworodkom. W tym filmie prezentujemy krok po kroku procedury obejmujące dwie strategie iniekcji, które można zastosować w celu ukierunkowania na OUN: 1) bezpośrednią iniekcję do OUN z wykorzystaniem iniekcji dokomorowej (ICV) lub 2) iniekcję IV z wykorzystaniem żyły skroniowej/twarzowej. Czas wykonania tych iniekcji ma ogromne znaczenie. Ponieważ iniekcje ICV są wykonywane bez prowadnic, czaszka musi być stosunkowo plasty...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Zielony barwnik spożywczy	McCormick & Co.	n/a	Musi zostać przefiltrowany
Szklana strzykawka Hamiltona (100 μL)	Sigma-Aldrich	20702
Nylonowy element białego gwintu LuerMxF	Small Parts, Inc.	VPLF-LC78-1-25
Cienkie igły podskórne	Popper & Sons, Inc.	7111	Rozmiar: 33(SWG) x ¼" (6.35 MM)
Transiluminator Wee Sight	Respironics	1017920
Opaska z powiększeniem 2,25X	MagEyes	Model No. 5	Wybierz powiększenie zgodnie z indywidualnymi preferencjami