W niniejszym artykule zaprezentowano dwie bardzo różne metody iniekcji: 1) do mózgu (do komór mózgu) oraz 2) systemową (dożylną), w celu wprowadzenia czynników terapeutycznych do ośrodkowego układu nerwowego noworodków myszy.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Podawanie substancji terapeutycznych poprzez wstrzyknięcia dopłaczkowe (ICV) i dożylne (IV) u myszy
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Mimo ochronnej roli, jaką pełni bariera krew-mózg w osłanianiu mózgu, ogranicza ona dostęp do ośrodkowego układu nerwowego (OUN), co najczęściej prowadzi do niepowodzeń w przypadku potencjalnych terapii opracowanych w celu leczenia schorzeń neurodegeneracyjnych 1,2. Choroby neurodegeneracyjne, takie jak rdzeniowy zanik mięśni (SMA), w których dotknięte są dolne motoneurony, mogą przynieść znaczne korzyści dzięki wprowadzeniu środków terapeutycznych do OUN. Celem niniejszego filmu jest zaprezentowanie dwóch różnych schematów iniekcji w celu dostarczenia materiałów terapeutycznych do noworodkowych myszy wkrótce po urodzeniu. Jedną z tych metod jest wstrzykiwanie bezpośrednio do bocznych komór mózgowia (dojamaszkowo), co skutkuje dostarczeniem materiałów do OUN poprzez płyn mózgowo-rdzeniowy 3,4. Drugą metodą jest iniekcja do żyły skroniowej (dożylnie), która pozwala na wprowadzenie różnych środków terapeutycznych do układu krwionośnego, prowadząc do dostarczenia systemowego, w tym do OUN 5. Szeroka transdukcja OUN jest możliwa do osiągnięcia przy zastosowaniu odpowiedniego wektora wirusowego i serotypu wirusa. Wizualizacja i wykorzystanie żyły skroniowej do iniekcji jest wykonalne do 6. dnia po urodzeniu. Jednakże, jeśli dostarczany materiał ma dotrzeć do OUN, iniekcje te powinny odbyć się w czasie, gdy bariera krew-mózg jest bardziej przepuszczalna ze względu na jej niedojrzałość, najlepiej przed 2. dniem po urodzeniu. W pełni rozwinięta bariera krew-mózg znacznie ogranicza skuteczność dostarczania dożylnego. Oba systemy dostarczania są proste i skuteczne po osiągnięciu odpowiedniej sprawności chirurgicznej. Nie wymagają one żadnych rozbudowanych urządzeń chirurgicznych i mogą być wykonane przez jedną osobę. Niemniej jednak techniki te nie są pozbawione trudności. Mały rozmiar szczeniąt w 2. dniu po urodzeniu i wynikające z tego małe obszary docelowe mogą sprawić, że iniekcje będą trudne do wykonania i początkowo trudne do powtórzenia.
Protokół
1. Iniekcja do komór mózgu
- Pierwszym krokiem jest przygotowanie roztworów zapasowych do iniekcji; są to roztwory wektora wirusowego, plazmidowego DNA oraz leków, które należy wstrzykiwać w warunkach sterylnych.
- Wymieszać pożądany miano wektora wirusowego (łącznie 5-7 μL) z 0,05% w/v błękitem trypanowym w PBS w celu wizualizacji miejsca iniekcji.
- Roztwór plazmidowego DNA (łącznie 5 μL) zawiera D-(+)-glukozę 20% (w/v) (1 μL), błękit trypanowy (0,05%) w PBS (1 μL), plazmid (˜5 μg/μL) (2 μL) oraz liniowy homopolimer PEI 2,5 kDa (150 mM) (1 μL).
- Unieruchomić noworodki w dniu PND 2 poprzez krioanestezję przez 1-2 minuty.
- Igłą....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Badania z wykorzystaniem mysich modeli chorób często wymagają podawania leków lub innych substancji noworodkom. W tym filmie prezentujemy krok po kroku procedury obejmujące dwie strategie iniekcji, które można zastosować w celu ukierunkowania na OUN: 1) bezpośrednią iniekcję do OUN z wykorzystaniem iniekcji dokomorowej (ICV) lub 2) iniekcję IV z wykorzystaniem żyły skroniowej/twarzowej. Czas wykonania tych iniekcji ma ogromne znaczenie. Ponieważ iniekcje ICV są wykonywane bez prowadnic, czaszka musi być stosunkowo plasty.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.
Podziękowania
Autorzy chcieliby podziękować Johnowi Marstonowi za ekspercką opiekę nad zwierzętami oraz dr. Marco A. Passiniemu za pomoc techniczną we wczesnych etapach projektu. Praca ta została sfinansowana z grantów National Institutes of Health przyznanych C.L.L. (R01NS41584; R01HD054413).
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Zielony barwnik spożywczy | McCormick & Co. | n/a | Musi zostać przefiltrowany |
| Szklana strzykawka Hamiltona (100 μL) | Sigma-Aldrich | 20702 | |
| Nylonowy element białego gwintu LuerMxF | Small Parts, Inc. | VPLF-LC78-1-25 | |
| Cienkie igły podskórne | Popper & Sons, Inc. | 7111 | Rozmiar: 33(SWG) x ¼" (6.35 MM) |
| Transiluminator Wee Sight | Respironics | 1017920 | |
| Opaska z powiększeniem 2,25X | MagEyes | Model No. 5 | Wybierz powiększenie zgodnie z indywidualnymi preferencjami |
Bibliografia
- Blanchette, M., Fortin, D. Blood-brain barrier disruption in the treatment of brain tumors. Methods Mol. Biol. 686, 447-463 (2011).
- Foust, K. D., Kaspar, B. K. Over the barrier and through the blood: to CNS delivery we go. Cell Cycle. 24, 4017-4018 (2009).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
