Rogówka jest wyjątkowa ze względu na brak tkanek naczyniowych. Niemniej jednak, silne czynniki angiogenne mogą indukować intensywny wzrost i przeżywalność naczyń krwionośnych w rogówce. W związku z tym rogówka może stanowić cenne narzędzie w badaniach nad angiogenezą. Niniejszy protokół demonstruje, jak wykonać model kieszonkowy w rogówce myszy oraz jak ocenić indukowaną przez czynniki angiogenne angiogenezę z wykorzystaniem tego modelu.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Myszowy model testu kieszonki rogówkowej do badań angiogenezy
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Normalna rogówka nie zawiera tkanek naczyniowych. Jednak w rogówce można wywołać wzrost i przeżycie naczyń krwionośnych po podaniu silnych czynników angiogennych 1. Ta unikalna cecha sprawiła, że test kieszonkowy rogówki stał się jednym z najczęściej stosowanych modeli w badaniach nad angiogenezą. Rogówka składa się z wielu warstw komórek. Można zatem osadzić w niej pellet zawierający badany czynnik angiogenny, aby zbadać jego efekt angiogenny 2,3. W niniejszym materiale przedstawiamy szczegółową instrukcję, jak (I) przygotować pellet zawierający czynnik angiogenny, (II) osadzić pellet w rogówce oraz (III) przeanalizować angiogenezę indukowaną przez badany czynnik angiogenny. Ponieważ podstawowy czynnik wzrostu fibroblastów (bFGF) jest znany jako jeden z najsilniejszych czynników angiogennych 4, został on tutaj wykorzystany do indukowania angiogenezy w rogówce.
Protokół
Wszystkie użyte urządzenia i odczynniki są sterylne. Protokół został zatwierdzony przez Komitet ds. Opieki i Wykorzystania Zwierząt (Animal Care and Use Committee, ACUC) w NEI/NIH (protokół badań na zwierzętach NEI-553) i przeprowadzony zgodnie z wytycznymi oraz regulacjami NIH.
1. Przygotowanie peletek zawierających czynnik angiogenny
W tej części przygotowywane są pelety zawierające interesujący nas czynnik angiogenny.
- Przygotować 10% (w/v) roztwór sukralfalatu w PBS. Przechowywać w temperaturze pokojowej.
- Przygotować 12% (w/v) poly-HEMA w bezwodnym etanolu. Przechowywać w temperaturze pokojowej.
- Przygotować roztwór bFGF o stężeniu 1 μg/μl. Przechowywać w -80 °C.
- Aby przygotować 50 peletów, zmieszać 5 μl poly-HEMA, 1 μl sukralfalatu oraz 4 μl roztworu bFGF i dokładnie wymieszać na wortexie.
- Umieścić kawałek czystej parafilmy w szalce Petriego i naświetlać światłem UV przez 15 min w komorze do hodowli tkanek. Na parafilmę nanieść kroplą 0,2 μl mieszaniny roztworów na jeden pelet. W ten sposób 10 μl mieszaniny powinno pozwolić na uzyskanie 50 peletów. Pozostawić pelety do wyschnięcia w temperaturze pokojowej przez 1-2 godziny. Wysuszone pelety można przechowywać w 4 °C przez kilka dni lub w -80 °C przez kilka miesięcy.
- W celu użycia, ostrożnie podważyć i podnieść pelety końcówkami pęsety. Należy zachować szczególną ostrożność, aby ich nie złamać ani nie doprowadzić do ich odskoczenia.
2. Wykonywanie testu kieszonkowego w rogówce myszy
W tej części zademonstrujemy, jak wykonać kieszonkę w rogówce myszy oraz jak wprowadzić do niej pellet. Czynnik angiogenny zawarty w pellecie będzie stopniowo uwalniany do okolicznych obszarów rogówki (Rys. 1). W tym pokazie wykorzystujemy 8-tygodniowe samice myszy C57/Bl6.
- Myszy poddaje się głębokiej anestezji systemowej mieszaniną ketaminy (75 mg/kg) i ksylazyny (5 mg/kg, wstrzyknięcie d.o.). Pozwoli to utrzymać mysz w stanie znieczulenia przez 30-60 min. Na rogówkę nakłada się miejscowy środek znieczulający (0,5% HCl proparakainy). Po 5 min unieruchamia się jedno oko pod mikroskopem dissectingowym.
- Za pomocą noża do zaćmy von Graefe wykonuje się bardzo delikatne nacięcie w środkowej części rogówki, 1,2-1,4 mm od limbusa rogówki (jak pokazano na Rysunku 1). Należy zachować szczególną ostrożność, aby nie przeciąć rogówki na wylot.
- Pod warstwą nabłonka rogówki tworzy się kieszonkę, wprowadzając poziomo nóż w środek rogówki i ostrożnie przesuwając go w stronę limbusa (Rys. 1). Rozmiar kieszonki musi być wystarczający, aby pomieścić jeden pellet zawierający czynnik angiogenny. Należy zachować szczególną ostrożność, aby nie przebić rogówki.
- Za pomocą pęsety powoli wprowadza się pellet do kieszonki. Należy starać się, aby pellet był jak najbardziej płaski.
- Po implantacji pelletu na oko nakłada się miejscową okulistyczną maść z antybiotykiem. Narzędzia przeciera się wacikami nasączonymi 70% alkoholem pomiędzy zwierzętami.
- Mysz przenosi się w ciepłe i suche miejsce i monitoruje do momentu, aż będzie w stanie utrzymać wyprostowaną postawę, a następnie umieszcza się ją z powrotem w klatce domowej. Przeciwbólowe leki systemowe (np. buprenorfina, 2 mg/kg, wstrzyknięcie d.o.) oraz miejscową maść z antybiotykiem (np. gentamycynę) podaje się dwa razy dziennie przez 2 dni po operacji, a stan myszy monitoruje się ściśle przez 3 dni. Oczekuje się, że gojenie zakończy się w ciągu pierwszych 48 godzin po operacji. Oko z kieszonką będzie badane za pomocą biomikroskopu lampowego między 4. a 10. dniem po implantacji pelletu.
3. Reprezentatywne wyniki
- Siedem dni po implantacji pelletu mysz zostaje znieczulona ogólnie i miejscowo zgodnie z opisem w punkcie 2.1.
- Za pomocą mikroskopu stereoskopowego obserwuje się naczynia krwionośne w rogówce indukowane przez czynnik angiogenny. W rogówce traktowanej nośnikiem nie obserwuje się wzrostu naczyń krwionośnych (Rys. 2A, rogówka traktowana nośnikiem). W rogówce traktowanej bFGF widoczna jest intensywna angiogeneza (Rys. 2B). Wzrost naczyń krwionośnych można ocenić, mierząc maksymalną długość naczyń (od prawidłowych naczyń limbalnych do wierzchołka nowych naczyń) oraz całkowitą powierzchnię naczyń krwionośnych (Rys. 2B, zaznaczoną czerwoną przerywaną linią w rogówce traktowanej bFGF). Opisano również inne metody ilościowe 2,5.
Rysunek 1. A. Prawidłowa rogówka z barwieniem H&E. W prawidłowej rogówce nie występują naczynia krwionośne. B. Wykonanie kieszonki pod warstwą nabłonka rogówki. C. Osadzenie pelletu w kieszonce. D. Czynnik angiogenny uwalniany jest z pelletu, a nowe naczynia krwionośne wyrastają z prawidłowych naczyń zakątka rogówki.
Rysunek 2. Reprezentatywny wynik pięć dni po implantacji pelletu. A. Rogówka z pelletem zawierającym wyłącznie nośnik. Brak tworzenia nowych naczyń krwionośnych w rogówce. Widoczne są jedynie istniejące wcześniej prawidłowe naczynia lembalne. B. Rogówka z pelletem zawierającym bFGF. Z istniejących wcześniej prawidłowych naczyń lembalnych wyrosły liczne nowe naczynia krwionośne (zaznaczone linią przerywaną).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Model testu z kieszonką w rogówce myszy został po raz pierwszy opisany w 1979 roku przez Muthukkaruppan VR i Auerbach R 6. Szczegółowe protokoły zostały opublikowane przez różne laboratoria 2,3,7,8. Nasze laboratorium modyfikowało i stosowało tę metodę w badaniach przez wiele lat 4. Test z kieszonką w rogówce myszy jest stosunkowo prostym modelem o dużej powtarzalności. Inną zaletą tego modelu jest fakt, że ponieważ rogówka normalnie nie posiada naczyń krwionośnych, poziom tła w tym teści...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Nie zgłoszono żadnych konfliktów interesów.
Podziękowania
Nasze badania są wspierane przez Program Badań Wewnątrzinstytucjonalnych NIH, National Eye Institute.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Mikroskop stereoskopowy | World Precision Instruments, Inc. | PZMIV-BS | |
| Nóż do katarakty Von Graefe (ostrze 1,5x25mm, płaskie) | Ambler Surgical | 3401E | |
| Pinceta Dumont #5 | Fine Science Tools | 11252-50 | |
| Lampa szczelinowa | Carl Zeiss, Inc. | 30 SL-M | |
| Tabela 1. Sprzęt | |||
| bFGF (podstawowy czynnik wzrostu fibroblastów) | PeproTech Inc | 100-18B | |
| Sukralfat (kompleks sacharozy oktasiarczanu—glinu) | Sigma-Aldrich | S0652 | 10% w PBS |
| poly-HEMA (poli(metakrylan 2-hydroksyetylu)) | Sigma-Aldrich | P3932 | 12% w etanolu |
| Tabela 2. Odczynniki i materiały |
Bibliografia
- Cao, Y., Linden, P., Shima, D., Browne, F., Folkman, J. In vivo angiogenic activity and hypoxia induction of heterodimers of placenta growth factor/vascular endothelial growth factor. The Journal of clinical investigation. 98, 2507-2511 (1996).
- Rogers, M. S., Birsner, A. E., D'Amato, R. J. The mouse cornea micropocket angiogenesis assay. Nature. 2, 2545-2550 (2007).
- Poche, R. A., Saik, J. E., West, J. L., Dickinson, M. E. The mouse cornea as a transplantation site for live imaging of engineered tissue constructs. Cold Spring Harbor protocols. , 5416-54 (2010).
- Zhang, F. VEGF-B is dispensable for blood vessel growth but critical for their survival, and VEGF-B targeting inhibits pathological angiogenesis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , 106-6152 (2009).
- Tong, S., Yuan, F. Dose response of angiogenesis to basic fibroblast growth factor in rat corneal pocket assay: I. Experimental characterizations. Microvascular research. 75, 10-15 (2008).
- Muthukkaruppan, V., Auerbach, R. Angiogenesis in the mouse cornea. Science. 205, 1416-1418 (1979).
- Ziche, M. Corneal assay for angiogenesis. Methods in molecular medicine. 46, 131-142 (2001).
- Ziche, M., Morbidelli, L. The corneal pocket assay. Methods in molecular biology. 467, 319-329 (2009).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
