Długoterminowa hodowla próbek raka piersi u ludzi i ich analiza z wykorzystaniem optycznej tomografii projekcyjnej

Podsumowanie

Opracowaliśmy oparty na kolagenie test in vitro, który stymuluje proliferację i inwazję w próbkach wszystkich podtypów raka piersi. Do wizualizacji i kwantyfikacji ekspansji guza wykorzystano optyczną tomografię projekcyjną, będącą techniką mikroskopii trójwymiarowej. Test ten może być wykorzystywany do ilościowej oceny odpowiedzi na leki w poszczególnych próbkach guzów.

Streszczenie

Rak piersi jest jedną z głównych przyczyn śmiertelności w świecie zachodnim. Powszechnie wiadomo, że rozprzestrzenianie się raka piersi, najpierw miejscowo, a następnie w odległych organach, jest kluczowym czynnikiem wpływającym na rokowania pacjentek. Eksperymentalne systemy badania raka piersi opierają się na liniach komórkowych, zwykle pochodzących z guzów pierwotnych lub wysięków opłucnowych. Badania te ograniczają dwie główne przeszkody: (i) niektóre znane podtypy raka piersi (zwłaszcza guzy luminalne B o złych rokowaniach) nie są reprezentowane w obecnych kolekcjach linii komórkowych; (ii) zazwyczaj nie bierze się pod uwagę wpływu mikrośrodowiska guza.

Prezentujemy technikę hodowli pierwotnych próbek raka piersi wszystkich podtypów. Osiąga się to poprzez zastosowanie trójwymiarowego (3D) systemu hodowli, w którym niewielkie fragmenty guza są zatapiane w miękkich poduszkach z kolagenu I szczura. W ciągu 2-3 tygodni komórki nowotworowe rozprzestrzeniają się w kolagenie i tworzą różnorodne struktury podobne do tych obserwowanych w guzach ludzkich1. W badaniu histologicznym stwierdzono obecność żywych adipocytów, komórek nabłonkowych i fibroblastów w obrębie pierwotnego rdzenia. Wykazano, że złośliwe komórki nabłonkowe o morfologii płaskonabłonkowej naciekają do otaczającego kolagenu. W komórkach tych widoczny był pleomorfizm jądrowy, a także figury mitotyczne i ciałka apoptotyczne.

Wykorzystaliśmy optyczną tomografię projekcyjną (OPT), technologię obrazowania 3D, aby określić stopień rozprzestrzeniania się guza w hodowli. Użyliśmy OPT do pomiaru całkowitej objętości hodowli nowotworowej, parametru rutynowo mierzonego podczas leczenia neoadjuwantowego pacjentek z rakiem piersi w celu oceny odpowiedzi na terapię lekową.

W niniejszej pracy przedstawiamy możliwość hodowli ludzkich guzów piersi bez stronniczości względem podtypów oraz kwantyfikacji ich rozprzestrzeniania się ex vivo. Metoda ta mogłaby zostać wykorzystana w przyszłości do oceny wrażliwości na leki w oryginalnym guzie. Może to zapewnić model o większej wartości prognostycznej niż obecnie stosowane linie komórkowe.

Protokół

1. Wyodrębnianie kolagenu z ogonów szczura

1. Umieścić zamrożone, świeże ogony szczurów w 70% etanolu.
2. Usunąć skalpelem skórę, aby odsłonić ścięgna.
3. Oddzielić ścięgna od ogona i umieścić w 70% etanolu w celu sterylizacji.
4. Zważyć zebrane ścięgna i przenieść do kwasu octowego (1g ścięgna na 250ml 0.5M kwasu octowego). Mieszać przez 48hr w 4°C.
5. Odwirować mieszaninę ścięgien i kwasu octowego przy 10,000g przez 30min, a następnie odrzucić osad.
6. Do supernatantu dodać taką samą objętość 10% (w/v) NaCl i pozostawić mieszaninę przez noc w 4°C.
7. Zebrać bogatą w kolagen, nierozpuszczalną warstwę dolną i wirować przez kolejne 30min przy 10,000g.
8. Resuspendować materiał bogaty w kolagen w 0.25M kwasie octowym w 4°C i dializować przeciwko kwasowi octowemu w proporcji 1:1000 w 4°C przez 3 dni, zmieniając bufor do dializy dwa razy dziennie.
9. Dalszą sterylizację roztworu kolagenu przeprowadzić poprzez wirowanie (20,000g przez 2hr) i przechowywać w 4°C.
10. Rozcieńczyć kolagen w razie potrzeby, dodając sterylny kwas octowy 1:1000, aż do uzyskania stężenia zapasu 1mg/ml.

2. Tworzenie testu 3D

Test 3D opiera się na teście z wykorzystaniem linii komórkowej, opublikowanym wcześniej².

1. Wielokrotne biopsje gruboigłowe pobiera się od pacjentek wyrażających zgodę w czasie radykalnej resekcji chirurgicznej w przebiegu inwazyjnego raka piersi.
2. Za pomocą skalpela podzieli się rdzenie na fragmenty o objętości 1mm³, oceniając to wizualnie. Odcina się i usuwa makroskopowo wyraźną tkankę tłuszczową.
3. Fragmenty zanurza się w pożywce MEGM Complete. Tkankę można przechowywać w tym stanie do 1hr.
4. Aby przygotować żel kolagenowy, miesza się w lodzie kolagen z ogona szczura (1mg/ml), przefiltrowany kwas octowy (1:1000), 10x DMEM/F12 oraz 0.22M NaOH w stosunku 3:5:1:1, aby uzyskać końcowe stężenie kolagenu 0.3mg/ml.
5. Do poszczególnych dołków płytki 24-dołkowej wstrzykuje się 1.2ml mieszaniny kolagenowej, a następnie umieszcza ją w inkubatorze w temperaturze 37 °C na 10min w celu zainicjowania żelowania.
6. Po 10min wyjmuje się płytkę 24-dołkową z inkubatora. Kawałki guza układa się na żelującym kolagenie i delikatnie wpycha do centrum żelu za pomocą końcówki pipety 10μl. Płytkę 24-dołkową zawraca się do inkubatora na 1hr.
7. W przypadku guzów ER+, pożywkę MEGM Complete uzupełnia się β-oestradiol do stężenia 3.2x10^-10 M. Po 1hr żelowania układów, ostrożnie wprowadza się 1.2ml uzupełnionej pożywki do każdego dołka. Końcowe stężenie β-oestradiol w układzie wyrówna się do poziomu 1.6x10^-10 M, aby odtworzyć fizjologiczne poziomy estrogenu występujące w tkance piersi³.
8. Końcówką pipety 10μl przesuwa się wzdłuż wewnętrznej krawędzi każdego dołka, uwalniając obwodowo każdy żel, co pozwala im swobodnie pływać w pożywce. Płytkę 24-dołkową zawraca się do inkubatora.
9. Uzupełnioną pożywkę wymienia się dwa razy w tygodniu aż do zakończenia eksperymentu. Eksperyment kończy się poprzez usunięcie pożywki i dodanie utrwalacza z formaliną.

3. Barwienie przeciwciałami prób do tomografii projekcyjnej optycznej

Zastosowano wcześniej opisaną metodę barwienia całych próbek⁴.

1. Próbki utrwalone formaliną płukać przez 30min w PBS. Odwadniać żele stopniowo w metanolu rozcieńczonym w PBS zawierającym 0,05% Tween 20 (0,05% PBST): 33%, 66% i 100% przez ≥15min na każdym etapie.
2. Tkankę inkubować w świeżo przygotowanej mieszaninie MeOH: DMSO: 30%H₂O₂ w stosunku 2:1:3 (15% v/v H₂O₂) w temperaturze pokojowej przez 24hr w celu wygaszenia autofluorescencji.
3. Próbki płukać dwukrotnie przez 30min w metanolu. Próbki mrozić do -80°C pięciokrotnie, za każdym razem przez co najmniej 1hr, a następnie ogrzewać do temperatury pokojowej (RT), aby zapewnić dostęp do antygenów w głębszych partiach tkanki.
4. Rehydratować tkankę z powrotem do 0,05% PBST, używając metanolu jako rozcieńczalnika (33%, 66% i 100% przez 15min na każdym etapie).
5. Blokować tkankę w roztworze blokującym (10% surowicy w 0,05% PBST) przez 24hr.
6. Tkankę inkubować z przeciwciałem pierwszorzędowym w celu identyfikacji komponentu nabłonkowego, używając królika przeciwko cytokeratynie w stężeniu 1:500 rozcieńczonym w 1,5ml roztworu blokującego zawierającego 5% DMSO przez 48hr.
7. Próbki płukać czterokrotnie w 0,05% PBST przez 30min każdorazowo.
8. Tkankę inkubować z fluorescencyjnym przeciwciałem wtórnym (1:100 koza przeciwko królikowi Alexa555), rozcieńczonym w 1,5ml roztworu blokującego zawierającego 5% DMSO przez 48hr.
9. Próbki płukać ponownie w 0,05% PBST czterokrotnie przez 30min każdorazowo.

4. Optyczna tomografia projekcyjna

Optyczna tomografia projekcyjna to technika mikroskopowa opracowana wcześniej w celu uzyskiwania wysokorozdzielczych obrazów 3D fluorescencyjnych preparatów biologicznych o grubości do 15 milimetrów⁵.

1. Osadź zabarwiony żel w 1% agarozie o niskiej temperaturze topnienia i odwadniaj w 100% metanolu przez 24h. Przejrzyść preparat w roztworze BABB (1:2 alkohol benzylowy, benzoesan benzylu) przez 48h, a następnie przeskanuj przy użyciu skanera OPT 3001M (Bioptonics).
2. Sygnał docelowy oraz autofluorescencję rejestruje się odpowiednio przy użyciu zestawu filtrów Cy3 (wzbudzenie 545nm/30 nm, emisja 610/75 nm) oraz zestawu filtrów GFP1 (wzbudzenie 425nm/40 nm, emisja LP475 nm).

5. Rekonstrukcja i kwantyfikacja 3D

1. Zestaw projekcji kątowych uzyskanych za pomocą OPT można zrekonstruować przy użyciu oprogramowania NRecon (SkyScan), aby stworzyć serię przekrojów poprzecznych testu inwazji. Oprogramowanie to jest dostępne do bezpłatnego pobrania pod adresem http://www.skyscan.be/products/downloads.htm.
2. Przeanalizuj zrekonstruowane dane przy użyciu oprogramowania Volocity (PerkinElmer). Bezpłatne oprogramowanie demonstracyjne jest dostępne do pobrania pod adresem http://www.cellularimaging.com/products/Volocity/demo/.
3. W celu ilościowego oznaczenia objętości nabłonka na podstawie barwienia cytokeratyną, ustaw minimalny próg intensywności woksela, aby zredukować zakłócenia wynikające z fluorescencji tła w kanale docelowym. Próg ten zdefiniowaliśmy empirycznie na poziomie 9000 a.u. Korzystając z listy dostępnych parametrów w aplikacji pomiarowej, określiliśmy objętość nabłonka pozostającego w ciągłości z oryginalnym rdzeniem (wyznaczonym w kanale autofluorescencyjnym). Pozwoliło to na ilościowe porównanie objętości przerostu nabłonka pomiędzy różnymi próbkami nowotworowymi.

6. Reprezentatywne wyniki:

Podczas opracowywania testu wykorzystano łącznie 52 próbki biopsji raka piersi o szerokim spektrum histopatologicznym. Z tej liczby

Typowe analizy (rycina 1) utrwalone po 20 dniach w hodowli kolagenowej, a następnie zabarwione na cytokeratynę. Oprogramowanie Volocity pozwala na rozpoznanie zarówno masy nabłonkowej ciągle połączonej z oryginalnym rdzeniem, jak i oddzielnych grup naciekających komórek, oraz na oddzielne ilościowe określenie każdej z tych objętości.

Rysunek 1. Testy inwazji po utrwaleniu i kwantyfikacji. Test obejmuje próbki pobrane z wielu podtypów raka piersi: a) ER+ b) HER2+ oraz c) ER- .

Dyskusja

Testy oparte na kolagenie do badania zachowania linii komórkowych nowotworów są obecnie szeroko stosowane ^6,7,8. Niemniej jednak testy te nie odzwierciedlały w pełni złożoności guza i jego środowiska. W niniejszym badaniu wykazujemy, że materiały z raka piersi u ludzi mogą być wykorzystane w podobny sposób, ex vivo. Ponadto OPT jest użytecznym narzędziem do charakteryzacji trójwymiarowej ekspansji raka piersi. Stwierdzono, że głównym ograniczeniem tej techniki jest dostępność materiału nowotworowego (pojedyncza biopsja gruboigłowa jest wystarczająca do przeprowadzenia 4-6 testów). Innym czynnikiem ograniczającym jest fakt, że inwazja strukturalna występuje tylko w około 40% testów. Aby temu zaradzić, około 7. dnia regularnie dodajemy dowolną pożądaną substancję leczniczą do wszystkich testów z widocznym wzrostem.

Zastosowanie OPT mogłoby zostać w przyszłości rozszerzone o wykrywanie zmian masowych, ex vivo, wynikających z leczenia farmakologicznego. Mogłoby to z kolei ułatwić bardziej zindywidualizowaną terapię nowotworową, niezależną od modeli zwierzęcych. Obecnie badamy odpowiedź guzów ER+ na tamoksyfen ex vivo.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
MEGM Complete	Lonza Inc.	CC-3150
DMEM/F12	Sigma-Aldrich	D8900 10X1L
β-–estradiol	Sigma-Aldrich	E8875-250MG
Królicze przeciwciało anty-cytokeratynowe	Dako	Z0622
Kozie przeciwciało anty-królicze Alexa555	Invitrogen	A21422
Wszystkie pozostałe standardowe odczynniki zostały zakupione w firmie Sigma-Aldrich.