Mapowanie hamujących obwodów neuronalnych za pomocą fotostymulacji skaningowej laserowej

Podsumowanie

Ten artykuł przedstawia podejście polegające na połączeniu fotostymulacji skaningowej laserowej z zapisami całych komórek u myszy transgenicznych wykazujących ekspresję GFP w ograniczonych populacjach neuronów hamujących. Technika ta pozwala na obszerne mapowanie i analizę ilościową lokalnych obwodów synaptycznych specyficznych hamujących neuronów korowych.

Streszczenie

Neurony hamujące są kluczowe dla funkcjonowania kory mózgowej. Stanowią one około 20% całej populacji neuronów korowych i można je dalej podzielić na różne podtypy w oparciu o ich właściwości immunochemiczne, morfologiczne i fizjologiczne^1-4. Chociaż wcześniejsze badania ujawniły wiele na temat wewnętrznych właściwości poszczególnych typów neuronów hamujących, wiedza na temat ich lokalnych połączeń obwodowych jest nadal stosunkowo ograniczona^3,5,6. Biorąc pod uwagę, że funkcja każdego pojedynczego neuronu jest kształtowana przez jego pobudzające i hamujące wejście synaptyczne w obwodach korowych, używamy laserowej fotostymulacji skaningowej (LSPS) do mapowania lokalnych połączeń obwodów z określonymi typami komórek hamujących. W porównaniu z konwencjonalną stymulacją elektryczną lub stymulacją zaciągnięciem glutaminianem, LSPS ma unikalne zalety pozwalające na obszerne mapowanie i analizę ilościową lokalnych danych funkcjonalnych do indywidualnie zarejestrowanych neuronów^3,7-9. Fotostymulacja laserowa poprzez odtworzenie w klatce glutaminianu selektywnie aktywuje neurony perysomatycznie, bez aktywacji aksonów pasażu lub dendrytów dystalnych, co zapewnia rozdzielczość mapowania sublaminarnego. Czułość i wydajność LSPS do mapowania danych wejściowych z wielu miejsc stymulacji na dużym obszarze dobrze nadają się do analizy obwodów korowych.

Tutaj przedstawiamy technikę LSPS połączoną z zaciskaniem łat na całej komórce do lokalnego mapowania obwodów hamujących. Celowane zapisy określonych typów komórek hamujących są ułatwione dzięki zastosowaniu myszy transgenicznych eksprymujących białka zielonej fluorescencji (GFP) w ograniczonych populacjach neuronów hamujących w korze^3,10, co umożliwia spójne pobieranie próbek docelowych typów komórek i jednoznaczną identyfikację zarejestrowanych typów komórek. Jeśli chodzi o mapowanie LSPS, nakreślamy oprzyrządowanie systemu, opisujemy procedurę eksperymentalną i akwizycję danych oraz przedstawiamy przykłady mapowania obwodów w pierwotnej korze somatosensorycznej myszy. Jak pokazano w naszych eksperymentach, glutaminian w klatce jest aktywowany w przestrzennie ograniczonym obszarze wycinka mózgu przez fotolizę laserową UV; Jednoczesne zapisy cęgów napięcia pozwalają na wykrycie reakcji synaptycznych wywołanych fotostymulacją. Mapy pobudzających lub hamujących wejść synaptycznych do docelowego neuronu są generowane przez skanowanie wiązki laserowej w celu stymulacji setek potencjalnych miejsc presynaptycznych. W ten sposób LSPS umożliwia konstruowanie szczegółowych map sygnałów synaptycznych oddziałujących na określone typy neuronów hamujących poprzez wielokrotne eksperymenty. Podsumowując, technika oparta na fotostymulacji oferuje neurobiologom potężne narzędzie do określania funkcjonalnej organizacji lokalnych obwodów korowych.

Protokół

1. Przygotowanie plastra mózgu

1. Transgeniczne myszy są głęboko znieczulane pentobarbitalem sodowym (>100 mg / kg, ip) i szybko dekapitacjonowane, a ich mózgi ekstrahowane do zamrożonego i natlenionego roztworu tnącego.
2. Gogle GFP służą do wizualnego sprawdzania, czy mózg myszy rzeczywiście wyraża GFP.
3. Pierwotne somatosensoryczne odcinki kory mózgowej o grubości 400 μm są cięte wibratomem w sztucznym płynie mózgowo-rdzeniowym zawierającym sacharozę (ACSF). Plastry są najpierw inkubowane w ACSF zawierającym sacharozę przez 30 minut do 1 godziny w temperaturze 32°C, a po początkowym okresie inkubacji przenoszone do rejestracji ACSF w temperaturze pokojowej. Przez cały okres inkubacji i rejestracji plastry są w sposób ciągły bąbelkowane 95% O_2-5% CO_{2 .}

2. Uruchomienie sprzętu

Ogólna implementacja systemu jest zilustrowana na rysunku 1.

1. System chłodzenia lasera i zasilacz są włączone, co przygotowuje laser.
2. Cały sprzęt związany ze sterowaniem fotostymulacją (w tym system lustra skanującego, modulator optyczny, migawka elektroniczna i wzmacniacz wejściowy fotodiody) jest włączony.
3. Aparatura elektrofizjologiczna (w tym wzmacniacz Multiclamp 700B i mikromanipulatory) jest włączona. Zapisy elektrofizjologiczne, fotostymulacja i obrazowanie preparatów plastrów wykonywane są w komorze perfuzyjnej plastra zamontowanej na zmotoryzowanym stoliku mikroskopu.
4. Kamera obrazująca (Retiga 2000, Q-imaging, Austin, TX) jest włączona. Plastry są wizualizowane za pomocą mikroskopu pionowego (BW51X, Olympus) z kontrastem różnicowym w podczerwieni (DIC) i optyką epifluorescencyjną przez system obrazowania.
5. Uruchamiane jest oprogramowanie EPHUS oparte na Matlabie i oprogramowanie kamery Q-capture. Zmodyfikowana na zamówienie wersja oprogramowania Ephus (Ephus, dostępna pod adresem https://openwiki.janelia.org/) służy do kontrolowania protokołów fotostymulacji i pozyskiwania danych fotostymulacji.
6. Po włączeniu systemu należy sprawdzić, czy system fotostymulacji laserowej jest w stanie roboczym. Ponieważ obiektyw mikroskopu 4x jest używany do dostarczania błysków UV w celu uwolnienia glutaminianu, można pod nim umieścić kawałek białego papieru, aby obserwować wzór skanowania laserowego podczas pracy systemu.

3. Ustawianie perfuzji plasterków

1. Włączany jest ciśnieniowy system perfuzyjny, który wprowadza ACSF do komory kropelkowej. Dba się o to, aby w komorze znajdował się stały poziom płynu wynoszący 2,0 mm powyżej plastra.
2. Podwielokrotność roztworu podstawowego glutaminianu MNI w klatce dodaje się do 25 ml krążącego ACSF w celu uzyskania stężenia 0,2 mM glutaminianu w klatce. Należy pamiętać, że po 5-6 godzinach eksperymentów roztwór do kąpieli i glutaminian MNI zostaną odświeżone.
3. Wycinek mózgu jest przenoszony do komory nagraniowej. Można uruchomić system obrazowania, aby sprawdzić jakość plastra i anatomicznie zlokalizować główny obszar somatosensoryczny. Następnie plasterek jest zakotwiczony w wykonanym na zamówienie platynowym pierścieniu sznurkowym. Uważaj, aby nie umieścić kotwicy nad obszarem mózgu przeznaczonym do nagrań.

4. Zapis z zaciśnięciem całej komórki

1. Elektrody szklane (rezystancja 4-6 MΩ) są ciągnięte i wypełniane wewnętrznym roztworem zawierającym 0,1% biocytyny w celu znakowania komórek i identyfikacji morfologicznej.
2. Aby wykonać nagrywanie łatek, komórki są wizualizowane na obiektywie 60x. Typy komórek hamujących są najpierw identyfikowane i wybierane na podstawie wizualizacji ekspresji GFP pod mikroskopem DIC/fluorescencyjnym Olympus; nagrania są następnie wykonywane pod kontrolą wizyjną wspomaganą przez monitoring wizyjny DIC w podczerwieni. Należy pamiętać, że konieczne jest kilkukrotne przełączenie między trybem DIC a trybem fluorescencyjnym, aby potwierdzić położenie ogniwa GFP podczas zbliżania się elektrody do ogniwa docelowego.
3. Stosowane są konwencjonalne techniki mocowania punktowego. Elektroda jest wypełniona nadciśnieniem, przesuwana blisko powierzchni ogniwa, aby utworzyć dostrzegalny wgłębienie na docelowej błonie komórkowej; Następnie szybko stosowane jest podciśnienie, aby utworzyć gigaseal i włamać się, jednocześnie monitorując aktualne reakcje wtrysku na monitorze wideo.
4. Po włamaniu do sieci pobierane są obrazy komórki z powiększeniem 60x w trybie DIC i fluorescencyjnym w celu weryfikacji on-line. Przed zebraniem danych fotostymulacyjnych wstrzykuje się hiperpolaryzujące i depolaryzujące impulsy prądu w celu zbadania podstawowych właściwości elektrofizjologicznych każdej komórki.
5. Po uzyskaniu stabilnych zapisów całych komórek z dobrą rezystancją dostępu (zwykle <20 MΩ), obiektyw mikroskopu jest przełączany z 60x na 4x w celu fotostymulacji skaningowej. Obraz przekroju przy 4x jest pozyskiwany i będzie używany do prowadzenia i rejestrowania miejsc fotostymulacji.

5. Fotostymulacja skaningowa laserowa

1. Parametry fotostymulacji i akwizycji danych ustawia się poprzez aktywację modułu przełącznika konfiguracyjnego Ephus. Zwykle do mapowania fotostymulacji używa się lasera o mocy 1 ms (20 mW) z interwałem bodźca wynoszącym 1 sekundę. Pobierane są ślady danych z 1 sekundy próbkowane z częstotliwością 10 kHz.
2. Obraz 4x slice jest ładowany do modułu mappera Ephus. Określa się lokalizację somy komórkowej, a miejsca fotostymulacji o schemacie 16x16 (odstępy 80 μm x 80 μm) są ustawiane wokół lokalizacji komórki, pokrywając wszystkie warstwy korowe.
3. Profil wzbudzenia zarejestrowanego neuronu jest mapowany poprzez badanie lokalizacji impulsów w odpowiedzi na fotostymulację w obecnym trybie klamrowym. Nasze przyjazne dla użytkownika oprogramowanie z funkcjami wyświetlania on-line ułatwia eksperymenty z mapowaniem.
4. Lokalne połączenia obwodów wzbudzających są mapowane poprzez detekcję pobudzających prądów postsynaptycznych (EPSC) z zarejestrowanej komórki podczas skanowania laserowego w różnych lokalizacjach. Ogniwo jest utrzymywane na poziomie -70 mV w trybie cęgów napięciowych w celu wykrycia wewnętrznych prądów wzbudzających. Mapy EPSC są powtarzane 2-3 razy z obróconym lub odwróconym wzorcem fotostymulacji.
5. Opcjonalnie: Lokalne połączenia obwodów hamujących mogą być również mapowane poprzez wykrywanie hamujących prądów postsynaptycznych (IPSC) z zarejestrowanego ogniwa utrzymywanego na poziomie bliskim 0 mV w trybie cęgów napięciowych w celu wykrycia zewnętrznych prądów hamujących. Należy pamiętać, że do mapowania IPSC najlepiej jest używać wewnętrznego roztworu elektrody z potasem zastąpionym cezem.
6. Po zakończeniu wszystkich testów fizjologicznych elektroda jest delikatnie usuwana z zarejestrowanej komórki. Wycinek mózgu wyjmuje się i utrwala w 4% paraformaldehydzie przez noc. Zarejestrowane komórki są barwione na tle biocytyny. Morfologia komórki jest badana za pomocą mikroskopii konfokalnej lub epifluorescencyjnej, która potwierdza również, że każda zarejestrowana komórka jest rzeczywiście interneuronem eksprymującym GFP, pierwotnie docelowym.

6. Analiza danych fotostymulacji

Nasza nowo opracowana metodologia i implementacja oprogramowania¹¹ jest stosowana do wykrywania i pomiaru zdarzeń synaptycznych wywołanych fotostymulacją na mapach surowych danych. Jak pokazano na rysunku 2, mapy oznaczone kolorami są konstruowane w celu zilustrowania wzorca wejścia synaptycznego do zarejestrowanego neuronu.

7. Reprezentatywne wyniki:

Przykładowe wyniki zapisu elektrofizjologicznego i mapowania fotostymulacji są pokazane na rysunku 2. Ukierunkowane zapisy określonych typów komórek hamujących są możliwe dzięki wykorzystaniu myszy transgenicznych wykazujących ekspresję GFP w znanych typach komórek hamujących. Biorąc pod uwagę różnorodność interneuronów hamujących, analizy ekspresji GFP, wewnętrznej elektrofizjologii i cech morfologicznych (ryc. 2A) są łączone w celu uzyskania ostatecznej klasyfikacji typu komórki. Rycina 2B-C ilustruje, że fotostymulacja skaningowa laserowa pozwala na rozległe mapowanie lokalnych połączeń obwodów korowych z pojedynczymi neuronami hamującymi. Mapa danych pierwotnych jest pokazana na rysunku 2C. Bezpośrednie reakcje na odblokowanie są wyłączone z analizy danych (rysunek 2C). Ilościowe mapy wejściowe są oznaczone kolorami, jak pokazano na rysunku 2D-F. Przykładowe szybko impulsujące interneurony hamujące otrzymały silne pobudzające wejście synaptyczne (EPSC) z warstwy 4 i głębszych warstw. Odnosząc synaptyczną organizację wejściową komórki do zdefiniowanych ścieżek korowych, jesteśmy w stanie wywnioskować jej możliwą rolę (np. sprzężenie zwrotne i hamowanie sprzężenia zwrotnego) w przetwarzaniu informacji korowych.

Rysunek 1. Ogólne oprzyrządowanie systemu do laserowej fotostymulacji skaningowej. Nasz cały system składa się z systemów kontroli fotostymulacji, obrazowania wideo i rejestracji elektrofizjologicznej. Przyjęliśmy konstrukcję systemu LSPS opisaną wcześniej^7,17. Jednostka laserowa służy do generowania lasera UV o długości fali 355 nm do rozmieszczania glutaminianu w klatkach. Wiązka lasera jest kierowana przez ścieżkę optyczną naszego systemu. Krótki czas trwania błysków laserowych (np. 1-3 ms) jest kontrolowany za pomocą modulatora elektrooptycznego (tj. ogniwa pockels) i migawki mechanicznej. Moc wiązki laserowej jest modulowana przez koło gradientu o neutralnej gęstości i monitorowana poprzez skierowanie niewielkiej części wiązki laserowej za pomocą szklanego szkiełka nakrywkowego do fotodiody. System skanowania laserowego składa się z pary luster skanujących X-Y, soczewki skanującej, soczewki tubusu i soczewki obiektywu. Lustra dostarczają wiązkę laserową przez soczewkę skanującą; następnie wiązka dostaje się do mikroskopu przez zwierciadło dichroiczne i jest ogniskowana przez specjalnie wykonaną soczewkę rurki przepuszczającej promieniowanie UV. Wiązka wypełnia tylną aperturę obiektywu mikroskopu, aby zapewnić bardziej kolumnową (w przeciwieństwie do stożkowej) wiązkę światła, utrzymując mapowanie tak dwuwymiarowe, jak to tylko możliwe, poprzez zmniejszenie rozdzielczości osiowej. Pod obiektywem 4x wiązka laserowa tworzy plamki rozmieszczające, z których każdy przybliża się do profilu Gaussa o szerokości 153 μm bocznie w płaszczyźnie ogniskowej (patrz wkładka). Różne pozycje stymulacji laserowej można uzyskać za pomocą zwierciadeł skanujących XY napędzanych galwanometrami, ponieważ lustra i tylna apertura obiektywu znajdują się w płaszczyznach sprzężonych, przesuwając pozycje zwierciadeł na różne lokalizacje skanowania w płaszczyźnie ogniskowej soczewki obiektywu. Podczas rozmieszczania w klatkach, zmienna liczba miejsc o wzorze, która obejmuje całe pole, jest stymulowana sekwencyjnie w nierastrowej, nielosowej sekwencji, aby uniknąć ponownego odwiedzania okolic ostatnio stymulowanych miejsc. Aby uzyskać bardziej szczegółowe informacje, zapoznaj się z Xu et al. (2010).

Rysunek 2. Mapowanie lokalnych połączeń obwodów pobudzających do szybko wyrastającego interneuronu wyrażającego GFP w warstwie 4 pierwotnej kory czuciowej myszy. A1 i A2 pokazują obrazy fluorescencyjne DIC i GFP docelowej komórki pod obiektywem 60x w żywym wycinku mózgu, podczas gdy A3 pokazuje morfologię komórki ujawnioną przez barwienie biocytyną w utrwalonym wycinku po rejestracji. A4 pokazuje wzorce wypalania zarejestrowanej komórki GFP, charakterystyczne dla szybko rosnącego interneuronu hamującego, w odpowiedzi na wstrzyknięcia prądu intrasomatycznego o różnej sile. B pokazuje obraz wycinka nałożony na 16 x16 miejsc fotostymulacji (*). Lokalizacja komórki jest oznaczona małym czerwonym kółkiem. C pokazuje szereg śladów reakcji wywołanych fotostymulacją z miejsc stymulacji pokazanych w B, podczas gdy komórka była utrzymywana pod napięciem -70 mV w celu wykrycia wewnętrznych prądów pobudzających. Różne formy reakcji fotostymulacji są zilustrowane śladami w miejscach 1 i 2, które są rozszerzone i oddzielnie pokazane we wkładce. Ślad 1 jest przykładem bezpośrednich reakcji (wskazywanych przez czerwone groty strzałek) na odtworzenie glutaminianu na ciele komórki i dendrytach proksymalnych. Inne ślady w 2 są typowymi przykładami pobudzających odpowiedzi wejściowych synaptycznych (niebieski). Odpowiedzi bezpośrednie i wejścia synaptyczne można rozróżnić na podstawie ich amplitud i opóźnień odpowiedzi. D, E i F są oznaczonymi kolorami mapami (miejsca 16x16) średniej amplitudy EPSC, liczb EPSC i pierwszego wykrytego opóźnienia EPSC na miejsce, odpowiednio, dla mapy danych surowych pokazanej w C. Średnia amplituda wejściowa z każdego miejsca stymulacji jest średnią amplitudą EPSC w oknie analizy, przy czym wyjściowa spontaniczna odpowiedź odjęta jest od odpowiedzi fotostymulacji tego samego miejsca. Mierzy się i wykreśla również liczbę EPSC oraz czas przybycia lub opóźnienie pierwszego wykrytego EPSC na lokalizację. Więcej informacji można znaleźć w (Shi i in., 2010).

Dyskusja

Techniki mapowania oparte na fotostymulacji zostały skutecznie zastosowane do analizy obwodów korowych. Fotostymulacja ze skaningiem laserowym w połączeniu z zapisem całych komórek umożliwia mapowanie w wysokiej rozdzielczości rozkładów laminarnych presynaptycznych źródeł wejściowych do pojedynczych neuronów, ponieważ jednoczesny zapis z neuronu postsynaptycznego z fotostymulacją skupisk neuronów presynaptycznych w wielu różnych lokalizacjach zapewnia ilościowe pomiary przestrzennego rozkładu bodźców pobudzających lub ...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
transgeniczne linie myszy	Jackson lab lub inne źródła		Proszę zapoznać się z Xu i Callaway (2009)
Gogle GFP	BLS Ltd., Węgry
wibratom	Leica Systems	VT1200S
MNI w klatce glutaminianu (l-glutaminian 4-metoksy-7-nitroindolinylu w klatce)	Tocris Bioscience, Ellisville, MO	Nr kat. 1490
biocytyna		B4261
ściągacz elektrod	Sutter Instrument, Novato, CA	Szklane rurki P-97
do wytwarzania elektrod		BF150-86-10
Wzmacniacz Multiclamp 700B	Molecular Devices, Sunnyvale, CA	Multiclamp 700B
	Q-imaging, Austin, TX	Mikroskop
	Olympus, Tokio, Japonia	BW51X
Laser laserowy UV	DPSS Lasers, Santa Clara, CA	model 3501
Inne urządzenia do laserowej fostymulacji			Proszę zapoznać się z Xu et al. (2010)
Solutions:
Sztuczny płyn mózgowo-rdzeniowy zawierający sacharozę (ACSF) do krojenia plastrów (w mM: 85 NaCl, 75 sacharozy, 2,5 KCl, 25 glukozy, 1,25 NaH2PO4, 4 MgCl2, 0,5 CaCl2, oraz 24 NaHCO3). Zapis ACSF (w mM: 126 NaCl, 2,5 KCl, 26 NaHCO3, 2 CaCl2, 2 MgCl2, 1,25 NaH2PO4, i 10 glukozy) Roztwór wewnętrzny elektrody (w mM: 126 K-glukonian, 4 KCl, 10 HEPES, 4 ATP-Mg, 0,3 GTP-Na i 10 fosfokreatyna; pH 7,2, 300 mOsm).