Kwantyfikacja aktywności agonistycznej receptorów sprzężonych z białkiem G

Podsumowanie

Opisano metodę szacowania stałej powinowactwa agonisty do stanu aktywnego (K_b) receptora sprzężonego z białkiem G. Analiza dostarcza bezwzględnych lub względnych wartości K_b w zależności od tego, czy konstytutywna aktywacja receptora jest mierzalna. Nasza metoda ma zastosowanie do różnych odpowiedzi występujących w kaskadzie sygnałowej po aktywacji receptora.

Streszczenie

Gdy agonista aktywuje populację receptorów sprzężonych z białkiem G (GPCR), wywołuje on ścieżkę sygnalizacyjną, która kończy się odpowiedzią komórki lub tkanki. Proces ten można analizować na poziomie pojedynczego receptora, populacji receptorów lub odpowiedzi efektorowej. W niniejszej pracy opisujemy, jak analizować odpowiedź efektorową w celu uzyskania szacunkowej wartości stałej powinowactwa agonisty do stanu aktywnego pojedynczych receptorów.

Receptory zachowują się jak przełączniki kwantowe, które zmieniają swój stan między aktywnym a nieaktywnym (Rycina 1). Stan aktywny wchodzi w interakcje ze specyficznymi białkami G lub innymi partnerami sygnalizacyjnymi. Wobec braku ligandów przeważa stan nieaktywny. Wiązanie agonisty zwiększa prawdopodobieństwo przejścia receptora w stan aktywny, ponieważ jego stała powinowactwa do stanu aktywnego (K_b) jest znacznie większa niż do stanu nieaktywnego (K_a). Sumowanie losowych sygnałów wyjściowych wszystkich receptorów w danej populacji daje stały poziom aktywacji receptorów w czasie. Odwrotność stężenia agonisty wywołującego połowową maksymalną aktywację receptorów jest równoważna obserwowanej stałej powinowactwa (K_obs), a frakcja kompleksów agonista-receptor w stanie aktywnym jest definiowana jako skuteczność (ε) (Rycina 2).

Opracowano metody analizy odpowiedzi efektorowych GPCR, które umożliwiają oszacowanie K_obs oraz względnej skuteczności agonisty ^1,2. W niniejszym raporcie pokazujemy, jak zmodyfikować tę analizę w celu oszacowania wartości K_b agonisty względem innego agonisty. W przypadku testów wykazujących aktywność konstytutywną pokazujemy, jak oszacować K_b w bezwzględnych jednostkach M^-1.

Nasza metoda analizy krzywych zależności odpowiedzi od stężenia agonisty ^3,4 polega na globalnej regresji nieliniowej z wykorzystaniem modelu operacyjnego ⁵. Opisujemy procedurę z użyciem aplikacji oprogramowania Prism (GraphPad Software, Inc., San Diego, CA). Analiza pozwala na oszacowanie iloczynu K_obs oraz parametru proporcjonalnego do skuteczności (τ). Iloraz oszacowania τK_obs jednego agonisty i drugiego stanowi wzglomną miarę K_b (RA_i) ⁶. W przypadku każdego receptora wykazującego aktywność konstytutywną możliwe jest oszacowanie parametru proporcjonalnego do skuteczności wolnego kompleksu receptorowego (τ_sys). W takim przypadku wartość K_b agonisty jest równoważna τK_obs/τ_sys ³.

Nasza metoda jest użyteczna do określania selektywności agonisty względem podtypów receptorów oraz do ilościowego pomiaru sygnalizacji agonista-receptor poprzez różne białka G.

Protokół

1. Pomiar krzywych zależności odpowiedzi od stężenia agonisty: brak aktywności konstytutywnej

1. Do szacowania względnej aktywności agonisty K_b wartości (RZS_i), wymagane jest wyznaczenie serii co najmniej dwóch krzywych zależności odpowiedzi od stężenia agonisty. Wszelkie in vitro odpowiedź funkcjonalną GPCR można zmierzyć za pomocą testu, pod warunkiem że możliwe jest kontrolowanie stężenia agonisty, a odpowiedź jest pośredniczona przez jeden typ receptora. Odpowiednie testy komórkowe obejmują pomiar cAMP ^4,7 or akumulacja inozytofosforanów ^8,9 w linii komórkowej wykazującej ekspresję receptora rekombinowanego. Przykładami analiz na tkankach w całości są pomiary skurczu mięśni gładkich ¹⁰ lub M₂ muskarinowych receptorów i β₁zmiany w skurczu lewego przedsionka szczura stymulowanego elektrycznie oporządzone adrenoreceptorami ¹¹.
2. Wybierz do analizy serię agonistów, w tym agonistę o wysokiej skuteczności (np. ligand endogenny). W każdym doświadczeniu zmierz pełne krzywe koncentracyjno-odpowiedzi dla każdego agonisty. Jeśli liczba agonistów jest zbyt duża, aby przeprowadzić analizę w ramach jednego doświadczenia, podziel ich na podgrupy, z których każda będzie zawierać liczbę agonistów możliwą do zbadania w jednym cyklu. Dla każdej podgrupy zmierz krzywą koncentracyjno-odpowiedzi agonisty o wysokiej skuteczności wraz z krzywymi pozostałych agonistów z danej podgrupy (patrz Rys. 3). Powtórz doświadczenie dla każdej podgrupy około 3–6 razy, w zależności od zmienności uzyskanych danych.
3. Dla każdej krzywej koncentracja-odpowiedź należy zmierzyć odpowiedź w obecności samego agonisty (odpowiedź podstawowa) oraz w obecności rosnących stężeń agonisty. Stężenia agonisty należy rozmieścić równomiernie w skali logarytmicznej, w odstępach około 0,3–0,7 log.₁₀ jednostki, obejmujące zakres odpowiedzi i definiujące odpowiedź maksymalną (E_maksymalnie) (patrz ryc. 3). W przypadku eksperymentów na liniach komórkowych każdy pomiar wykonuje się w trzech powtórzeniach.
4. Odjąć odpowiedź podstawową od odpowiedzi zmierzonej w obecności każdego stężenia agonisty. Odpowiedzi przedstawione na Rysunku 3 zostały obliczone w ten sposób.

2. Wstępna analiza krzywych zależności odpowiedzi od stężenia agonisty: brak aktywności konstytutywnej

1. Wprowadź dane z eksperymentów zależność stężenie-odpowiedź (np. Rysunek 5) do tabeli danych w programie Prism. Wszystkie wartości logarytmów stężeń agonistów wpisuje się w kolumnie oznaczonej jako X. Pomiary odpowiedzi dla agonisty, który wykazuje najwyższą wartość E_max, wprowadza się do kolumny A, a pomiary dla pozostałych agonistów do sąsiednich kolumn oznaczonych literami. Pomiary powtórne krzywych zależność stężenie-odpowiedź wprowadza się do podkolumn danej kolumny literowej.
2. Wybierz arkusz wykresu, na którym naniesiono dane, i przeanalizuj dane za pomocą nieliniowej analizy regresji, korzystając z równania zatytułowanego: log(agonist) vs. response - Variable slope (four parameters). Ogranicz parametr „Bottom” do zera i przeprowadź analizę regresji. Skopiuj parametry „Top” (E_max) oraz log EC₅₀ do arkusza kalkulacyjnego Excel w celu wykorzystania ich w obliczaniu wstępnych szacunków parametrów. Agonistę z najwyższą szacowaną wartością E_max wyznacza się jako „agonistę standardowego”, natomiast pozostałe agonisty określa się jako „agonisty testowe”.
3. Oblicz wstępną wartość log τK_obs (LOGR1) jako ujemny logarytm wartości EC₅₀ agonisty standardowego (-log EC₅₀').
   
   Oblicz wstępną wartość log RA_i dla każdego agonisty testowego (LOGRA) według wzoru: log {(Top*EC₅₀')/(Top'*EC₅₀)}, gdzie parametry agonisty standardowego oznaczone są apostrofem.
   
   Oblicz logarytmiczne stałe powinowactwa agonistów testowych (LOGK2 - LOGK5) jako ujemny logarytm ich odpowiednich wartości EC₅₀.

3. Wyznaczanie wartości RAi agonisty za pomocą nieliniowej analizy regresji: brak aktywności konstytutywnej

1. Wprowadź dane do tabeli danych (Data Table) w programie Prism, zgodnie z opisem w sekcji 2.1. Upewnij się, że dane dla agonisty standardowego znajdują się w kolumnie A.
2. Wprowadź do programu Prism zdefiniowane przez użytkownika równanie „log RAi”, rozpisując je na kilka linii, jak pokazano dla przypadku z pięcioma agonistami:
   • P=LOGK1
   • Q=LOGR
   • <~A>Q=LOGR+LOGRA
   • P=LOGK2
   • P=LOGK3
   • P=LOGK4
   • P=LOGK5
   • Y=Msys/(1+{[(1+10^(X+P))/(10^(X+Q))]^M})
3. Wprowadź początkowe wartości szacunkowe parametrów w następujący sposób:
   Wprowadź dowolnie niską wartość 0 dla logarytmu stałej powinowactwa (LOGK1) agonisty standardowego.
   
   Wprowadź początkowe wartości szacunkowe dla LOGR, stałych powinowactwa (LOGK2 – LOGK5) oraz wartości log RAi (LOGRA) dla agonistów testowych.
   
   Dla początkowej wartości szacunkowej czynnika nachylenia przetwornika (M) przypisz wartość 1,0.
   
   Dla początkowej wartości szacunkowej maksymalnej odpowiedzi układu (Msys) przypisz wartość równą E_max agonisty standardowego (Top′).
4. Zastosuj następujące ograniczenia parametrów: LOGK1 ograniczony do stałej 0; LOGR1, Msys i M jako wartości wspólne dla wszystkich zbiorów danych; LOGK2 – LOGK5 oraz LOGRA bez ograniczeń.
5. Uruchom nieliniową analizę regresji. Wyniki pozwolą wyznaczyć wartości log K_obs oraz log RA_i dla agonistów testowych. Jeśli agonista standardowy jest pełnym agonistą, obie wartości – log K_obs i log RA_i – są dokładne. Jeśli najbardziej skuteczny agonista (agonista standardowy) jest w rzeczywistości agonistą częściowym, wartości K_obs dla skuteczniejszych agonistów mogą zostać zawyżone. Niemniej jednak, szacunki log RA_i pozostają w tej sytuacji dokładne.
6. Jeśli regresja nie zbiega, badacz może spróbować wykreślić krzywą teoretyczną zdefiniowaną przez początkowe wartości szacunkowe parametrów. Jeśli występują duże odchylenia między punktami danych a krzywymi teoretycznymi, należy sprawdzić obliczenia początkowych wartości szacunkowych. Jeśli jeden lub więcej agonistów posiada wartości E_max równoważne wartości agonisty standardowego, może być konieczne ograniczenie ich wartości log K_obs do 0, aby regresja zbiegła do rozwiązania.

4. Pomiar krzywych zależności odpowiedzi od stężenia agonisty w testach komórkowych wykazujących konstytutywną aktywność receptora

1. Do szacowania wartości K_b agonistów w bezwzględnych jednostkach M^-1 stosuje się testy komórkowe in vitro wykazujące konstytutywną aktywność receptora. Konstytutywną aktywność receptora definiuje się jako wzrost odpowiedzi powyżej poziomu podstawowego spowodowany ekspresją badanego receptora.
2. Należy wybrać agonistów i zaprojektować eksperyment zgodnie z opisem w sekcji 1.2 powyżej.
3. Dla każdej krzywej zależności odpowiedź-stężenie należy zmierzyć odpowiedź w obecności agonisty w komórkach nietransfekowanych (odpowiedź podstawowa) oraz w komórkach transfekowanych badanym receptorem (odpowiedź podstawowa + odpowiedź konstytutywna). Należy zmierzyć odpowiedź w obecności różnych stężeń poszczególnych agonistów zgodnie z opisem w sekcji 1.3 powyżej.
4. Konstytutywną aktywność receptora oraz odpowiedź na każde stężenie agonisty oblicza się jako zmierzoną odpowiedź pomniejszoną o odpowiedź podstawową w komórkach nieprzetransfekowanych receptorem. Rycina 6 przedstawia odpowiedzi na różne agonisty obliczone w ten sposób dla szlaku sygnałowego wykazującego bardzo niską aktywność konstytutywną.

5. Wstępna analiza krzywych zależności odpowiedzi od stężenia agonisty wykazujących aktywność konstytutywną

1. Wprowadź dane (np. Rysunek 6) do tabeli danych w programie Prism zgodnie z opisem w sekcji 3.1, wprowadzając również odpowiedź wywołaną konstytutywną aktywnością receptora w odpowiednich kolumnach oznaczonych literami, odpowiadających logarytmicznemu stężeniu agonisty wynoszącemu -20. Wprowadzany jest duży ujemny logarytm, aby przybliżyć stężenie agonisty do zera.
2. Przeanalizuj dane zgodnie z opisem w sekcji 2.2, ale z parametrem „Bottom” ograniczonym tak, aby był on „wspólny dla wszystkich zestawów danych” (shared for all data sets). Skopiuj parametry „Top” (E_max), wspólny „Bottom” oraz log EC50 do arkusza kalkulacyjnego Excel w celu wykorzystania ich do obliczenia wstępnych szacunków parametrów.
3. Oblicz wstępne szacunki parametrów w następujący sposób:
   
   Logarytmiczną stałą powinowactwa standardowego agonisty (LOGK1) lub każdego pełnego, badanego agonisty należy wyznaczyć w oddzielnych eksperymentach, zgodnie z wcześniejszym opisem ³.
   
   Oblicz wstępną wartość log K_obs dla każdego częściowego badanego agonisty (tj. w tym przypadku tylko LOGK2) jako log {(Top'-Top)/(EC₅₀(Top′- Bottom))}, gdzie „Bottom” oznacza odpowiedź wywołaną konstytutywną aktywacją receptora.
   
   Oblicz wstępną wartość log K_b (LOGKb) dla każdego agonisty jako log {Top/(EC₅₀Bottom)}.
   
   Oblicz wstępną wartość log τ_sys (LOGTsys) jako log {Bottom/(Top′ - Bottom)}.

6. Szacowanie wartości Kb agonistów dla odpowiedzi wykazujących konstytutywną aktywność receptora przy użyciu nieliniowej analizy regresji

1. Wprowadź dane do Tabeli Danych w programie Prism zgodnie z opisem w punkcie 3.1
2. Wprowadź zdefiniowane przez użytkownika równanie „Log Kb” do programu Prism w kilku liniach, jak pokazano dla warunku dwóch agonistów:
   • LOGKOBS = LOGK1
   • LOGKOBS = LOGK2
   • A=(10^(X+LOGKOBS))+1
   • B=10^(X+LOGTSYS+LOGKB)
   • C=(10^(LOGTSYS))
   • Y=Msys/{1+[(A/(B+C))^M]}
3. Wprowadź wstępne szacunki parametrów w następujący sposób:
   
   Wprowadź stałe powinowactwa każdego agonisty (LOGK1 – wprowadź wartość wyznaczoną w punkcie 5.3).
   
   Wprowadź szacunki K_obs dla każdego testowanego agonisty.
   
   Wprowadź szacunki Kb agonistów.
   
   Wprowadź szacunek log τ_sys (LOGTsys).
   
   Przypisz wartości 1,0 dla współczynnika nachylenia przetwornika (M) oraz wartość Top' (E_max standardowego agonisty) dla maksymalnej odpowiedzi układu (Msys).
4. Zastosuj następujące ograniczenia parametrów: LOGTsys, Msys i M – wartość wspólna dla wszystkich zestawów danych; LOGK2 i LOGKb – brak ograniczeń.
5. Uruchom nieliniową analizę regresji. Wyniki dostarczają wartość log K_b standardowego agonisty, wartości log K_obs i log K_b agonistów częściowych, maksymalną odpowiedź układu (Msys), wartość τ_sys dla wolnego kompleksu receptorowego (LOGTsys) oraz współczynnik nachylenia przetwornika w modelu operacyjnym (M).
6. Jeśli regresja nie zbiega się, postępuj zgodnie z krokami opisanymi powyżej w punkcie 3.6.

7. Reprezentatywne wyniki

Rysunek 5 przedstawia niektóre z naszych wcześniej opublikowanych danych dotyczących hydrolizy fosfoinozytydów indukowanej agonistami muskarynowymi w komórkach jajnika chomika syryjskiego stabilnie eksponujących receptor muskarynowy M₃ ¹². W tym teście zmierzono krzywe koncentracja-odpowiedź wybranych agonistów muskarynowych. Dane przeanalizowano zgodnie z opisem w sekcji 3, aby oszacować wartość K_b każdego agonisty, wyrażoną względem wartości dla oksotremoryny-M. Otrzymane wartości log RA_i wyniosły: dla karbacholu -0,56 ± 0,063; dla arekoliny -0,60 ± 0,074; dla pilokarpiny -1,20 ± 0,15 oraz dla McN-A-343 -1,92 ± 0,31. Krzywe teoretyczne reprezentują dopasowanie metodą najmniejszych kwadratów równania regresji do danych (Sekcja 3.2). Odpowiednie szacunki maksymalnej odpowiedzi układu (M_sys) oraz współczynnika nachylenia przetwornika (M) wyniosły odpowiednio 53,9 ± 1,3 oraz 1,15 ± 0,09. Wartości log K_obs agonistów, z wyjątkiem oksotremoryny-M, wyniosły: dla karbacholu 5,19 ± 0,14; dla arekoliny 5,49 ± 0,12; dla pilokarpiny 5,58 ± 0,16 oraz dla McN-A-343 5,27 ± 0,33.

Rysunek 6 przedstawia wyniki eksperymentów nad hydrolizą fosfoinozytydów stymulowaną agonistami muskarynowymi w komórkach HEK 293 stabilnie wykazujących ekspresję G_α15 ³. Przejściowa ekspresja receptora muskarynowego M₃ spowodowała wzrost bazowej hydrolizy fosfoinozytydów, co przypisano konstytutywnej aktywności receptora. Dane przeanalizowano w celu oszacowania wartości log K_b dla oksotremoryny-M i McN-A-343, zgodnie z opisem w sekcji 6. Analiza ta pozwoliła uzyskać wartości log K_b wynoszące odpowiednio 8,30 ± 0,59 dla oksotremoryny-M oraz 6,59 ± 0,77 dla McN-A-343. Krzywe teoretyczne reprezentują dopasowanie metodą najmniejszych kwadratów równania regresji do danych (patrz sekcja 6.2). Szacunkowe wartości log τ_sys, M_sys i M wyniosły odpowiednio -2,29 ± 0,59, 95,8 ± 2,8 oraz 0,72 ± 0,08. Wartość K_obs dla McN-A-343 oszacowano na 5,35 ± 0,46.

Rycina 1. Zależność między aktywnością pojedynczego receptora a średnim poziomem aktywacji populacji receptorów. Przedstawiono aktywność pojedynczego receptora, czyli teoretyczne zachowanie pojedynczego receptora przechodzącego między stanem aktywnym (On) a nieaktywnym (Off) w obecności agonisty. Stałe powinowactwa agonisty do stanów aktywnego i nieaktywnego oznaczono odpowiednio jako K_b i K_a. Przedstawiono zachowanie populacji, czyli teoretyczne zachowanie kilku receptorów przechodzących losowe przejścia między stanami aktywnym a nieaktywnym w obecności agonisty. Przedstawiono średnią populacyjną, czyli średni poziom aktywacji receptorów w populacji receptorów w obecności określonego stężenia agonisty. Poziom aktywacji populacji receptorów jest znany jako bodziec.

Rysunek 2. Zależność między funkcją aktywacji receptora a skutecznością (ε) i obserwowaną stałą powinowactwa (K_obs) agonisty. Średnia populacyjna, przedstawiono średni poziom aktywacji receptora wywołany przez zwiększające się stężenia agonisty. Aktywacja receptora, średni poziom aktywacji receptora naniesiono w funkcji logarytmu stężenia agonisty. Ujemny logarytm stężenia agonisty wymaganego do osiągnięcia połowy maksymalnej aktywacji receptora jest równoważny logarytmowi obserwowanej stałej powinowactwa agonisty (log K_obs). Maksimum funkcji aktywacji receptora oznaczono jako skuteczność (ε).

Rysunek 3. Przykłady krzywych koncentracja-odpowiedź dla stymulacji akumulacji [³H]inozytofosforanu przez różne agoniści muskarynowi w komórkach jajnika chomika syryjskiego wykazujących ekspresję ludzkiego receptora muskarynowego M₃. Zmierzono łącznie dziewięć krzywych koncentracja-odpowiedź agonistów. Eksperyment można podzielić na dwie części. W każdej części standardowy agonista (oksotremoryna-M) jest zawsze testowany wraz z dodatkowymi agonistami. Zatem, aby zmierzyć krzywe koncentracja-odpowiedź dziewięciu agonistów, wymagane są dwa eksperymenty typu pokazanego w a i b, jeśli jednocześnie można przebadać tylko pięciu agonistów. Dane pochodzą z pracy Ehlert et al. ¹².

Rycina 4. Przykłady krzywych koncentracyjno-odpowiedzi dla stymulacji akumulacji [³H]inozytofosforanu przez różne agoniści muskarynowe w komórkach HEK 293 wykazujących ekspresję ludzkiego receptora muskarynowego M₂ oraz G_α15. Ekspresja receptora M₂ wywołała odpowiedź [³H]inozytofosforanu na poziomie 30 - 35%, co przypisano konstytutywnej aktywności receptora. Dane pochodzą z pracy Ehlert et al. ¹².

Rysunek 5. Hydroliza fosfoinozytydów indukowana agonistami muskarynowymi w komórkach jajnika chomika chińskiego stabilnie ekspresujących ludzki receptor muskarynowy M₃. Przedstawiono krzywe zależności odpowiedzi od stężenia wybranych agonistów muskarynowych stymulujących hydrolizę fosfoinozytydów. Wykazano wartości średnie z trzech eksperymentów ± SEM. Dane pochodzą z pracy Ehlert et al. ¹².

Rycina 6. Hydroliza fosfoinozytydów indukowana przez oksotremorynę-M i McN-A-343 w komórkach HEK 293 wykazujących ekspresję G_α15 oraz receptora muskarynowego M₃. Hydrolizę fosfoinozytydów wyrażono względem E_max dla oksotremoryny-M. Wobec braku agonisty hydroliza fosfoinozytydów przypisywana ekspresji receptora M₃ stanowiła około 2% odpowiedzi. Przedstawiono średnie z trzech eksperymentów ± SEM. Dane pochodzą z pracy Ehlert et al. ³.

Dyskusja

Ponieważ nasza metoda szacowania RA_i (względna wartość K_b) wymaga jedynie pomiaru krzywych zależności odpowiedzi od stężenia agonisty, nasza analiza może zostać przeprowadzona w dowolnym momencie, gdy krzywe te są mierzone.

Jeśli dobowa zmienność odpowiedzi preparatu eksperymentalnego (np. komórek lub tkanki) jest duża, pomiary odpowiedzi każdej krzywej zależności dawka-odpowiedź można znormalizować względem szacunkowej wartości „Top” standardowego agoni...