Kwantyfikacja aktywności agonistycznej receptorów sprzężonych z białkiem G

Podsumowanie

Opisano metodę szacowania stałej powinowactwa agonisty do stanu aktywnego (K_b) receptora sprzężonego z białkiem G. Analiza dostarcza bezwzględnych lub względnych wartości K_b w zależności od tego, czy konstytutywna aktywacja receptora jest mierzalna. Nasza metoda ma zastosowanie do różnych odpowiedzi występujących w kaskadzie sygnałowej po aktywacji receptora.

Streszczenie

Gdy agonista aktywuje populację receptorów sprzężonych z białkiem G (GPCR), wywołuje on ścieżkę sygnalizacyjną, która kończy się odpowiedzią komórki lub tkanki. Proces ten można analizować na poziomie pojedynczego receptora, populacji receptorów lub odpowiedzi efektorowej. W niniejszej pracy opisujemy, jak analizować odpowiedź efektorową w celu uzyskania szacunkowej wartości stałej powinowactwa agonisty do stanu aktywnego pojedynczych receptorów.

Receptory zachowują się jak przełączniki kwantowe, które zmieniają swój stan między aktywnym a nieaktywnym (Rycina 1). Stan aktywny wchodzi w interakcje ze specyficznymi białkami G lub innymi partnerami sygnalizacyjnymi. Wobec braku ligandów przeważa stan nieaktywny. Wiązanie agonisty zwiększa prawdopodobieństwo przejścia receptora w stan aktywny, ponieważ jego stała powinowactwa do stanu aktywnego (K_b) jest znacznie większa niż do stanu nieaktywnego (K_a). Sumowanie losowych sygnałów wyjściowych wszystkich receptorów w danej populacji daje stały poziom aktywacji receptorów w czasie. Odwrotność stężenia agonisty wywołującego połowową maksymalną aktywację receptorów jest równoważna obserwowanej stałej powinowactwa (K_obs), a frakcja kompleksów agonista-receptor w stanie aktywnym jest definiowana jako skuteczność (ε) (Rycina 2).

Opracowano metody analizy odpowiedzi efektorowych GPCR, które umożliwiają oszacowanie K_obs oraz względnej skuteczności agonisty ^1,2. W niniejszym raporcie pokazujemy, jak zmodyfikować tę analizę w celu oszacowania wartości K_b agonisty względem innego agonisty. W przypadku testów wykazujących aktywność konstytutywną pokazujemy, jak oszacować K_b w bezwzględnych jednostkach M^-1.

Nasza metoda analizy krzywych zależności odpowiedzi od stężenia agonisty ^3,4 polega na globalnej regresji nieliniowej z wykorzystaniem modelu operacyjnego ⁵. Opisujemy procedurę z użyciem aplikacji oprogramowania Prism (GraphPad Software, Inc., San Diego, CA). Analiza pozwala na oszacowanie iloczynu K_obs oraz parametru proporcjonalnego do skuteczności (τ). Iloraz oszacowania τK_obs jednego agonisty i drugiego stanowi wzglomną miarę K_b (RA_i) ⁶. W przypadku każdego receptora wykazującego aktywność konstytutywną możliwe jest oszacowanie parametru proporcjonalnego do skuteczności wolnego kompleksu receptorowego (τ_sys). W takim przypadku wartość K_b agonisty jest równoważna τK_obs/τ_sys ³.

Nasza metoda jest użyteczna do określania selektywności agonisty względem podtypów receptorów oraz do ilościowego pomiaru sygnalizacji agonista-receptor poprzez różne białka G.

Protokół

1. Pomiar krzywych zależności odpowiedzi od stężenia agonisty: brak aktywności konstytutywnej

1. Do oceny względnej aktywności agonistycznej K_b wartości (RZS_i), wymagane jest wyznaczenie serii co najmniej dwóch krzywych zależności odpowiedzi od stężenia agonisty. Wszelkie in vitro analizę odpowiedzi funkcjonalnej GPCR można przeprowadzić pod warunkiem, że możliwe jest kontrolowanie stężenia agonisty, a odpowiedź jest pośredniczona przez jeden typ receptora. Odpowiednie analizy oparte na komórkach obejmują pomiar cAMP ^4,7 oraz akumulacja inozytolofosforanów ^8,9 w linii komórkowej wykazującej ekspresję receptora rekombinowanego. Przykładami testów z użyciem całych tkanek jest pomiar skurczu mięśni gładkich ¹⁰ lub M₂ receptorów muskarynowych i $\beta$₁zmiany w skurczu lewego przedsionka szczura stymulowanego elektrycznie, pośredniczące przez adrenoreceptory ¹¹.
2. Należy wybrać serię agonistów do analizy, w tym agonistę o wysokiej skuteczności (np. ligand endogenny). W ramach danego eksperymentu należy wyznaczyć pełne krzywe koncentracja-odpowiedź dla każdego agonisty. Jeśli liczba agonistów jest zbyt duża, aby przeprowadzić analizę w jednym eksperymencie, należy podzielić ich na podgrupy, z których każda będzie zawierać liczbę agonistów możliwą do przebadania podczas jednej serii pomiarowej. Dla każdej podgrupy należy wyznaczyć krzywą koncentracja-odpowiedź dla agonisty o wysokiej skuteczności wraz z krzywymi dla pozostałych agonistów z danej podgrupy (patrz Rys. 3). Eksperyment dla każdej podgrupy należy powtórzyć w przybliżeniu od 3 do 6 razy, w zależności od zmienności danych.
3. Dla każdej krzywej zależności odpowiedzi od stężenia należy zmierzyć odpowiedź w obecności samego agonisty (odpowiedź podstawowa) oraz w obecności rosnących stężenia agonisty. Stężenia agonisty należy rozmieścić równomiernie w skali logarytmicznej, w odstępach około 0,3–0,7 log.₁₀ jednostki, obejmujące zakres odpowiedzi i definiujące odpowiedź maksymalną (E_maksymalny) (patrz Ryc. 3). W przypadku eksperymentów na liniach komórkowych każdy pomiar wykonano w trzech powtórzeniach.
4. Należy odjąć odpowiedź podstawową od wartości zmierzonych w obecności każdego stężenia agonisty. W ten sposób obliczono odpowiedzi przedstawione na rysunku 3.

2. Wstępna analiza krzywych odpowiedź-stężenie agonisty: brak aktywności konstytutywnej

1. Wprowadź dane z eksperymentów zależności odpowiedzi od stężenia (np. Rycina 5) do tabeli danych w programie Prism. Wszystkie logarytmiczne wartości stężeń agonisty należy wpisać w kolumnie oznaczonej jako X. Pomiary odpowiedzi dla agonisty, który wydaje się mieć największą E_maksymalny Wartości wprowadza się do kolumny A, a wartości dla innego agonisty do sąsiednich kolumn oznaczonych literami. Powtórne pomiary krzywych stężenie-odpowiedź wprowadza się do podkolumn danej kolumny oznaczonej literą.
2. Wybierz arkusz wykresu, na którym naniesiono dane, a następnie przeanalizuj dane za pomocą nieliniowej analizy regresji, stosując równanie o nazwie log(agonist) vs. response - Variable slope (four parameters). Ogranicz „Dółparametr na zero i przeprowadź analizę regresji. Skopiuj „Góra" (E_maksymalny) oraz log EC₅₀ parametry do arkusza kalkulacyjnego Excel w celu obliczenia wstępnych wartości szacunkowych parametrów. Agonista o największym E_maksymalny szacunek określono jako „agonistę standardowego”, natomiast pozostałe agonisty określono jako „agonisty testowe”.
3. Oblicz wstępną wartość log τK_obs (LOGR1) jako ujemny logarytm EC₅₀ wartość standardowego agonisty (-log EC₅₀').
   
   Oblicz wstępną wartość logarytmu RZS_i wartość każdego testowanego agonisty (LOGRA) jako log {(Top*EC₅₀')/(Góra'*EC₅₀)}, w którym parametry standardowego agonisty oznaczone są apostrofem.
   
   Oblicz logarytmiczne stałe powinowactwa badanych agonistów (LOGK2 – LOGK5) jako ujemny logarytm ich odpowiednich EC₅₀ wartości.

3. Szacowanie wartości RAi dla agonistów za pomocą nieliniowej analizy regresji: brak aktywności konstytutywnej

1. Wprowadź dane do tabeli danych (Data Table) w programie Prism zgodnie z opisem w punkcie 2.1. Upewnij się, że dane dla agonisty standardowego znajdują się w kolumnie A.
2. Wprowadź do programu Prism zdefiniowane przez użytkownika równanie „log RAi” w kilku liniach, tak jak pokazano dla przypadku z łączną liczbą pięciu agonistów:
   • P=LOGK1
   • Q=LOGR
   • <~A>Q=LOGR+LOGRA
   • P=LOGK2
   • P=LOGK3
   • P=LOGK4
   • P=LOGK5
   • Y=Msys/(1+{[(1+10^(X+P))/(10^(X+Q))]^M})
3. Wprowadź początkowe wartości parametrów w następujący sposób:
   Dla logarytmicznej stałej powinowactwa (LOGK1) agonisty standardowego wprowadź dowolnie niską wartość 0.
   
   Wprowadź początkowe szacunki dla LOGR, stałych powinowactwa (LOGK2 – LOGK5) oraz wartości log RAi (LOGRA) agonistów badanych.
   
   Dla początkowego szacunku współczynnika nachylenia przetwornika (M) przypisz wartość 1,0.
   
   Dla początkowego szacunku maksymalnej odpowiedzi systemu (Msys) przypisz wartość odpowiadającą E_max agonisty standardowego (Top′).
4. Zastosuj następujące ograniczenia parametrów: LOGK1 ograniczone do stałej 0; LOGR1, Msys i M jako wartość współdzielona dla wszystkich zestawów danych; LOGK2 – LOGK5 oraz LOGRA bez ograniczeń.
5. Uruchom analizę regresji nieliniowej. Wyniki dostarczą wartości log K_obs oraz log RA_i dla agonistów badanych. Jeśli agonista standardowy jest pełnym agonistą, to zarówno wartości log K_obs, jak i log RA_i są dokładne. Jeśli najbardziej skuteczny agonista (agonista standardowy) jest w rzeczywistości agonistą częściowym, wartości K_obs dla bardziej skutecznych agonistów mogą być zawyżone. Niemniej jednak szacunki log RA_i pozostają w tej sytuacji dokładne.
6. Jeśli regresja nie zbiega się, badacz może spróbować wykreślić krzywą teoretyczną zdefiniowaną przez początkowe szacunki parametrów. W przypadku wystąpienia dużych odchyleń między punktami danych a krzywymi teoretycznymi należy sprawdzić obliczenia początkowych szacunków parametrów. Jeśli jeden lub więcej agonistów posiada wartości E_max odpowiadające wartości agonisty standardowego, może być konieczne ograniczenie ich wartości log K_obs do 0, aby regresja zbiegła się do rozwiązania.

4. Pomiar krzywych zależności odpowiedzi od stężenia agonisty w testach komórkowych wykazujących konstytutywną aktywność receptora

1. Do szacowania wartości K_b agonistów w bezwzględnych jednostkach M^-1 stosuje się komórkowe testy in vitro wykazujące konstytutywną aktywność receptora. Konstytutywną aktywność receptora definiuje się jako wzrost odpowiedzi powyżej poziomu podstawowego wywołany ekspresją badanego receptora.
2. Należy wybrać agonistów i zaprojektować eksperyment zgodnie z opisem w sekcji 1.2 powyżej.
3. Dla każdej krzywej koncentracja-odpowiedź należy zmierzyć odpowiedź w obecności agonisty w komórkach nietransfekowanych (odpowiedź podstawowa) oraz w komórkach transfekowanych badanym receptorem (odpowiedź podstawowa + odpowiedź konstytutywna). Należy zmierzyć odpowiedź w obecności różnych stężeń różnych agonistów zgodnie z opisem w sekcji 1.3 powyżej.
4. Konstytutywną aktywność receptora oraz odpowiedź na każde stężenie agonisty oblicza się jako zmierzoną odpowiedź pomniejszoną o odpowiedź podstawową w komórkach nietransfekowanych receptorem. Rycina 6 przedstawia odpowiedzi na różne agonisty obliczone w ten sposób dla szlaku sygnałowego wykazującego bardzo niską aktywność konstytutywną.

5. Wstępna analiza krzywych koncentracyjno-odpowiedzi agonistów wykazujących aktywność konstytutywną

1. Wprowadź dane (np. Rysunek 6) do tabeli danych w programie Prism zgodnie z opisem w sekcji 3.1, ale wprowadź również odpowiedź wywołaną przez konstytutywną aktywność receptora w odpowiednich kolumnach literowych odpowiadających logarytmicznemu stężeniu agonisty wynoszącemu -20. Wprowadzany jest duży ujemny logarytm, aby przybliżyć stężenie agonisty do zera.
2. Przeanalizuj dane zgodnie z opisem w sekcji 2.2 powyżej, ale z parametrem „Bottom” ograniczonym tak, aby był on „wspólny dla wszystkich zestawów danych” (shared for all data sets). Skopiuj parametry „Top” (E_max), wspólny „Bottom” oraz log EC50 do arkusza Excel w celu wykorzystania ich w obliczeniach wstępnych szacunków parametrów.
3. Oblicz wstępne szacunki parametrów w następujący sposób:
   
   Logarytmiczna stała powinowactwa standardowego agonisty (LOGK1) lub dowolnego pełnego agonisty testowego musi zostać wyznaczona w oddzielnych eksperymentach, jak opisano wcześniej ³.
   
   Oblicz wstępną wartość log K_obs dla każdego częściowego agonisty testowego (tj. w tym przypadku tylko LOGK2) jako log {(Top'-Top)/(EC₅₀(Top′- Bottom))}, gdzie „Bottom” oznacza odpowiedź wywołaną przez konstytutywną aktywację receptora.
   
   Oblicz wstępną wartość log K_b (LOGKb) dla każdego agonisty jako log {Top/(EC₅₀Bottom)}.
   
   Oblicz wstępną wartość log τ_sys (LOGTsys) jako log {Bottom/(Top′ - Bottom)}.

6. Szacowanie wartości Kb agonisty dla odpowiedzi wykazujących konstytutywną aktywność receptora przy użyciu nieliniowej analizy regresji

1. Wprowadź dane do Tabeli Danych (Data Table) w programie Prism zgodnie z opisem w punkcie 3.1
2. Wprowadź zdefiniowane przez użytkownika równanie „Log Kb” do programu Prism w kilku liniach, jak pokazano dla warunku dwóch agonistów:
   • LOGKOBS = LOGK1
   • LOGKOBS = LOGK2
   • A=(10^(X+LOGKOBS))+1
   • B=10^(X+LOGTSYS+LOGKB)
   • C=(10^(LOGTSYS))
   • Y=Msys/{1+[(A/(B+C))^M]}
3. Wprowadź wstępne szacunki parametrów w następujący sposób:
   
   Wprowadź stałe powinowactwa każdego agonisty (LOGK1 – wprowadź wartość wyznaczoną w kroku 5.3).
   
   Wprowadź szacunki K_obs dla każdego testowanego agonisty.
   
   Wprowadź szacunki Kb agonistów.
   
   Wprowadź szacunek log τ_sys (LOGTsys).
   
   Przypisz współczynnik nachylenia przetwornika (M) oraz maksymalną odpowiedź systemu (Msys) odpowiednio wartości 1,0 oraz Top' (E_max standardowego agonisty).
4. Zastosuj następujące ograniczenia parametrów: LOGTsys, Msys oraz M – wartość wspólna dla wszystkich zestawów danych; LOGK2 oraz LOGKb – brak ograniczeń.
5. Uruchom analizę regresji nieliniowej. Wyniki pozwalają wyznaczyć log K_b standardowego agonisty, wartości log K_obs i log K_b agonistów częściowych, maksymalną odpowiedź systemu (Msys), wartość τ_sys dla wolnego kompleksu receptorowego (LOGTsys) oraz współczynnik nachylenia przetwornika w modelu operacyjnym (M).
6. Jeśli regresja nie zbiega, postępuj zgodnie z krokami opisanymi powyżej w punkcie 3.6.

7. Reprezentatywne wyniki

Rysunek 5 przedstawia niektóre z naszych wcześniej opublikowanych danych dotyczących indukowanej przez agonistów muskarynowych hydrolizy fosfoinozytolu w komórkach jajnika chomika syryjskiego stabilnie ekspresujących receptor muskarynowy M₃ ¹². W tym teście zmierzono krzywe koncentracja-odpowiedź wybranych agonistów muskarynowych. Dane przeanalizowano zgodnie z opisem w Sekcji 3, aby oszacować wartość K_b każdego agonisty, wyrażoną w stosunku do wartości dla oksotremoryny-M. Szacunki log RA_i wyniosły odpowiednio: dla karbacholu -0,56 ± 0,063; arekoliny -0,60 ± 0,074; pilokarpiny -1,20 ± 0,15 oraz McN-A-343 -1,92 ± 0,31. Krzywe teoretyczne przedstawiają dopasowanie metodą najmniejszych kwadratów równania regresji do danych (Sekcja 3.2). Odpowiednie oszacowania maksymalnej odpowiedzi systemu (M_sys) oraz współczynnika nachylenia przetwornika (M) wyniosły odpowiednio 53,9 ± 1,3 i 1,15 ± 0,09. Wartości log K_obs agonistów, z wyjątkiem oksotremoryny-M, wyniosły: dla karbacholu 5,19 ± 0,14; arekoliny 5,49 ± 0,12; pilokarpiny 5,58 ± 0,16 oraz McN-A-343 5,27 ± 0,3.

Rysunek 6 przedstawia wyniki eksperymentów dotyczących stymulowanej agonistą muskarynowym hydrolizy fosfoinozytydów w komórkach HEK 293 stabilnie ekspresujących G_α15 ³. Przejściowa ekspresja receptora muskarynowego M₃ spowodowała wzrost podstawowej hydrolizy fosfoinozytydów, co przypisano konstytutywnej aktywności receptora. Dane przeanalizowano w celu oszacowania wartości log K_b dla oksotremoryny-M oraz McN-A-343, zgodnie z opisem w sekcji 6. Analiza ta pozwoliła uzyskać wartości log K_b wynoszące odpowiednio 8,30 ± 0,59 dla oksotremoryny-M oraz 6,59 ± 0,7 dla McN-A-343. Krzywe teoretyczne reprezentują dopasowanie metodą najmniejszych kwadratów równania regresji do danych (patrz sekcja 6.2). Wartości szacunkowe dla log τ_sys, M_sys i M wyniosły odpowiednio -2,29 ± 0,59, 95,8 ± 2,8 oraz 0,72 ± 0,08. Wartość szacunkowa K_obs dla McN-A-343 wyniosła 5,35 ± 0,46.

Rysunek 1. Zależność między aktywnością pojedynczego receptora a średnim poziomem aktywacji populacji receptorów. Aktywność pojedynczego receptoraprzedstawiono teoretyczne zachowanie pojedynczego receptora przechodzącego przejścia między stanem aktywnym (Włączony) a nieaktywnym (Wyłączony) w obecności agonisty. Stałe powinowactwa agonisty do stanów aktywnego i nieaktywnego oznaczono jako K_b i K_aodpowiednio. Zachowanie populacjiprzedstawiono teoretyczne zachowanie kilku receptorów przechodzących losowe przejścia między stanami aktywnym a nieaktywnym w obecności agonisty. Średnia populacyjnaprzedstawiono średni poziom aktywacji receptorów w populacji receptorów w obecności określonego stężenia agonisty. Poziom aktywacji populacji receptorów nazywa się bodźcem.

Rycina 2. Zależność między funkcją aktywacji receptora a skutecznością (ε) oraz zaobserwowaną stałą powinowactwa (K_obs) agonisty. Średnia populacyjnaprzedstawiono średni poziom aktywacji receptora wywołany przez zwiększające się stężenia agonisty. Aktywacja receptoraśredni poziom aktywacji receptorów zostaje naniesiony na wykres w funkcji logarytmu stężenia agonisty. Ujemny logarytm stężenia agonisty wymaganego do uzyskania połowy maksymalnej aktywacji receptorów jest równy logarytmowi obserwowanej stałej powinowactwa agonisty (log K_OBS). Maksimum funkcji aktywacji receptora określa się mianem skuteczności (ε).

Rysunek 3. Przykłady krzywych koncentracja-odpowiedź dla stymulacji [³Akumulacja inozytofosforanów indukowana przez różne agoniści muskarynowe w komórkach jajnika chomika syryjskiego wykazujących ekspresję ludzkiego receptora M₃ receptor muskarynowy. Pomiarowi poddano łącznie dziewięć krzywych zależności odpowiedzi od stężenia agonistów. Eksperyment można podzielić na dwie części. W każdej z nich standardowy agonista (oksotremoryna-M) jest zawsze testowany wraz z dodatkowymi agonistami. W ten sposób przeprowadzono dwa eksperymenty typu przedstawionego w a i b wymagane jest zmierzenie krzywych koncentracja-odpowiedź dla dziewięciu agonistów, podczas gdy jednorazowo można przebadać tylko pięciu agonistów. Dane pochodzą od Ehlerta i wsp. ¹².

Rysunek 4. Przykłady krzywych koncentracja-odpowiedź dla stymulacji [³Akumulacja inozytolofosforanów indukowana przez różne agoniści muskarynowi w komórkach HEK 293 wykazujących ekspresję ludzkiego receptora M₂ receptor muskarynowy i białko G_α15Ekspresja M₂ receptor spowodował 30–35% [³odpowiedź inozytolofosforanowa, którą przypisano konstytutywnej aktywności receptora. Dane pochodzą od Ehlerta it al. ¹².

Rycina 5. Hydroliza fosfoinozytydów indukowana przez agonistów muskarynowych w komórkach CHO (Chinese hamster ovary) stabilnie ekspresujących ludzki receptor M₃ receptor muskarynowy. Przedstawiono krzywe koncentracja-odpowiedź wybranych agonistów muskarynowych w stymulacji hydrolizy fosfoinozytoldów. Przedstawiono wartości średnie z trzech eksperymentów ± SEM. Dane pochodzą od Ehlerta i wsp. ¹².

Rycina 6. Hydroliza fosfoinozytydów indukowana oksotremoriną-M oraz McN-A-343 w komórkach HEK 293 wykazujących ekspresję G_α15 oraz M₃ receptor muskarynowy. Hydroliza fosfoinozytolidów jest wyrażona w stosunku do E_maksymalny oksotremoryny-M. Wobec braku agonisty hydroliza fosfoinozytoleów przypisywana ekspresji M₃ receptor odpowiadał za około 2% odpowiedzi. Przedstawiono średnie z trzech eksperymentów ± SEM. Dane pochodzą od Ehlerta i wsp. ³.

Dyskusja

Ponieważ nasza metoda szacowania RA_i (względna wartość K_b) wymaga jedynie pomiaru krzywych zależności odpowiedzi od stężenia agonisty, nasza analiza może zostać przeprowadzona w dowolnym momencie, gdy krzywe te są mierzone.

Jeśli dobowa zmienność odpowiedzi preparatu eksperymentalnego (np. komórek lub tkanki) jest duża, pomiary odpowiedzi każdej krzywej zależności dawka-odpowiedź można znormalizować względem szacunkowej wartości „Top” standardowego agoni...