Opisano alternatywną metodę izolacji embrionalnych motoneuronów mysich z rdzenia kręgowego. Metoda ta wykorzystuje fakt, że lektyna może wiązać się z niskopodobnym receptorem czynnika wzrostu nerwów p75NTR. To oparte na lektynach wstępne wysiewanie (preplating) pozwala na puryfikację podobną do tej uzyskiwanej za pomocą specyficznego przeciwciała przeciwko p75NTR.
Artykuł metodologiczny
Izolacja i hodowla embrionalnych motoneuronów myszy z wykorzystaniem lektyn
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Rdzeniowe motoneurony rozwijają się do etapów postmitotycznych podczas wczesnego rozwoju embrionalnego układu nerwowego, a następnie wypuszczają dendryty i aksony. Komórki neuroepitelialne cewy nerwowej wykazujące ekspresję Nkx6.1 są jedynymi komórkami prekursorowymi rdzeniowych motoneuronów1. Postmitotyczne motoneurony przemieszczają się w stronę swojej docelowej pozycji i organizują się w kolumny wzdłuż szlaku rdzeniowego2,3. Ponad 90% wszystkich tych zróżnicowanych i odpowiednio usytuowanych motoneuronów wykazuje ekspresję czynników transkrypcyjnych Islet 1/2. Innervują one mięśnie kończyn, a także mięśnie ciała i narządów wewnętrznych. Motoneurony typowo wykazują między innymi ekspresję receptorów o wysokim powinowactwie do czynnika neurotroficznego pochodzenia mózgowego (BDNF) oraz neurotrofiny-3 (NT-3), czyli kinaz tropomiozynowych B i C (TrkB, TrkC). Nie wykazują one ekspresji kinazy tropomiozynowej A (TrkA)4. Oprócz dwóch receptorów o wysokim powinowactwie, motoneurony wykazują ekspresję receptora neurotrofin o niskim powinowactwie p75NTR. p75NTR może wiązać wszystkie neurotrofiny z podobnym, lecz niższym powinowactwem niż to, z jakim receptory o wysokim powinowactwie wiążą dojrzałe neurotrofiny. W embrionalnym rdzeniu kręgowym p75NTR jest ekskluzywnie wyrażany przez rdzeniowe motoneurony5. Wykorzystano to do opracowania technik izolacji motoneuronów w celu oczyszczenia tych komórek z ogromnej większości komórek otaczających6. Izolowanie motoneuronów za pomocą specyficznych przeciwciał (metodą panningu) przeciwko domenom zewnątrzkomórkowym p75NTR okazało się metodą kosztowną, ponieważ ilość przeciwciał zużywana w pojedynczym doświadczeniu jest wysoka ze względu na rozmiar płytki używanej do panningu. Znacznie bardziej ekonomiczną alternatywą jest zastosowanie lektyny. Wykazano, że lektyna również specyficznie wiąże się z p75NTR7. Poniższa metoda opisuje alternatywną technikę wykorzystującą aglutyninę z zarodków pszenicy w procedurze preplatingu zamiast przeciwciała p75NTR. Lektyna jest niezwykle tanią alternatywą dla przeciwciała p75NTR, a stopień oczyszczenia przy użyciu lektyny jest porównywalny do tego uzyskiwanego za pomocą przeciwciała p75NTR. Motoneurony z embrionalnego rdzenia kręgowego mogą być izolowane tą metodą, przeżywają i wypuszczają neuryty.
Protokół
W przypadku odczynników specjalistycznych: patrz Tab. 1. Wszystkie pozostałe wymienione odczynniki są jakości do hodowli komórkowych, zakupione w firmie Sigma Aldrich.
1. Powlekanie szalek/szkiełek podstawkowych PORN-H/lamininą
- Przygotować roztwór roboczy hydrobromku poli-DL-ornityny (PORN-H) o stężeniu 0.5 mg/ml w 150 mM buforze boranowym o pH 8.35.
- Roztwór zapasowy o stężeniu 50 mg PORN/1 ml buforu boranowego można przygotować wcześniej i przechowywać w temperaturze -20°C.
- Zesterylizować szklane laminki poprzez opalanie w 100% etanolu i pozostawić do wyschnięcia na powietrzu.
- Pokryć powierzchnię odpowiednią ilością roztworu PORN-H i inkubować przez noc w temperaturze 4°C.
- Następnego dnia wypłukać laminki trzykrotnie sterylną wodą i pozostawić do wyschnięcia na powietrzu.
- Przygotować roztwór roboczy lamininy o stężeniu 2.5 μg/ml w HBSS.
- Alikwoty można przechowywać w temperaturze -20°C. Odmrozić w temperaturze 4°C bezpośrednio przed użyciem.
- Pokryć powierzchnię laminek powlekonych PORN-H roztworem lamininy i inkubować przez co najmniej 2 h w temperaturze pokojowej do momentu użycia.
2. Powlekanie płytki do oczyszczania lektynami
- Przygotować roztwór 10 mM Tris w wodzie sterylnej o pH 9,5.
- Dodać lektynę (rozpuścić proszek lektyny (Sigma L9640) w HBSS) do stężenia końcowego 10 μg/ml.
- Pokryć powierzchnię 10 cm szalki do hodowli komórek 8 ml roztworu lektyny i inkubować przez co najmniej 30 min w temperaturze pokojowej.
- Przemyć szalkę trzykrotnie HBSS i przechowywać w HBSS do momentu użycia.
- Przygotować roztwór depolaryzujący zawierający 30 mM KCl i 0,8% (w/v) NaCl. Sterylizować metodą filtracji i przechowywać w temperaturze pokojowej (RT).
3. Pożywka do hodowli motoneuronów
- Rozmrozić surowicę konia przez noc w temperaturze 4°C, a następnie inaktywować w temperaturze 55°C przez 30 min. Rozdzielić na aliquoty po 5 ml i przechowywać w temperaturze -20°C. Alikwot rozmrażać w temperaturze pokojowej bezpośrednio przed użyciem.
- Suplement B27 przechowywać w alikwotach po 1 ml w temperaturze -20°C. Rozmrażać suplement B27 w temperaturze pokojowej bezpośrednio przed użyciem. Unikać cykli zamrażania i rozmrażania.
- Rozdzielić glutamax na alikoty po 0,5 ml i przechowywać w temperaturze -20°C; stosować w rozcieńczeniu 1:100.
- Przygotować roztwór stokowy CNTF o stężeniu 10 μg/ml w wodzie sterylnej z dodatkiem 0,1% BSA. Przechowywać w temperaturze -20°C.
- Bezpośrednio przed użyciem wymieszać 46 ml medium neurobasal z 2,5 ml surowicy konia, 1 ml suplementu B27 oraz 0,5 ml glutamax.
- Dodać CNTF do stężenia końcowego 10 ng/ml w medium, a następnie podgrzać medium do temperatury 37°C.
4. Disekcja rdzenia kręgowego
- Uśmierć mysz w 12,5 dniu ciąży (E12.5) i ostrożnie wyjmij zarodki. Dodaj odpowiednią ilość RT HBSS, aby całkowicie przykryć zarodki.
- Usuń głowę i ogon, a następnie ułóż zarodek grzbietem do góry z rozstawionymi kończynami.
- Unieruchom zarodek jedną pęsetą i za pomocą drugiej pęsety usuń skórę zewnętrzną.
- Usuń rdzeń kręgowy, wsuwając pęsetę pod niego i unosząc go ruchami piłującymi po obu stronach rdzenia.
- Przenieś wyizolowany rdzeń kręgowy do nowej szalki z HBSS i otwórz kanał centralny rdzenia od strony grzbietowej.
- Usuń zwoje korzeni grzbietowych poprzez usunięcie otaczających rdzeń kręgowy opon mózgowo-rdzeniowych.
- Zbierz części lędźwiowe rdzeni kręgowych z maksymalnie 6 zarodków na jedną płytkę z lektyną do probówki typu Eppendorf wypełnionej 1 ml HBSS i przechowuj w lodzie do czasu zakończenia preparacji.
5. Wzbogacanie populacji motoneuronów poprzez oczyszczanie z wykorzystaniem lektyn
Uwaga: Przed rozpoczęciem kolejnych kroków należy przygotować i ogrzać pożywkę (patrz krok 3.).
- Przygotować roztwór trypsyny, rozpuszczając 1 g trypsyny w 100 ml HBSS; przechowywać w temperaturze -20°C i rozmrażać w temperaturze 4°C.
- Zmieszać 1 g inhibitora trypsyny z 98 ml HBSS i 2 ml 1 M HEPES pH 7.4; alikwoty o objętości 1 ml należy przechowywać w temperaturze 4°C.
- Przenieść probówkę z rdzeniami kręgowymi do komory z laminarnym przepływem powietrza i ostrożnie usunąć 700 μl HBSS.
- Dodać 7,5 μl roztworu trypsyny i wymieszać poprzez ostrożne odwracanie probówki.
- Przeprowadzić trypsynizację przez 8 min w temperaturze 37°C.
- Zatrzymać reakcję, dodając 30 μl inhibitora trypsyny, a następnie ostrożnie pipetować roztwór w górę i w dół (tryturacja) 10-15 razy za pomocą końcówki do pipety 1000 μl, aż do całkowitego zniknięcia agregatów komórkowych. Powtórzyć tryturację za pomocą pipety 20-200 μl i odpowiadającej jej końcówki.
- Przenieść zawiesinę komórkową do płytki z lektyną wypełnionej HBSS i rozprzestrzenić komórki poprzez delikatne obracanie płytką.
- Pozostawić płytkę z lektyną na 60 min w RT na powierzchni wolnej od wibracji. Przykryć płytkę, aby uniknąć kontaminacji.
- Bardzo delikatnie usunąć HBSS i ostrożnie przemyć płytkę 4 razy podgrzanym HBSS, aby usunąć fragmenty komórek oraz komórki nieprzytwierdzone.
- Natychmiast po ostatnim etapie płukania dodać do płytki 500 μl roztworu do depolaryzacji i inkubować przez 1 min.
- Ułatwić odłączenie komórek związanych z lektyną poprzez wstrząsanie i opukiwanie płytki.
- Wypełnić płytkę 2 ml podgrzanego pożywki hodowlanej i przenieść zawartość do probówki typu Falcon 15 ml.
- Policzyć komórki za pomocą komory liczącej Neubauera.
- Wysiać komórki na pokrywka szkiełkach lub płytkach powlekanych lamininą w odpowiedniej liczbie, zależnie od zastosowania.
- Dokonać wymiany pożywki w 1. dniu, a następnie co drugi dzień, ostrożnie wymieniając 50% starej pożywki. Zawsze używać podgrzanej, świeżo przygotowanej nowej pożywki hodowlanej.
6. Reprezentatywne wyniki:
Zarodkowe motoneurony można uzyskać z embrionów myszy w dniach E12 do E14. Motoneurony stanowią 2-3% całkowitej populacji komórek lędźwiowego odcinka rdzenia kręgowego, a ponieważ neurony zwojów korzeni grzbietowych są również p75NTR-dodatnie, ważne jest usunięcie tych komórek przed rozpoczęciem procedury wstępnego wysiewania opartej na lektynach (przegląd przedstawiono na Rysunku 1 i Rysunku 2). Po drugie, opony mózgowo-rdzeniowe zawierają intensywnie dzielące się komórki, które również należy wykluczyć, ponieważ nie mogą być one prawidłowo usunięte w procedurze wstępnego wysiewania opartej na lektynach (Rysunek 2 i Rysunek 3). W gorszych przypadkach komórki te mogą zdominować płytki hodowlane. Reprezentatywne obrazy na Rysunku 3B i 3D dają również wyobrażenie o niższej gęstości komórek po przeprowadzeniu procedur płukania (patrz krok 5.9 protokołu). Hodowle zarodkowych motoneuronów myszy są zazwyczaj utrzymywane do pięciu lub siedmiu dni. W tym okresie komórki rozwijają swoje neuryty do maksymalnej długości (Rysunek 4). Długość neurytów silnie zależy od podłoża na płytkach8. Typowym podłożem jest laminina, którą nanosi się na naczynia hodowlane pokryte PORN-H. Motoneurony mogą również rosnąć na innych lub mniej zdefiniowanych podłożach, takich jak macierze zewnątrzkomórkowe generowane przez lizę wodną8. W przypadku suboptimalnego pokrycia, długość neurytów i powierzchnia stożka wzrostu ulegają zmniejszeniu, a śmiertelność komórek zazwyczaj wzrasta. Wsparcie troficzne odgrywa kluczową rolę w przeżywalności zarodkowych motoneuronów myszy w hodowli. Przeżywalność początkowo wysianych komórek w siódmym dniu spada do 10% do 20% bez wsparcia troficznego6. Mózgowy czynnik neurotroficzny (BDNF) oraz ciliarny czynnik neurotroficzny (CNTF) są najczęściej stosowanymi czynnikami, lecz inne mogą również promować przeżywalność [czynnik hamujący białaczkę (LIF), kardiotrofina-1 (CT-1), podstawowy czynnik wzrostu fibroblastów (bFGF), insulinopodobny czynnik wzrostu 1 (IGF-1)9].
Rycina 1. Schemat blokowy przygotowania embrionalnych motoneuronów myszy. Rysunek schematyczny przedstawia poszczególne etapy izolacji i hodowli embrionalnych motoneuronów myszy. Skróty: SC: rdzeń kręgowy; HBSS: zrównoważony roztwór soli Hanksa; MN: motoneuron.
Rysunek 2. Izolacja części lędźwiowej rdzenia kręgowego myszy w stadium E12.5. A: Zarodek myszy E12.5. W kolejnym kroku odcina się głowę i ogon, a ciało układa się grzbietem do góry B: Zarodek w pozycji z grzbietem do góry. Pincety po lewej i prawej stronie rdzenia kręgowego unieruchamiają ciało zarodka w tej pozycji. Następnie jedną z pęset używa się do nacięcia skóry oraz przecięcia tkanek pod rdzeniem kręgowym, podczas gdy druga służy do stabilizacji zarodka. C: Izolowany rdzeń kręgowy z zarodka myszy E12.5. Wskazano poszczególne odcinki rdzenia kręgowego (szyjny, piersiowy, lędźwiowy). Rdzeń kręgowy jest otoczony oponami, do których wciąż przylegają części zwojów korzeni grzbietowych. D: Rdzeń kręgowy zostaje przecięty wzdłużnie od strony grzbietowej, aby otworzyć go w kierunku kanału centralnego. E: Opony od strony brzusznej zostają teraz usunięte z rozpłaszczonego rdzenia kręgowego. Uwaga: Podczas usuwania, część lędźwiowa zostaje zaznaczona niewielkim nacięciem. F: Do dalszych procedur pobiera się wyłącznie część lędźwiową rdzenia kręgowego.
Rycina 3. Wyznaczanie i izolacja komórek Islet-dodatnich z odcinka lędźwiowego rdzenia kręgowego zarodków myszy E12.5. A: Przeciwciało Islet-1/2 znakuje kolumny motoneuronów w embrionalnym rdzeniu kręgowym odcinka lędźwiowego (czerwony, strzałka), a Hoechst znakuje wszystkie jądra w przekroju. Przekrój poprzeczny odcinka lędźwiowego rdzenia kręgowego E12.5. Zarodki myszy E12.5 utrwalono przez imersję w 4% paraformaldehydzie przez 6 h, przemyto 3 razy roztworem PBS i poddano działaniu sacharozy zgodnie ze standardowymi procedurami. Za pomocą kriotomu wykonano krioprzekroje o grubości 20 μm, a następnie przygotowano je do barwienia immunohistochemicznego zgodnie ze standardowymi procedurami11. Przekroje zostały następnie znakowane Hoechst w celu lokalizacji jąder komórkowych. Należy zauważyć, że neurony zwojów korzeni grzbietowych są również Islet-1/2-dodatnie, a procedura przygotowania wyklucza te części tkanki z procesu izolacji. B: Komórki zdysocjowane z odcinka lędźwiowego rdzenia kręgowego zarodków E12.5 znakowane Islet-1/2 (czerwony, strzałka), po lewej – przed i po prawej – po preplatingu opartym na lektynach. Komórki podbarwiono Hoechst w celu wizualizacji wszystkich jąder komórkowych. C: Ilościowe oznaczenie komórek Islet-1/2-dodatnich przed i po preplatingu opartym na lektynach. D: Motoneurony znakowane Nkx6.1 z zarodków E12.5 po jednym dniu hodowli. Komórki podbarwiono Hoechst w celu wizualizacji wszystkich jąder. Należy zauważyć, że 90% wszystkich komórek jest Nkx6.1-dodatnich. Skróty: SC: rdzeń kręgowy; MN: motoneuron; DRG: zwoj korzenia grzbietowego.
Rysunek 4. Charakterystyka neuronów ruchowych myszy E12.5. A i B: Wzbogacone izolowane neurony ruchowe lędźwiowego rdzenia kręgowego myszy E12.5 wykazują ekspresję p75NTR w 0 dniu in vitro (0div) oraz w 2 dniu in vitro (2div). Komórki utrwalono 4% paraformaldehydem, a następnie zabarwiono na p75NTR zgodnie ze standardowymi procedurami. Komórki poddano przeciwbarwieniu barwnikiem Hoechst w celu wizualizacji wszystkich jąder. C: Wzbogacone neurony ruchowe po 5 dniach in vitro (5div) na podłożach hodowlanych PORN-H i lamininie, w obecności CNTF, zabarwione na β-III-tubulinę. Należy zauważyć, że komórki wykształciły długie neuryty i wykazują typową morfologię neuronów ruchowych z jednym dłuższym (rozgałęzionym) wypustkiem i jednym lub więcej krótszych wypustków (aksonami i dendrytami). Skróty: MN: neuron ruchowy; div: dni in vitro.
| Po dysocjacji bez wstępnego wysiewu z wykorzystaniem lektyny | |||
| Całkowita liczba komórek/SC | Komórki dodatnie z błękitem trypanu [%] | Komórki dodatnie z Islet-1/2 [%] | |
| 1 | 995.0 | 13,1 | 9,5 |
| 2 | 889.4 | 8,0 | 10,0 |
| 3 | 1.180.0 | 11,0 | 10,8 |
| Średnia ± SD | 1.021.0 ± 147.1 | 10,7 ± 2,6 | 10,1 ± 0,7 |
| Z wstępnym wysiewem z wykorzystaniem lektyny | |||
| Liczba komórek po wstępnym wysiewie/SC | Komórki dodatnie z błękitem trypanu [%] | Komórki dodatnie z Islet-1/2 [%] | |
| 1 | 189.6 | 9,9 | 70,5 |
| 2 | 168.8 | 3,7 | 76,1 |
| 3 | 125.0 | 0,0 | 72,5 |
| Średnia ± SD | 161.1 ± 33.0 | 4,5 ± 5,0 | 73,0 ± 2,8 |
Tabela 1. Podsumowanie reprezentatywnych procedur izolacji embrionalnych motoneuronów myszy z etapu E12.5. Wyniki z 3 różnych procedur izolacji opracowanych specjalnie w tym celu przedstawiono jako liczby całkowite lub wartości procentowe ± SD. Skróty: SC: rdzeń kręgowy; SD: odchylenie standardowe.
| Komórki Islet-1/2 dodatnie po selekcji p75 [%] | Komórki Islet-1/2 dodatnie po selekcji z użyciem lektyny [%] |
| 92,0 ± 3,5 1 | 73,0 ± 2,8 |
Tabela 2. Porównanie liczby neuronów ruchowych wyselekcjonowanych metodą panningu z użyciem lektyn oraz p751. Wyniki przedstawiono jako wartości procentowe ± SD.
Dyskusja
Zaletą tej techniki wstępnego wysiewu opartego na lektynach jest to, że jest ona mniej kosztowna niż procedura panningu oparta na p75NTR, a lektyna jest bardziej stabilna niż przeciwciała. Wzbogacenie przedstawione na Rys. 2 i w Tab. 1 wykazuje, że procedura ta pozwala na puryfikację podobnej liczby komórek i że większość z nich wykazuje ekspresję markera motoneuronów Islet-1/2. Najbardziej krytycznym etapem jest procedura izolacji rdzenia kręgowego z odcinka lędźwiowego. Usunięcie opon mózgowo-rdzeniowych oraz zwojów korzeni grzbietowych (DRGs) (Rys. 2) jest niezbędne do przeprowadzenia kolejnej procedury puryfikacji poprzez wstępny wysiew oparty na lektynach. Jeśli etap ten zostanie wykonany prawidłowo, prawie wszystkie komórki wykazują ekspresję p75NTR (reprezentatywny obraz przedstawiono na Rys. 3a). Przyczyną różnicy między ekspresją Islet-1/2 a p75NTR jest najprawdopodobniej fakt, że motoneurony lędźwiowe wykazują zróżnicowany, wysoki lub niski poziom ekspresji Islet-1/210. W przypadku niskiego poziomu ekspresji Islet-1/2 mogło to umknąć naszej uwadze podczas barwienia immunocytochemicznego i późniejszego liczenia, ponieważ stosowaliśmy rygorystyczne kryteria rozróżniania komórek pozytywnych od negatywnych (Tab. 1). Dodatkowo Tablica 1 wyraźnie pokazuje, że izolowane komórki przeżywają procedurę w stanie zdrowym, gdyż występuje tylko kilka komórek pozytywnych z błękitem trypanu, co wskazywałoby na nieodwracalne uszkodzenie komórek. Ta alternatywna procedura pozwala również na izolację motoneuronów z pojedynczych embrionów, a tym samym z miotów myszy embrionalnych o mieszanym genotypie. Podsumowując, ta alternatywa dla procedury panningu z przeciwciałem p75NTR6 posiada podobne, jeśli nie identyczne możliwości w zakresie potencjalnych zastosowań i stanowi tanią oraz wydajną, alternatywną metodę puryfikacji embrionalnych motoneuronów myszy.
Oświadczenia
Nie zgłoszono konfliktów interesów.
Podziękowania
Dziękujemy Sandrze Bargen za doskonałe wsparcie techniczne. Praca ta była wspierana przez Wydział Badań nad Białkami (PRD, TP A1.2 (R.C. i T.S.)) oraz Fundusz Badawczy RUB, Rektoratsprogramme – wissenschaftlicher Nachwuchs (A.K.). Przeciwciała monoklonalne 39.4D5 i F55A10 zostały pozyskane z Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB, Iowa city, IA).
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Hydrobromek poli-DL-ornityny | Sigma-Aldrich | P8638 | |
| Laminina | Invitrogen | 23017-015 | |
| HBSS | GIBCO, by Life Technologies | 14170 | |
| Szklane szkiełka zakrywkowe | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 10 lub 14 mm | |
| Lektyna | Sigma-Aldrich | L5142 | |
| Szalka do hodowli komórkowej | Nalge Nunc international | 150350 | powierzchnia Nunclon delta |
| Surowica konia | Linaris | SHD3250ZK | Każda partia musi zostać przetestowana pod kątem hodowli MN |
| Suplement B27 | GIBCO, by Life Technologies | 17504-044 | |
| Glutamax | GIBCO, by Life Technologies | 35050-038 | |
| CNTF | Sigma-Aldrich | N0513 | |
| BSA | Applichem | A1391 | |
| Neurobasal | GIBCO, by Life Technologies | 21103-041 | |
| Pinceta | Stal nierdzewna, rozmiar 4 lub 5 | ||
| Trypsyna | Worthington Biochemical | LS003707 | |
| Inhibitor trypsyny | Sigma-Aldrich | T6522 | |
| Przeciwciało Anti-Islet-1 | DSHB | 39.4D5 | Nadsącz z hodowli komórkowej |
| Przeciwciało Anti-Nkx6.1 | DSHB | F55A10 | Nadsącz z hodowli komórkowej |
| Przeciwciało Anti-p75NTR | Abcam | Ab8874 | |
| Tabela 3. Tabela specyficznych odczynników i sprzętu. |
Bibliografia
- Vallstedt, A. Different levels of repressor activity assign redundant and specific roles to Nkx6 genes in motor neuron and interneuron specification. Neuron. 31, 743-755 (2001).
- Tsuchida, T. Topographic organization of embryonic motor neurons defined by expression of LIM homeobox genes. Cell. 79, 957-970 (1994).
- Lin, J. H. Functionally related motor neuron pool and muscle sensory afferent subtypes defined by coordinate ETS gene expression. Cell. 95, 393-407 (1998).
- Wiese, S., Beck, M., Karch, C., Sendtner, M. Signalling mechanisms for survival of lesioned motoneurons. Acta Neurochir. , 21-35 (2004).
- Gavins, F. N., Chatterjee, B. E. Intravital microscopy for the study of mouse microcirculation in anti-inflammatory drug research: focus on the mesentery and cremaster preparations. J. Pharmacol. Toxicol. Methods. 49, 1-14 (2004).
- Bullen, A. Microscopic imaging techniques for drug discovery. Nat. Rev. Drug Discov. 7, 54-67 (2008).
- Hazelwood, K. L. Entering the Portal: Understanding the Digital Image Recorded Through a Microscope. Imaging Cellular and Molecular Biological Functions. , 3-43 (2007).
- Hickey, M. J. L-selectin facilitates emigration and extravascular locomotion of leukocytes during acute inflammatory responses in vivo. J. Immunol. 165, 7164-7170 (2000).
- Cara, D. C., Kubes, P. Intravital microscopy as a tool for studying recruitment and chemotaxis. Methods Mol. Biol. 239, 123-132 (2004).
- Liu, L. LSP1 is an endothelial gatekeeper of leukocyte transendothelial migration. J. Exp. Med. 201, 409-418 (2005).
- Heit, B. PI3K accelerates, but is not required for, neutrophil chemotaxis to fMLP. J. Cell Sci. 121, 205-214 (2008).
Przedruki i uprawnienia
