Metoda Ice-Cap pozwala na hodowlę roślin w płytkach 96-dołkowych oraz niedestrukcyjne pobieranie tkanki korzenia z każdej siewki. DNA wyekstrahowane z tej tkanki korzenia może być wykorzystane w reakcjach genotypowania. Stwierdziliśmy, że metoda Ice-Cap sprawdza się w przypadku siewek Arabidopsis thaliana, pomidora oraz ryżu.
Artykuł metodologiczny
Ice-Cap: Metoda hodowli roślin Arabidopsis oraz pomidora w płytkach 96-dołkowych do genotypowania wysokoprzepustowego
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Wśród naukowców zajmujących się roślinami coraz powszechniejsze staje się opracowywanie projektów wymagających genotypowania ogromnej liczby roślin. Pierwszym krokiem w każdym projekcie genotypowania jest pobranie próbki tkanki z każdej pojedynczej rośliny. Tradycyjne podejście do tego zadania polega na pobieraniu próbek z roślin jedna po drugiej. Jeśli jednak celem jest genotypowanie setek lub tysięcy osobników, zastosowanie tej strategii prowadzi do powstania znacznego wąskiego gardła w procesie genotypowania. Opisana tutaj metoda Ice-Cap stanowi rozwiązanie o wysokiej przepustowości dla tego problemu, umożliwiając jednemu naukowcowi pobranie tkanki z kilku tysięcy siewek w ciągu jednego dnia 1,2. Taki poziom przepustowości jest możliwy dzięki temu, że tkanka jest pobierana z 96 roślin jednocześnie, a nie pojedynczo.
Metoda Ice-Cap stanowi zintegrowaną platformę do prowadzenia hodowli siewek, poboru tkanek i ekstrakcji DNA. Podstawą metody Ice-Cap jest hodowla siewek w zestawieniu dwóch ułożonych jedna na drugiej płytek 96-dołkowych. Dołki górnej płytki zawierają wkładki z pożywki agarowej, na których kiełkują poszczególne siewki. Korzenie rosną w dół przez podłoże agarowe, opuszczają górną płytkę przez otwór i przechodzą do dolnej płytki zawierającej wodę. Aby pobrać tkankę do ekstrakcji DNA, wodę w dolnej płytce zawierającej tkankę korzeniową gwałtownie zamraża się, podczas gdy siewki w górnej płytce pozostają w temperaturze pokojowej. Następnie górna płytka jest oddzielana od dolnej, co pozwala uzyskać jedną płytkę z 96 zamrożonymi w lodzie próbkami tkanki korzeniowej oraz jedną płytkę z 96 żywymi siewkami. Technikę nazwano „Ice-Cap”, ponieważ wykorzystuje ona lód do przechwycenia tkanki korzeniowej. Płytka 96-dołkowa z siewkami może zostać następnie owinięta folią i przeniesiona do niskiej temperatury. Proces ten wstrzymuje dalszy wzrost siewek, ale nie wpływa na ich żywotność. Po zakończeniu analizy genotypu siewki o pożądanym genotypie mogą zostać przeniesione z płytki 96-dołkowej do gleby w celu dalszej propagacji. Wykazaliśmy użyteczność metody Ice-Cap na przykładzie siewek Arabidopsis thaliana, pomidora i ryżu. Przewidujemy, że metoda ta powinna być możliwa do zastosowania również u innych gatunków roślin o nasionach na tyle małych, aby zmieściły się w dołkach płytek 96-dołkowych.
Protokół
1. Przygotowanie płytek z siewkami typu Ice-Cap z pożywką agarową
Roztopioną pożywkę wzrostową (0,5X podstawowa mieszanka soli Murashige and Skoog (MS), 2 mM kwas morfolinoetanosulfonowy (MES), 0,6% agaru (w/v), pH 5,7) rozlewa się do autoklawowanych płytek do siewek (Seedling Plates) przy użyciu dyspensera do mikropłytek MicroFill Microplate Dispenser. Jeden litr pożywki jest potrzebny na 18 płytek do siewek.
- Przygotować pożywkę w jednolitrowych szklanych butelkach z nakrętkami i autoklawować przez 20 minut.
- Autoklawować jeden litr wody destylowanej w szklanej butelce z nakrętką. Jednocześnie autoklawować puste płytki do siewek (Seedling Plates) owinięte w folię aluminiową.
- Przenieść autoklawowaną pożywkę i wodę do inkubatora ustawionego na 65°C. Temperatura ta pozwoli utrzymać pożywkę w stanie płynnym.
- Po autoklawowaniu wyjąć płytki do siewek z folii i umieścić je w komorze z laminarnym przepływem powietrza w celu osuszenia. Płytki muszą być całkowicie suche przed dalszymi etapami, aby klejąca taśma pakowa mogła całkowicie uszczelnić otwory w dnie dołków płytek.
- Przetrzeć blat laboratoryjny 95% etanolem w celu dezynfekcji.
- Namoczyć przezroczyste plastikowe pokrywki do płytek do siewek w 95% etanole w celu dezynfekcji. Wyjąć pokrywki z etanolu i pozostawić do wyschnięcia w komorze z laminarnym przepływem powietrza. Nie sterylizować plastikowych pokrywek w autoklawie, ponieważ ulegną one stopieniu.
- Nakleić taśmę pakową na dno każdej płytki do siewek i mocno docisnąć za pomocą wałka.
- Umieścić butelki z płynną pożywką i sterylną wodą w łaźni wodnej ustawionej na 65°C.
- Podłączyć do urządzenia MicroFill butelkę zawierającą 70% etanol w temperaturze pokojowej i uruchomić cykl płukania dwukrotnie, aby zdezynfekować układ hydrauliczny urządzenia MicroFill.
- Podłączyć do urządzenia MicroFill butelkę ze sterylną wodą. Uruchomić cykl płukania sześć razy, aby ogrzać układ hydrauliczny i usunąć etanol z systemu. Butelka z wodą powinna pozostawać w łaźni 65°C przez cały czas trwania tej procedury.
- Po zakończeniu płukania sterylną wodą niezwłocznie podłączyć do urządzenia MicroFill butelkę z płynną pożywką. Uruchomić cykl płukania dwukrotnie, aby usunąć wodę destylowaną z układu hydraulicznego. Butelka z pożywką powinna pozostawać w łaźni 65°C przez cały czas trwania tej procedury.
- Rozdać 450 µL pożywki do dołków każdej płytki do siewek. Pracować szybko, aby pożywka nie zastygła w układzie hydraulicznym urządzenia MicroFill.
- Po napełnieniu wszystkich płytek do siewek niezwłocznie podłączyć do urządzenia MicroFill butelkę ze sterylną wodą o temperaturze 65°C i uruchomić cykl płukania 12 razy w celu oczyszczenia układu hydraulicznego. Butelka z wodą powinna pozostawać w łaźni 65°C przez cały czas trwania tej procedury.
- W przypadku braku urządzenia MicroFill, płytki do siewek można przygotować ręcznie, pipetując płynny agar do uszczelnionych płytek za pomocą pipety wielokanałowej.
- Sprawdzić dołki każdej płytki do siewek, aby upewnić się, że pożywka nie wyciekła z żadnego z nich. W razie potrzeby do pojedynczych dołków dopipetować ręcznie dodatkową ilość płynnej pożywki.
- Przykryć każdą płytkę przezroczystą plastikową pokrywką i pozwolić pożywce zastygnąć w płytkach do siewek w temperaturze pokojowej. Ułożyć płytki w stosy i owinąć w folię aluminiową przed przechowywaniem w temperaturze 4°C. Przechowywać płytki dnem do góry, aby zapobiec gromadzeniu się wody w dołkach podczas przechowywania.
2. Wysiew nasion do płytek Ice-Cap oraz kiełkowanie siewek
Opisaliśmy wcześniej półautomatyczną metodę wysiewu nasion Arabidopsis do płytek siewnych z wykorzystaniem urządzenia do ładowania nasion (2). Chociaż urządzenie to może być użyteczne dla niektórych partii nasion, stwierdziliśmy, że zmienność wielkości nasion występująca w różnych partiach nasion Arabidopsis ogranicza jego ogólną użyteczność. Jesteśmy w trakcie opracowywania alternatywnej zautomatyzowanej metody wysiewu nasion, jednak obecnie uznaliśmy, że najskuteczniejszą strategią wysiewu nasion do płytek siewnych jest wykonanie tego kroku ręcznie, zgodnie z poniższym opisem.
- Rozsyp suche nasiona na papierze filtrowanym Whatman.
- Nanieś 95% etanol na nasiona w taki sposób, aby wszystkie zostały nim pokryte. Zabieg ten służy do sterylizacji powierzchniowej nasion.
- Pozostaw nasiona do wyschnięcia na powietrzu.
- Przenieś pojedyncze nasiona do dołków płytek do siewek (Seedling Plates), używając zmodyfikowanej jednorazowej szklanej pipety Pasteura. Końcówka pipety Pasteura jest zamykana poprzez opalenie w płomieniu. Powstałą szklaną końcówkę zwilża się, delikatnie dotykając pożywki agarowej, co pozwala na łatwe pobranie pojedynczego nasiona i przeniesienie go na powierzchnię agaru w dołku płytki do siewek. W celu zwiększenia wydajności można również użyć dwustronnej wersji tego narzędzia do siewu nasion.
- Przykryj każdą płytkę do siewek przezroczystą plastikową pokrywką i zabezpiecz chirurgiczną taśmą Micropore. Stos płytek owiń folią aluminiową i przechowuj nasiona Arabidopsis w temperaturze 4°C przez cztery dni w celu stratyfikacji nasion i synchronizacji kiełkowania. Nasiona pomidora należy przechowywać w ciemności w temperaturze 12°C przez cztery dni.
- Umieść płytki do siewek pod światłem fluorescencyjnym w temperaturze od 18° do 20°C, aby zainicjować kiełkowanie.
3. Przeniesienie płytek z siewkami do fontanny z lodową czapą
Po wystawieniu płytek z siewkami na światło przez cztery dni, przenieś płytki z siewkami do fontanny Ice-Cap. W przypadku Arabidopsis siewki pozostawia się zazwyczaj w fontannie Ice Cap od 10 do 14 dni.
- Zmontuj fontannę Ice-Cap, kładąc blachę do pieczenia na specjalnej konstrukcji stelaża umieszczonej w plastikowym pojemniku do przechowywania. Użyj nakrętek poziomujących, aby dostosować poziom blachy. Umieść pompę zanurzeniową w pojemniku i przymocuj wąż wylotowy pompy do boku blachy za pomocą zacisku sprężynowego. Zmontuj fontannę Ice-Cap na półce w pomieszczeniu do wzrostu roślin lub w komorze wzrostowej w taki sposób, aby powierzchnia fontanny Ice-Cap była bezpośrednio oświetlona światłem fluorescencyjnym.
- Napełnij fontannę Ice-Cap mieszaniną wody destylowanej i wody z kranu w proporcji 3:1. Dodawaj wodę do fontanny, aż pompa zanurzeniowa znajdzie się kilka centymetrów poniżej poziomu wody. Zaznacz końcowy poziom wody w plastikowym pojemniku za pomocą taśmy laboratoryjnej i pisaka.
- Przygotuj płytki korzeniowe (Root Plates), dodając jedną stalową kulkę o średnicy 3/32 cala do każdego dołka płytki.
- Kuleczki stalowe można dodawać do płytek korzeniowych za pomocą specjalnie wykonanego urządzenia do dozowania kulek 1. Urządzenie to wykonuje się, nakładając pojedynczy arkusz folii aluminiowej na powierzchnię 96-dołkowej płytki PCR i zaznaczając pisakiem położenie środków każdego dołka na powierzchni folii. Tak zaznaczony arkusz folii kładzie się na dodatkowych 6 arkuszach folii aluminiowej i owija wokół gładkiej powierzchni pokrywki z używanego pudełka z końcówkami do pipety. Następnie za pomocą ostrego narzędzia, np. drewnianego szpikulca, wykonuje się wgłębienie wystarczająco duże, aby pomieścić jedną metalową kulkę w każdej z 96 pozycji. Aby napełnić urządzenie dozujące kulkami, należy wsypać nadmiar metalowych kulek na urządzenie i delikatnie nim potrząsnąć, aby usunąć nadmiar. Następnie płytkę korzeniową umieszcza się nad urządzeniem dozującym, które odwraca się, aby wpuścić jedną kulkę do każdego dołka płytki korzeniowej.
- Do każdego dołka płytki korzeniowej dodaj 340 µL mieszaniny wody destylowanej i wody z kranu w proporcji 3:1, używając maszyny MicroFill. Upewnij się, że stalowe kulki zostały dodane do płytek korzeniowych przed dozowaniem wody.
- Oderwij folię klejącą z dna płytek z siewkami (Seedling Plates) i zdejmij z nich przezroczyste plastikowe pokrywki. Umieść każdą płytkę z siewkami w płytce korzeniowej zawierającej metalową kulkę i wodę, a następnie zabezpiecz obie płytki dwiema elastycznymi gumkami do włosów.
- Umieść ułożone w stosy płytki Ice-Cap w fontannie Ice-Cap. Przezroczystych plastikowych pokrywek nie należy używać, gdy płytki znajdują się w fontannie Ice-Cap. Sprawdź, czy dołek A-01 płytki z siewkami jest wyrównany z dołkiem A-01 płytki korzeniowej.
- Ułożone w stosy płytki z siewkami/korzeniowe powinny pozostać w fontannie Ice-Cap do czasu, aż większość siewek wykształci tkankę korzenia, która wniknęła do płytek korzeniowych. Idealna temperatura wzrostu dla siewek Arabidopsis w fontannie Ice-Cap wynosi ok. 18°C. Poziom wody w blasze do pieczenia powinien być taki, aby woda mogła wpływać do dołków płytek korzeniowych, ale nie na tyle wysoki, by siewki w płytce z siewkami zostały zanurzone. Jeśli poziom wody jest nieprawidłowy, należy zastosować blachę do pieczenia o odpowiedniej głębokości.
- Okresowo dolewaj wody destylowanej do fontanny Ice-Cap, aby utrzymać pierwotny poziom wody. Dodając do fontanny czystą wodę destylowaną, uzupełnisz ciecz utraconą w wyniku parowania bez zmiany składu mineralnego wody w fontannie. Poziom wody w fontannie Ice-Cap należy sprawdzać codziennie.
4. Pobieranie tkanki korzenia
Tkankę korzenia pozyskuje się poprzez zamrożenie wody w płytce korzeniowej (Root Plate), a następnie oddzielenie płytki z siewkami (Seedling Plate) od płytki korzeniowej.
- Dzień przed pobraniem tkanki korzeniowej należy wyjąć ułożone w stosy płytki Ice-Cap z fontanny Ice-Cap (Ice-Cap Fountain).
- Między dołki ułożonych w stosy płytek z siewkami (Seedling) i korzeniami (Root) należy wsunąć trzy drewniane wykałaczki. Zadaniem wykałaczek jest uniesienie wypustek płytek z siewkami ponad dołki płytek z korzeniami w celu przygotowania do procesu zamrażania.
- Ułożone w stosy płytki Ice-Cap z włożonymi wykałaczkami należy pozostawić na noc pod oświetleniem. Inkubacja ta pozwala na lekkie odparowanie cieczy z płytek z korzeniami, co ułatwia późniejsze zamrażanie oraz proces rozdzielania płytek.
- W dniu pobierania tkanek należy przygotować łaźnię mrożącą. Metalowy blok termiczny z 96 dołkami należy umieścić w naczyniu Pyrex z mieszaniną suchego lodu i 95% etanolu. Należy pozwolić blokowi termicznemu wyrównać temperaturę przez ok. 20 minut. Naczynie Pyrex należy postawić na materiale izolacyjnym, np. rękawicy do autoklawu, aby niska temperatura nie uszkodziła blatu laboratoryjnego.
- Ułożone w stosy płytki Ice-Cap z wykałaczkami należy umieścić w schłodzonym bloku termicznym i inkubować przez 5 minut. W tym czasie woda w płytce z korzeniami zamarznie całkowicie. Siewki w płytce z siewkami nie zamarzają podczas tej procedury i pozostają w pełni żywotne.
- Ułożone w stosy płytki Ice-Cap należy wyjąć z bloku termicznego i położyć na blacie laboratoryjnym w temperaturze pokojowej. Z ułożonych płytek należy usunąć gumki recepturki oraz drewniane wykałaczki. Należy mocno nacisnąć górną część płytki z siewkami, aby „rozłupać” płytki. Następnie należy ostrożnie oddzielić płytkę z korzeniami od płytki z siewkami.
- Należy pozwolić wodzie w płytkach z korzeniami odmarznąć w temperaturze pokojowej. Odmrażanie można przyspieszyć, inkubując płytki z korzeniami w bloku termicznym ustawionym na 25°C.
5. Przechowywanie płytki z siewkami w niskiej temperaturze w ciemności
Po pobraniu tkanek płytki z siewkami można przechowywać w ciemności w niskiej temperaturze, co pozwoli zachować ich żywotność do czasu przeprowadzenia analizy genotypowej. Siewki mogą być przechowywane w tych temperaturach przez kilka tygodni bez utraty żywotności.
- Po pobraniu tkanek szczelnie zaklej dolną część płytki z siewkami taśmą klejącą.
- Na wierzch płytki z siewkami nałożyć przezroczystą plastikową pokrywkę i zabezpieczyć ją taśmą micropore.
- Ułożyć kilka płytek z siewkami w stos i owinąć je folią aluminiową.
- W przypadku siewek Arabidopsis płytki należy umieścić w temperaturze 4°C. W przypadku siewek pomidora płytki należy umieścić w temperaturze 12°C. Po zakończeniu genotypowania siewki można wyjąć z inkubacji w niskiej temperaturze i przesadzić do gleby zgodnie z poniższym opisem.
6. Ekstrakcja DNA
DNA odpowiedni do reakcji PCR można łatwo wyekstrahować z próbek tkanki korzenia. Wydatek całkowitego DNA odzyskanego z próbek tkanki korzenia Arabidopsis wynosi średnio ok. 400 ng 2.
- Przed przystąpieniem do procedury ekstrakcji DNA należy upewnić się, że woda w płytkach z korzeniami (Root Plates) całkowicie odmarzła. Należy sprawdzić płytki, aby ustalić, czy w niektórych dołkach znajduje się znacznie mniej wody niż średnio. Do dołków wymagających uzupełnienia należy ręcznie dopipetować wodę destylowaną.
- Za pomocą urządzenia MicroFill należy dodać 25 µL roztworu Tris-EDTA (500 mM Tris, pH 8; 50 mM EDTA, pH 8) do każdego dołka płytek z korzeniami.
- Dołki płytek z korzeniami należy zamknąć za pomocą folii termicznej i zgrzewarki termicznej.
- Zapieczętowane płytki z korzeniami należy umieścić w urządzeniu GenoGrinder zamkniętą stroną do dołu. Taka orientacja płytki zapewnia optymalny ruch kulek i zapobiega ich przywieraniu do dołków. Płytki należy wstrząsać w urządzeniu GenoGrinder przez 3 ½ minuty przy prędkości 1350 uderzeń na minutę.
- Płytki należy przenieść do wirówki z adapterami do mikropłytek i wirować przez 10 minut przy 3500 RPM w temperaturze 4°C, aby sfragmentaryzowana tkanka korzenia utworzyła osad.
- Otrzymany rozcieńczony ekstrakt zawiera genomiczne DNA, które można bezpośrednio wykorzystać w reakcjach PCR. Zazwyczaj do reakcji PCR dodaje się 2 µL tego ekstraktu DNA.
- W celu przechowywania próbek DNA należy zabezpieczyć mikropłytkę za pomocą klejącej taśmy pakowej i umieścić w temperaturze -20°C. Próbki DNA mogą być przechowywane przez kilka miesięcy bez widocznego pogorszenia jakości.
7. Przeniesienie siewek o pożądanym genotypie do gleby
Po zakończeniu analizy genotypowej siewki o pożądanym genotypie mogą zostać przeniesione z płytek do siewek do gleby.
- Wyjmij płytki z siewkami z chłodni i przygotuj doniczki z nasyconą wodą mieszanką glebową.
- Aby wyjąć pojedynczą siewkę z płytki, użyj pęsety, która pozwala uchwycić czop agarowy bez zmiażdżenia rośliny. Chwyć czop agarowy pęsetą i delikatnie wysuń go z płytki, uważając, aby nie uszkodzić siewki. Alternatywnie można użyć sprężonego powietrza, aby delikatnie wypchnąć czop agarowy wraz z siewką z dołka. Wywieraj nacisk na mały otwór w dnie dołka, aż czop wypadnie na blat laboratoryjny.
- Wykonaj w glebie mały otwór o rozmiarze czopa agarowego. Umieść czop w glebie i ugnieć wokół niego wilgotną ziemię, aby unieruchomić siewkę. Nie próbuj usuwać agaru z otoczenia siewki.
- Umieść przesadzone siewki w pomieszczeniu do uprawy w standardowych warunkach wzrostu. Przez pierwsze dwa dni po przesadzeniu przykryj doniczkę plastikową pokrywką. Następnie zdejmij pokrywkę i kontynuuj uprawę roślin w standardowych warunkach.
8. Reprezentatywne wyniki:
Przykład siewek Arabidopsis wyhodowanych przy użyciu systemu Ice-Cap przedstawiono na rysunku 4A. W momencie wykonania zdjęcia siewki te znajdowały się w fontannie Ice-Cap przez dwa tygodnie i były gotowe do zbioru tkanek. Tkankę korzenia tych samych siewek przedstawiono na rysunku 4B. Całkowita ilość DNA wyekstrahowanego z jednej próbki tkanki korzenia Arabidopsis mieści się zazwyczaj w zakresie od 100 ng do 700 ng 2. Obliczenie wydajności oparto na użyciu tylko jednej części surowego ekstraktu z korzenia. Ponieważ do procesu ekstrakcji DNA zazwyczaj wykorzystuje się jedynie około 10% surowego ekstraktu z korzenia, możliwe jest uzyskanie znacznie większej ilości DNA genomowego do dalszych analiz poprzez zachowanie większej części surowego ekstraktu. Całkowita ilość DNA genomowego uzyskanego za pomocą procedury Ice-Cap jest wystarczająca do przeprowadzenia setek reakcji PCR 2.
Rysunek 1: Schemat procesu Ice-Cap. A) Płytka z siewkami zawierająca pożywkę agarową, na której kiełkują siewki. Korzenie penetrują agar i rosną w dół w stronę dna płytki. Otwory w dnach dołków płytki są uszczelnione folią przylepną. B) Płytka z siewkami jest ustawiona na płytce korzeniowej zawierającej wodę i metalową kulkę. Korzenie przechodzą przez otwory w dnach dołków płytki z siewkami i wrastają do dołków płytki korzeniowej. C) Drewniane wykałaczki są wkładane pomiędzy płytkę z siewkami a płytkę korzeniową w dniu poprzedzającym umieszczenie zestawu płytek Ice-Cap w termobloku w kąpieli z suchego lodu i etanolu. D) Po całkowitym zamarznięciu wody w płytce korzeniowej, płytka z siewkami jest oddzielana od płytki korzeniowej, co pozwala na uzyskanie płytki korzeniowej z 96 próbkami tkanek oraz płytki z siewkami zawierającej 96 żywych siewek. Drewniane wykałaczki ułatwiają rozdzielenie obu płytek na tym etapie.
Rycina 2: Fotografie płytki do siewek i płytki do korzeni. A) Płytka do siewek i płytka do korzeni przedstawione osobno. B) Płytka do siewek ułożona na płytce do korzeni. W dołkach płytki do korzeni widoczne są stalowe kulki używane do ekstrakcji DNA. Gumki recepturki służą do zabezpieczenia obu płytek razem.
Rycina 3: Fontanna Ice-Cap. Fontanna Ice-Cap służy do utrzymywania stałego poziomu wody dokładnie na wysokości górnej krawędzi otworów w płytkach korzeniowych (Root Plates). Ten system ciągłego nawadniania zapewnia, że woda w otworach płytek korzeniowych nie wyczerpie się w wyniku parowania lub transpiracji. A) Samodzielnie wykonany stelaż podtrzymujący blachę do pieczenia, na której spoczywają ułożone jedna na drugiej płytki Ice-Cap. B) Zbliżenie na jedną z nakrętek 1", która umożliwia precyzyjną regulację poziomu blachy do pieczenia w celu uzyskania jednolitej głębokości wody na całej powierzchni fontanny. C) Na tym obrazie przedstawiono wszystkie części potrzebne do zbudowania samodzielnie wykonanego stelaża dla fontanny Ice-Cap. D) Złożona fontanna Ice-Cap. Zanurzeniowa pompa fontannowa stale tłoczy wodę z dolnego zbiornika na blachę do pieczenia, która spoczywa na szczycie stelaża. Zacisk sprężynowy służy do przymocowania węża do krawędzi blachy do pieczenia.
Rysunek 4: Arabidopsis siewki hodowane przy użyciu procesu Ice-Cap. A) Widok z góry na dwie studzienki płytki do siewek. Każda studzienka zawiera siewkę Arabidopsis. B) Widok z boku dwóch studzienek płytki do korzeni. Widoczne są korzenie owijające się wokół wewnętrznej powierzchni studzienek. Siewki na tym zdjęciu znajdowały się w fontannie Ice-Cap przez ok. dwa tygodnie i są na etapie wzrostu, w którym normalnie przeprowadza się zbiór tkanek.
Dyskusja
Przedstawiona tutaj metoda Ice-Cap umożliwia jednemu naukowcowi pobranie próbek tkanek z setek, a nawet tysięcy poszczególnych roślin w ciągu jednego dnia oraz wydajną ekstrakcję genomicznego DNA z tych próbek do wykorzystania w reakcjach genotypowania. Dzięki zapewnieniu badaczowi możliwości genotypowania tysięcy siewek w krótkim czasie, metoda Ice-Cap ma potencjał do usprawnienia wielu eksperymentów genetycznych, których przeprowadzenie w inny sposób nie byłoby praktyczne. Poniżej przedstawiono kilka przykładów.
- Mapowanie genetyczne. Precyzyjne mapowanie genetyczne może zostać przyspieszone, jeśli badacz jest w stanie zidentyfikować zdarzenia rekombinacji w określonym przedziale wzdłuż chromosomu 3. Jeśli przedział ten obejmuje bardzo krótką odległość genetyczną, zdarzenia rekombinacji będą stosunkowo rzadkie w segregującej populacji mapowania. Z tego powodu konieczne może być przesiewanie tysięcy pojedynczych roślin w celu znalezienia pożądanych osobników rekombinantów. Proces ten mógłby zostać znacznie przyspieszony dzięki zastosowaniu Ice-Cap. Nawet w erze re-sekwencjonowania całego genomu wciąż niezbędne jest bezpośrednie wykazanie, że dana mutacja jest bezpośrednio odpowiedzialna za interesujący fenotyp. W takich przypadkach konieczne będzie odseparowanie interesującej mutacji od innych ściśle powiązanych mutacji, aby udowodnić, że mutacja kandydacka jest rzeczywiście przyczynowa. W takich sytuacjach Ice-Cap zapewniłby wydajną metodę rozbijania sprzężenia między parą ściśle powiązanych mutacji.
- Wielokrotne mutanty. Powszechną praktyką wśród badaczy studiujących Arabidopsis stało się łączenie alleli mutantów z kilku różnych loci w jednym osobniku w celu przezwyciężenia redundancji funkcjonalnej 4-6. Jako przykład rozważmy przypadek, w którym chcemy połączyć allele mutantów z czterech różnych loci w jednej roślinie poprzez krzyżowanie genetyczne. W ramach schematu krzyżowania konieczne będzie wygenerowanie osobnika heterozygotycznego w tych czterech loci. Gdy ten czterokrotny heterozygota zawiąże nasiona, oczekuje się, że czterokrotny homozygota pojawi się z częstotliwością jeden na 256 w powstałej populacji potomstwa. Przesiewanie w poszukiwaniu tego rzadkiego osobnika metodami tradycyjnymi byłoby bardzo pracochłonne. W porównaniu z tym, zastosowanie Ice-Cap w tym projekcie zapewniłoby naukowcowi wydajną strategię identyfikacji rzadkiego czterokrotnego homozygota w jednym pokoleniu.
- iTILLING. Nasze laboratorium opisało niedawno nowatorskie podejście do przesiewania obecności indukowanych mutacji w interesujących genach u Arabidopsis 7. Metoda ta jest wariantem uznanej techniki zwanej TILLING, która służy do wyszukiwania mutacji w uporządkowanych populacjach osobników poddanych działaniu mutagenu chemicznego 8-10. Nazwaliśmy naszą metodę iTILLING, ponieważ jest to zindywidualizowana wersja TILLING, która pozwala pojedynczemu naukowcowi osiągnąć cel, który tradycyjnie wymagał zaangażowania dużego zespołu badawczego. Ice-Cap stanowi integralną część metody iTILLING 7, zgodnie z poniższym opisem.
Idea iTILLING polega na wytworzeniu efemerycznej populacji mutantów, co stanowi przeciwieństwo trwałych populacji mutantów tworzonych w tradycyjnych projektach TILLING. W przypadku iTILLING nasiona z zbiorczej populacji M2 wysiewa się do 50–100 bloków Ice Cap, a DNA ekstrahuje metodą Ice-Cap. Siewki Arabidopsis umieszcza się następnie w temperaturze 4°C, podczas gdy przesiewanie mutacji przeprowadza się z wykorzystaniem preparatów DNA Ice-Cap. Siewki pomidora przechowuje się w temperaturze 12°C. Po zidentyfikowaniu siewek niosących pożądane mutacje, są one odzyskiwane z płytek Ice-Cap i przesadzane do gleby. iTILLING nie ma na celu dostarczenia długotrwałej populacji mutantów do przesiewania przez całą społeczność badawczą. Zamiast tego iTILLING oferuje strategię, dzięki której jeden naukowiec może szybko, wydajnie i przy stosunkowo niskim koszcie przesiewać spersonalizowaną populację mutantów pod kątem mutacji w kilku genach.
Stwierdziliśmy, że metoda Ice-Cap jest skutecznym sposobem hodowli i genotypowania Arabidopsis, pomidora oraz ryżu. Przewidujemy, że inne gatunki roślin również powinny być podatne na zastosowanie metody Ice-Cap. Jednym z ograniczeń w zakresie różnorodności gatunków, które można objąć metodą Ice-Cap, jest wielkość nasion. W obecnej konfiguracji Ice-Cap będzie kompatybilna jedynie z roślinami o nasionach na tyle małych, aby zmieściły się w dołkach płytki 96-dołkowej.
Oświadczenia
Nie zgłoszono żadnych konfliktów interesów.
Podziękowania
Praca ta została sfinansowana z grantu przyznanego przez National Science Foundation (numer grantu MCB-0447750).
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| GenoGrinder | Spex/CertiPrep, Metuchen, NJ | 2000 Geno/Grinder | Urządzenie do wstrząsania płytek z korzeniami w celu ekstrakcji DNA |
| Zgrzewarka ABgene Thermo-Sealer | ABgene Limited | AB-0384 | Ręczna zgrzewarka termiczna stosowana do płytek z korzeniami przed rozbiciem tkanek |
| Wirówka wyposażona w mikroplatecie z koszykami z kątem nachylenia | Beckman Coulter Inc. | Allegra 25R | Odpowiednia będzie każda wirówka z mikroplatecetami z koszykami z kątem nachylenia |
| Dozownik do mikropłytek MicroFill | BioTek | AF1000A | Zautomatyzowany dozownik cieczy do napełniania mikropłytek |
| Komercyjna duża blacha do pieczenia marki Bialetti 17x11 cali | Dom Towarowy Target | www.bialetti.com | Ta konkretna blacha do pieczenia ma idealną głębokość dla układu Ice-Cap |
| Metalowy stelaż wykonany na zamówienie | Sklep sprzętowy | Pełny opis znajduje się w tekście | |
| Plastikowy pojemnik do przechowywania o pojemności 33 litrów | Dom Towarowy Target | Marka Sterilite | Do fontanny Ice-Cap. Plastikowy pojemnik do przechowywania wystarczająco duży, aby pomieścić blachę do pieczenia 17x11 cali |
| Pompa fontannowa o wydajności 30 galonów na godzinę | Sunterra | 104506 | Mała zanurzalna pompa fontannowa dostępna w sklepach z artykułami ogrodniczymi |
| Wąż do pompy fontannowej | Dowolny dostawca | Wąż kompatybilny z pompą fontannową | |
| Zacisk plastikowy | Sklep sprzętowy | Zacisk do przymocowania węża do blachy do pieczenia | |
| Przezroczyste plastikowe pokrywki z polistyrenowych płytek Falcon Microtest 96-dołkowych z płaskim dnem | BD Biosciences | 351172 | Przezroczyste plastikowe pokrywki do przykrywania płytek z siewkami Ice-Cap |
| Taśma chirurgiczna 3M Micropore | Fisher Scientific | 19-027-761 | |
| Stalowe kulki o średnicy 3/32 cala | Hartford Technologies, Rocky Hill, CT | 034-006-1K | Stosowane do rozbijania tkanki korzeniowej po zbiorze |
| Elastyczne gumki do włosów 3 cali | Lokalny sklep spożywczy | Stosowane do mocowania płytki z korzeniami do płytki z siewkami | |
| Drewniane szpikulce o średnicy 4 mm | Lokalny sklep spożywczy | Szikulce te są zazwyczaj używane do przygotowywania szaszłyków | |
| Płytki filtrujące 1-mL bez frity marki Nunc firmy Fisher Scientific | Fisher Scientific | 278012 | 96-dołkowe płytki z siewkami z otworami w dnie |
| 96-dołkowa płytka PCR z wysokimi ściankami Fisherbrand | Fisher Scientific | 14-230-242 | 96-dołkowe płytki z korzeniami |
| Agar – testowany pod kątem hodowli komórkowych | Sigma-Aldrich | A1296 | |
| Kwas 4-morfolino–taurosulfonowy (MES) | Sigma-Aldrich | M2933 | |
| Podstawowa mieszanka soli Murashige i Skoog (MS) | Sigma-Aldrich | M-5524 | |
| Folia do zgrzewania termicznego Easy Peel | ABgene Limited | AB-0745 | Folia do zgrzewania termicznego stosowana do uszczelniania płytek z korzeniami przed rozbiciem tkanek |
| Szeroka taśma pakowa marki Duck Brand, 3.00" x 54.6 yd | Office Max | Item no. 21242139 | Taśma klejąca do uszczelniania mikropłytek zawierających ekstrakty DNA do przechowywania |
| Wałek do uszczelniania | Bio-Rad | MSR-0001 | Ręczne narzędzie wałkowe do dociskania klejącej taśmy uszczelniającej do mikropłytek |
| 96-dołkowy metalowy blok termiczny | Cole-Parmer | 36400-66 | Stosowany do zamrażania płytek z korzeniami w celu zbioru tkanek |
| Papier filtracyjny Whatman | Whatman, GE Healthcare | 1002 090 | Stosowany do sterylizacji powierzchniowej nasion |
| Jednorazowa pipeta Pasteura | Fisher Scientific | 13-678-6A | Jednorazowa pipeta Pasteura 5 ¾" stosowana do przenoszenia nasion do płytki z siewkami |
| Naczynie żaroodporne Pyrex (20 cm x 30 cm) | Dom Towarowy Target | Stosowane do przygotowania kąpieli z suchego lodu i etanolu | |
Bibliografia
- Clark, K. A., Krysan, P. J. Protocol: An improved high-throughput method for generating tissue samples in 96-well format for plant genotyping (Ice-Cap 2.0). Plant Methods. 3, 8-8 (2007).
- Krysan, P. I. ce-cap A high-throughput method for capturing plant tissue samples for genotype analysis. Plant Physiol. 135, 1162-1169 (2004).
- Jander, G. Arabidopsis map-based cloning in the post-genome era. Plant Physiol. 129, 440-450 (2002).
- Liljegren, S. J. SHATTERPROOF MADS-box genes control seed dispersal in Arabidopsis. Nature. 404, 766-770 (2000).
- Buechel, S. Role of A-type ARABIDOPSIS RESPONSE REGULATORS in meristem maintenance and regeneration. Eur. J. Cell. Biol. 89, 279-284 (2010).
- Krysan, P. J., Jester, P. J., Gottwald, J. R., Sussman, M. R. An Arabidopsis mitogen-activated protein kinase kinase kinase gene family encodes essential positive regulators of cytokinesis. Plant Cell. 14, 1109-1120 (2002).
- Bush, S. M., Krysan, P. J. iTILLING: a personalized approach to the identification of induced mutations in Arabidopsis. Plant Physiol. 154, 25-35 (2010).
- Comai, L., Henikoff, S. TILLING: practical single-nucleotide mutation discovery. Plant J. 45, 684-694 (2006).
- Henikoff, S., Till, B. J., Comai, L. TILLING. Traditional mutagenesis meets functional genomics. Plant Physiol. 135, 630-636 (2004).
- McCallum, C. M., Comai, L., Greene, E. A., Henikoff, S. Targeting induced local lesions IN genomes (TILLING) for plant functional genomics. Plant Physiol. 123, 439-442 (2000).
Przedruki i uprawnienia
