Opaska uciskowa przedstawiona w tym artykule została zaprojektowana w celu wywołania miażdżycy w tętnicy szyjnej wspólnej myszy. Dzięki stożkowatemu kształtowi wewnętrznego światła, wszczepiona opaska generuje wyraźnie określone obszary niskiego, wysokiego i oscylacyjnego naprężenia ścinającego, co wywołuje rozwój zmian miażdżycowych o różnych fenotypach zapalnych.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Implantacja mankietu tętnicy szyjnej w celu wywołania miażdżycy indukowanej naprężeniem ścinającym u myszy
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Powszechnie przyjmuje się, że zmiany naprężenia ścinającego w naczyniach krwionośnych wyzwalają ekspresję genów zapalnych w komórkach śródbłonka, co w konsekwencji indukuje miażdżycę (przegląd w 1 i 2). Rola naprężenia ścinającego była szeroko badana in vitro poprzez analizę wpływu dynamiki przepływu na hodowane komórki śródbłonka 1,3,4 oraz in vivo u większych zwierząt i ludzi 1,5,6,7,8. Jednak wysoko odtwarzalne modele zwierzęce na małych organizmach, umożliwiające systematyczne badanie wpływu naprężenia ścinającego na rozwój blaszki miażdżycowej, są rzadkością. Niedawno Nam i wsp. 9 wprowadzili model mysi, w którym podwiązanie odgałęzień tętnicy szyjnej tworzy obszar przepływu niskiego i oscylacyjnego. Chociaż model ten powoduje dysfunkcję śródbłonka i szybkie tworzenie się zmian miażdżycowych u myszy z hiperlipidemią, nie można wykluczyć, że obserwowana odpowiedź zapalna jest, przynajmniej częściowo, konsekwencją uszkodzenia śródbłonka i/lub naczynia w wyniku podwiązania.
Aby uniknąć takich ograniczeń, opracowano mankiet modyfikujący naprężenia ścinające w oparciu o obliczoną dynamikę płynów, którego stożkowaty wewnętrzny prześwit został dobrany tak, aby stworzyć w tętnicy szyjnej wspólnej zdefiniowane obszary niskich, wysokich i oscylacyjnych naprężeń ścinających 10. Zastosowanie tego modelu u myszy z nokautem apolipoproteiny E (ApoE) karmionych dietą typu zachodniego z wysoką zawartością cholesterolu prowadzi do rozwoju zmian naczyniowych powyżej i poniżej mankietu. Ich fenotyp jest skorelowany z regionalną dynamiką przepływu 11, co potwierdzono za pomocą obrazowania metodą rezonansu magnetycznego (MRI) in vivo 12: niskie i laminarne naprężenia ścinające powyżej mankietu powodują powstawanie rozległych blaszek o bardziej podatnym fenotypie, podczas gdy oscylacyjne naprężenia ścinające poniżej mankietu indukują stabilne zmiany miażdżycowe 11. W obszarach wysokich naprężeń ścinających i wysokiego przepływu laminarnego wewnątrz mankietu zazwyczaj nie obserwuje się blaszek miażdżycowych.
Podsumowując, procedura zastosowania mankietu modyfikującego naprężenia ścinające jest niezawodnym podejściem chirurgicznym pozwalającym na wywołanie fenotypowo odmiennych zmian miażdżycowych u myszy z deficytem ApoE.
Protokół
1. Przygotowanie modyfikatora naprężenia ścinającego (mankietu)
- Modyfikator naprężeń ścinających składa się z dwóch podłużnych połówek cylindra z lumenem o kształcie stożka. Półpowłoki wykonane są z termoplastycznego polieteroketonu wytwarzanego w procesie odlewania z tworzyw sztucznych. Odlewy są wysyłane, gdy elementy są wciąż połączone z wlewkiem. W związku z tym, przed użyciem należy odciąć półpowłoki. Każdy odlew zawiera półpowłoki o różnych rozmiarach, w zakresie od 150 μm do 300 μm (najmniejsza średnica wewnętrzna na końcu odpływowym).
- Przygotowanie mankietu powinno być przeprowadzone pod mikroskopem chirurgicznym.
- Przytrzymaj półpowłokę mankietu tępą pęsetą i ostrożnie odetnij ją od odlewu za pomocą ostrego skalpela. Procedura ta pozwoli uzyskać prekursory półpowłok, które wymagają dalszej obróbki.
- Umieść prekursor półpowłoki na równej, antypoślizgowej płytce; unieruchom go tępą pęsetą i przetnij dokładnie wzdłuż preformowanego nacięcia, aby usunąć zamknięty koniec. W ten sposób otrzymasz półpowłokę mankietu gotową do użycia.
- Skontroluj półpowłoki pod mikroskopem i delikatnie usuń wszelkie pozostałe ostre krawędzie. Stożkowaty lumen wewnętrzny jest niezbędny do indukowania różnych wartości naprężeń ścinających wewnątrz, powyżej oraz poniżej zaimplantowanego mankietu. Rowek na powierzchni zewnętrznej półpowłok, biegnący prostopadle do lumenu wewnętrznego, służy jako prowadnica dla nici, która ostatecznie łączy półpowłoki w funkcjonalny mankiet.
- Przechowuj półpowłoki mankietu, podzielone według rozmiarów, w 70% etanolu.
2. Implantacja mankietu wokół prawej tętnicy szyjnej
- Myszy z nokautem genu ApoE powinny mieć około 10 tygodni i wagę co najmniej 20 gramów. Jeśli badaniu ma podlegać rozwój blaszek miażdżycowych przy zastosowaniu diety wysokocholesterolemicznej, zaleca się rozpoczęcie takiej diety typu zachodniego na 4 tygodnie przed implantacją mankietu.
- Cały zabieg chirurgiczny należy przeprowadzić w warunkach co najmniej półsterylnych: należy założyć fartuch chirurgiczny, maskę, czepek oraz sterylne rękawiczki. Narzędzia należy wysterylizować przez 30 sekund w sterylizatorze koralikowym i położyć na sterylnej nieprzezroczystej ściereczce. Uwaga! Narzędzia muszą ostygnąć przed użyciem!
- Myszy należy umieścić w komorze indukcyjnej wypełnionej 3% izofluranem do czasu całkowitego zniesienia czucia. Głębokość znieczulenia należy zweryfikować, badając reakcję na uciśnięcie palca u nogi. Alternatywnie, znieczulenie można przeprowadzić poprzez wstrzyknięcie dootrzewnowe (i.p.) ketaminy (80 mg/kg) i ksylazyny (10 mg/kg) lub innych środków znieczulających zatwierdzonych przez IACUC. W przypadku wstrzyknięcia i.p. mysz należy utrzymać w pozycji grzbietnej i wstrzyknąć środek znieczulający w lewym dolnym kwadrancie brzucha.
- Myszy należy położyć na podgrzewanej płycie chirurgicznej w pozycji grzbietnej. Aby zapobiec wysychaniu oczu, należy zwilżyć je maścią do oczu (np. Bepanthen do oczu i nosa). Przednie i tylne łapy należy rozsunąć i przymocować do płyty taśmą. W przypadku stosowania znieczulenia izofluranem, przepływ gazu znieczulającego (2% izofluranu) musi być dostarczany za pomocą maski dla małych gryzoni.
- Sierść między żuchwą a mostkiem należy usunąć, stosując środek do depilacji (np. Pilca Med) lub precyzyjną golarkę elektryczną (np. Wella Contura). Golenie należy przeprowadzać ostrożnie, aby uniknąć podrażnienia skóry. W przypadku stosowania środka do depilacji, należy odczekać 1-2 min na przeniknięcie przez włosy, a następnie delikatnie przetrzeć skórę do całkowitego usunięcia wszystkich włosów i preparatu.
- Należy przygotować wcześniej sporządzone półpowłoki mankietów w różnych rozmiarach (dwie sztuki każdego rozmiaru) oraz odcinek nici jedwabnej 6-0 o długości 2,5 cm do połączenia półpowłok w miejscu okluzji tętnicy szyjnej.
- Pole operacyjne należy zdezynfekować obfitą ilością Betadinu. Za pomocą ostrych, małych nożyczek należy naciąć skórę i leżącą pod nią powięź szyi, wykonując nacięcie przyśrodkowe o długości 4-5 mm, zaczynając od górnej części mostka (manubrium).
- Należy rozszerzyć otwór, odsunąć na bok prawy gruczoł ślinowy przyuszny i wprowadzić rozieracz chirurgiczny. Następnie należy wykonać rozwarstwienie tępe w głąb, nieco na lewo od tchawicy (z perspektywy chirurga), w miejscu, gdzie prawy mięsień mostkowo-obojczykowo-sutkowy krzyżuje się z prawym mięśniem łopatkowo-gnykowym, aż do zidentyfikowania pulsującej prawej tętnicy szyjnej wspólnej.
- Używając bardzo cienkich pęset kątowych lub zakrzywionych (np. Dumont #5/45), należy wypreparować prawą tętnicę szyjną wspólną, delikatnie usuwając otaczającą ją tkankę łączną. Tętnicę należy oddzielić od nerwu błędnego – białego, nitkowatego obiektu biegnącego bezpośrednio wzdłuż tętnicy – ponieważ krok ten jest niezbędny do całkowitego odsłonięcia naczynia. Należy uważać, aby nie uszkodzić nerwu błędnego ani odgałęzienia lewej żyły szyjnej wewnętrznej, która również znajduje się w bliskim sąsiedztwie tętnicy.
- Aby dobrać odpowiedni rozmiar mankietu, należy porównać średnicę odsłoniętej tętnicy szyjnej z średnicą wewnętrzną półpowłok mankietu: największa szerokość światła mankietu powinna odpowiadać średnicy zewnętrznej tętnicy szyjnej.
- Następnie należy ostrożnie wsunąć końcówkę pęsety pod tętnicę szyjną, otworzyć pęsetę, przełożyć pod tętnicą odcinek nici jedwabnej 6-0 i utworzyć pętlę. Pomiędzy pętlą a tętnicą szyjną należy umieścić jedną półpowłokę mankietu pod tętnicą. Strona o największym zwężeniu musi znajdować się poniżej nurtu przepływu krwi.
- Drugą półpowłokę mankietu należy umieścić w pętli na górze tętnicy szyjnej.
- Za pomocą pęsety chirurgicznej należy delikatnie zaciągnąć pętlę z nici i zawiązać węzeł. W ten sposób powstaje funkcjonalny modyfikator naprężenia ścinającego. Dla precyzyjnego dopasowania mankietu niezbędne jest, aby nić biegła dokładnie wewnątrz prefabrykowanego rowka na zewnętrznej powierzchni mankietu.
- Prawy gruczoł ślinowy przyuszny należy przesunąć z powrotem na miejsce, a następnie zbliżyć i zamknąć skórę, używając niewielkiej ilości nici prolenowej 6-0 lub alternatywnie klamer do ran.
- W celu profilaktycznego leczenia przeciwbólowego należy wstrzyknąć podskórnie pojedynczą dawkę karprofenu (np. Rimadyl) w dawce 5 mg/kg i umieścić mysz w komorze grzewczej do czasu wybudzenia. Zazwyczaj zajmuje to 30-60 min przy znieczuleniu ketaminą/ksylazyną. W przypadku znieczulenia inhalacyjnego izofluranem okres wybudzania jest znacznie krótszy (10-20 min).
- Z naszego doświadczenia wynika, że zwierzęta odzyskują normalną, nieustresowaną aktywność w ciągu pierwszych 24 godzin po implantacji mankietu, jeśli zabieg został wykonany przez doświadczonego chirurga. Jeśli jednak zwierzę wydaje się być w stresie nawet jeden dzień po operacji, należy powtórzyć leczenie przeciwbólowe i skonsultować się z personelem weterynaryjnym.
3. Wypreparowanie mankietu i tętnic szyjnych
- Do analizy histologicznej tętnice szyjne muszą zostać pobrane po zakończeniu okresu obserwacji. Przed rozpoczęciem eksplantacji zwierzę należy uśmiercić zgodnie z wytycznymi IACUC.
- Jeśli połówki mankietów mają zostać użyte ponownie, należy ostrożnie usunąć wszystkie fragmenty tkanek oraz szew łączący z elementów plastikowych, oddzielając je od tętnic szyjnych, a następnie wypłukać i przechowywać połówki w 70% roztworze alkoholu. Należy pamiętać, że po kilku tygodniach implantacji mankiet zostaje wtopiony w zrosty z tkanki łącznej i należy go preparować z ostrożnością, aby nie uszkodzić ścian naczyń.
- Alternatywnie mankiet można eksplantować i zatopić razem z tętnicą szyjną. Materiał plastikowy mankietu jest odporny na standardowe roztwory utrwalające oraz rozpuszczalniki stosowane do zatapiania w parafinie. Próbki zatopione w parafinie można również ciąć za pomocą standardowego mikrotomu wyposażonego w zwykłe noże.
4. Reprezentatywne wyniki
Mankiet musi być zawsze umieszczony wokół jednej z dwóch wspólnych tętnic szyjnych zwierzęcia (Rys. 1A, 1B) – strona przeciwległa służy jako kontrola. Na obrazie przedstawiającym dwie połówki mankietu (Rys. 1B) widoczny jest stożkowaty kształt wewnętrznego światła. Kształt ten jest niezbędny do stworzenia trzech obszarów o odmiennej dynamice przepływu. Typowe wzorce naprężeń ścinających indukowane przez odlew, obliczone na podstawie pomiarów Dopplera 11, oraz odpowiadające im prędkości przepływu oparte na obrazowaniu MR z kontrastem fazowym 12 przedstawiono na Rysunku 2.
W przypadku implantacji mankietu u myszy z nokautem genu ApoE karmionych dietą typu zachodniego, zmieniona dynamika przepływu wywołuje indukowane naprężeniem ścinającym odkładanie się blaszek miażdżycowych (Ryc. 3): powyżej stożkowej zwężenia niski laminarny naprężenie ścinające prowadzi do masowego rozwoju blaszek miażdżycowych o bardziej podatnym fenotypie, charakteryzujących się rdzeniami lipidowymi położonymi blisko centralnego światła i pokrytymi jedynie cienką czapką włóknistą (Ryc. 3A1). Stożkowy kształt wewnętrznego światła mankietu prowadzi do zwiększenia prędkości przepływu. W tym obszarze niemal nie obserwuje się odkładania blaszek. Bezpośrednio poniżej miejsca zwężenia gwałtowne poszerzenie tętnicy skutkuje powstaniem obszaru wirów i oscylacyjnych parametrów przepływu, co powoduje mniej rozległy rozwój blaszek o bardziej stabilnym fenotypie (tj. z mniejszą liczbą rdzeni lipidowych, które są zlokalizowane bliżej błony środkowej).
Rysunek 1. Modyfikator naprężenia ścinającego – montaż i umieszczenie. (A) Schemat wszczepionej mankiety: Mankietę umieszcza się wokół prawej wspólnej tętnicy szyjnej (RCCA) – strona przeciwległa (LCCA = lewa wspólna tętnica szyjna) służy jako kontrola. (B) Angiografia MRI in vivo u myszy: Na obrazie maksymalnej projekcji intensywności trójwymiarowej angiografii MR czasu przelotu (time-of-flight) widoczne jest stożkowate zwężenie wywołane przez odlew (biała strzałka) (szczegóły patrz w 12). (H=głowa, F=stopy, R=prawo, L=lewo). W prawym górnym rogu przedstawiono widok makroskopowy wewnętrznego światła oraz zewnętrznej powierzchni połowek mankiety. Po złożeniu dwie połówki tworzą stożkowy cylinder, który w określony sposób modyfikuje dynamikę przepływu w naczyniu. Aby zapewnić prawidłowe dopasowanie, rowek na zewnętrznej powierzchni mankiety (żółta strzałka) służy jako prowadnica dla szwu łączącego.
Rycina 2. Obszary o różnej dynamice przepływu i naprężeniach ścinających. Implantacja mankietu zmienia dynamikę przepływu, a w konsekwencji naprężenia ścinające w zwężonej tętnicy szyjnej w określony sposób. Na górnej ilustracji schematycznej wskazano różne właściwości przepływu i podano lokalne wartości przybliżone naprężeń ścinających (na podstawie pomiarów dopplerowskich 11). Poniżej przedstawiono odpowiadające im prędkości przepływu dla jednego zwierzęcia, zmierzone za pomocą MRI powyżej zaimplantowanego mankietu, na obrazie MRI przekroju poprzecznego szyi w obrazowaniu T1 (obrazowanie prędkości kontrastem fazowym, szczegóły patrz 12).
Rysunek 3. Rozwój blaszki miażdżycowej indukowany naprężeniem ścinającym u myszy z nokautem genu ApoE. W lewym górnym rogu widoczny jest widok makroskopowy otwartej szyi i odsłoniętych tętnic szyjnych myszy z nokautem ApoE poddanej diecie wysokotłuszczowej (typu zachodniego) 8 tygodni po implantacji modyfikatora naprężenia ścinającego wokół prawej tętnicy szyjnej wspólnej (RCCA). Nieprzezroczysty biały obszar naczynia (*) powyżej mankietu odpowiada miejscu rozległego odkładania blaszki miażdżycowej. Żółta strzałka wskazuje nić łączącą dwie połowy mankietu. W przeciwieństwie do tego, w lewej tętnicy szyjnej wspólnej (LCCA) nie występują oznaki odkładania blaszki.
(A)-(C) Reprezentatywne przekroje prawej tętnicy szyjnej wspólnej myszy z nokautem ApoE poddanej diecie typu zachodniego, barwione HE, 8 tygodni po implantacji mankietu. Schematyczna ilustracja przedstawia odpowiadające im płaszczyzny (linie przerywane), w których znajdowały się przekroje. (A) Powyżej mankietu miażdżyca prowadzi do masywnego odkładania blaszki. Duże rdzenie lipidowe (czerwone strzałki), które częściowo znajdują się blisko centralnego światła (szczegół A1), charakteryzują podatny charakter tych blaszek. (B) Na płaszczyźnie zwężenia mankietu prawie nie widać rozwoju blaszki, natomiast bezpośrednio poniżej mankietu (C) przepływ oscylacyjny prowadzi do umiarkowanego rozwoju blaszki o bardziej stabilnym typie (tj. z mniejszą liczbą rdzeni lipidowych lub ich brakiem). (C1, C2 = połówki mankietu, P = blaszki, gwiazdka = światło naczynia)
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
W celu zminimalizowania zmienności eksperymentalnej zaleca się pracę na zwierzętach w niemal tym samym wieku i o tej samej historii żywieniowej. Niedawno opublikowane badanie wykazuje, że modyfikator naprężenia ścinającego zastosowany u myszy typu dzikiego może być dobrym modelem do badania dysfunkcji śródbłonka i wczesnych odpowiedzi zapalnych indukowanych przez zmienioną dynamikę przepływu 13. Jednak do badania rozwoju blaszki miażdżycowej wymagane są transgeniczne hiperlipidemiczne modele mysie (np. mysz z ...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie zgłaszają żadnych konfliktów interesów.
Podziękowania
Niniejsze badanie było częściowo wspierane przez Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG), projekt GZ PI 771/1-1; SFB 656 „Cardiovascular Molecular Imaging”, Münster, Niemcy (projekty C6, Z2, B3 oraz PM3); EU NoE „Diagnostic Molecular Imaging—DIMI” (WP 11.1 i 11.2). Badanie było również częściowo finansowane przez British Heart Foundation, Wielka Brytania.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Modyfikator naprężeń ścinających (polieteroketon) |  Promolding BV |
Bibliografia
- Chiu, J. J., Chien, S. Effects of disturbed flow on vascular endothelium: pathophysiological basis and clinical perspectives. Physiol. Rev. 91, 327-387 (2011).
- Cunningham, K. S., Gotlieb, A. I. The role of shear stress in the pathogenesis of atherosclerosis. Lab. Invest. 85, 9-23 (2005).
- Ali, F., Zakkar, M., Karu, K., Lidington, E. A., Hamdulay, S. S., Boyle, J. J., Zloh, M., Bauer, A., Haskard, D. O., Evans, P. C., Mason, J. C. Induction of the cytoprotective enzyme heme oxygenase-1 by statins is enhanced in vascular endothelium exposed to laminar shear stress and impaired by disturbed flow. J. Biol. Chem. 284, 18882-18892 (2009).
- Hastings, N. E., Simmers, M. B., McDonald, O. G., Wamhoff, B. R., Blackman, B. R. Atherosclerosis-prone hemodynamics differentially regulates endothelial and smooth muscle cell phenotypes and promotes pro-inflammatory priming. Am. J. Physiol. Cell. Physiol. 293, C1824-C1833 (2007).
- Zheng, J., Abendschein, D. R., Okamoto, R. J., Yang, D., McCommis, K. S., Misselwitz, B., Gropler, R. J., Tang, D. MRI-based biomechanical imaging: initial study on early plaque progression and vessel remodeling. Magn. Reson. Imaging. 27, 1309-1318 (2009).
- Stone, P. H., Coskun, A. U., Kinlay, S., Clark, M. E., Sonka, M., Wahle, A., Ilegbusi, O. J., Yeghiazarians, Y., Popma, J. J., Orav, J., Kuntz, R. E., Feldman, C. L. Effect of endothelial shear stress on the progression of coronary artery disease, vascular remodeling, and in-stent restenosis in humans: in vivo 6-month follow-up study. Circulation. 108, 438-444 (2003).
- Pedersen, E. M., Oyre, S., Agerbaek, M., Kristensen, I. B., Ringgaard, S., Boesiger, P., Paaske, W. P. Distribution of early atherosclerotic lesions in the human abdominal aorta correlates with wall shear stresses measured in vivo. Eur. J. Vasc. Endovasc. Surg. 18, 328-333 (1999).
- Buchanan, J. R., Kleinstreuer, C., Truskey, G. A., Lei, M. Relation between non-uniform hemodynamics and sites of altered permeability and lesion growth at the rabbit aorto-celiac junction. Atherosclerosis. 143, 27-40 (1999).
- Nam, D., Ni, C. W., Rezvan, A., Suo, J., Budzyn, K., Llanos, A., Harrison, D., Giddens, D., Jo, H. Partial carotid ligation is a model of acutely induced disturbed flow, leading to rapid endothelial dysfunction and atherosclerosis. Am. J. Physiol. Heart. Circ. Physiol. 297, 1535-1543 (2009).
- Cheng, C., van Haperen, R., de Waard, M., van Damme, L. C., Tempel, D., Hanemaaijer, L., van Cappellen, G. W., Bos, J., Slager, C. J., Duncker, D. J., van der Steen, A. F., de Crom, R., Krams, R. Shear stress affects the intracellular distribution of eNOS: direct demonstration by a novel in vivo technique. Blood. 106, 3691-3698 (2005).
- Cheng, C., Tempel, D., van Haperen, R., van der Baan, A., Grosveld, F., Daemen, M. J., Krams, R., de Crom, R. Atherosclerotic lesion size and vulnerability are determined by patterns of fluid shear stress. Circulation. 113, 2744-2753 (2006).
- van Bochove, G. S., Straathof, R., Krams, R., Nicolay, K., Strijkers, G. J. MRI-determined carotid artery flow velocities and wall shear stress in a mouse model of vulnerable and stable atherosclerotic plaque. MAGMA. 23, 77-84 (2010).
- Cuhlmann, S., Van der Heiden, K., Saliba, D., Tremoleda, J. L., Khalil, M., Zakkar, M., Chaudhury, H., Luong, L. A., Mason, J. C., Udalova, I., Gsell, W., Jones, H., Haskard, D. O., Krams, R., Evans, P. C. Disturbed Blood Flow Induces RelA Expression via c-Jun N-Terminal Kinase 1: A Novel Mode of NF-{kappa}B Regulation That Promotes Arterial Inflammation. Circ. Res. 108, Forthcoming (2011).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
