Chirurgia stereotaktyczna u gryzoni umożliwia celowane podawanie leków lub stymulację elektryczną i rejestrację sygnałów u czuwających zwierząt podczas wykonywania określonych zachowań. W niniejszej prezentacji wideo zademonstrujemy niedawne udoskonalenia tej ugruntowanej procedury, które skutecznie zwiększyły przeżywalność i zmniejszyły utratę masy ciała po operacji.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Chirurgia stereotaktyczna gryzoni i poprawa dobrostanu zwierząt w neuronauce behawioralnej
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Chirurgia stereotaktyczna służąca do implantacji kaniul w określone obszary mózgu jest od wielu dziesięcioleci bardzo skuteczną techniką eksperymentalną do badania efektów lokalnej manipulacji neurotransmiterami i szlakami sygnalizacyjnymi u zwierząt budzących się i wykazujących określone zachowania. Co więcej, stereotaktyczna implantacja elektrod w badaniach stymulacji i rejestracji elektrofizjologicznej była kluczowa dla naszego obecnego rozumienia neuroplastyczności i sieci mózgowych u zwierząt w trakcie wykonywania zadań behawioralnych. Rosnąca wiedza na temat optymalizacji technik chirurgicznych u gryzoni1-4, świadomość społeczna w kwestii dobrostanu zwierząt oraz rygorystyczne przepisy (np. dyrektywa Unii Europejskiej z 2010 roku w sprawie wykorzystania zwierząt laboratoryjnych5) skłoniły nas do udoskonalenia tych procedur chirurgicznych, w szczególności w zakresie wprowadzenia nowych procedur suplementacji tlenem i ciągłego monitorowania poziomu natlenienia krwi oraz częstości akcji serca podczas operacji, a także wprowadzenia zestandaryzowanego protokołu opieki pooperacyjnej. Nasze obserwacje wskazują, że modyfikacje te doprowadziły do zwiększenia przeżywalności oraz poprawy ogólnego stanu zwierząt po operacji (np. mniejsza utrata masy ciała i większa aktywność zwierząt). Niniejsza prezentacja wideo przedstawi ogólne procedury związane z tym rodzajem chirurgii stereotaktycznej, ze szczególnym uwzględnieniem wprowadzonych przez nas modyfikacji. Zilustrujemy te procedury chirurgiczne na szczurach, jednak możliwe jest wykonanie tego typu zabiegu również u myszy lub innych małych zwierząt laboratoryjnych przy użyciu specjalnych adapterów do aparatu stereotaktycznego6.
Protokół
Uwaga: Przez cały czas trwania procedury należy stosować techniki antyseptyczne. Wszystkie instrumenty i materiały (patyczki z watą, gazy itp.), które będą wykorzystywane podczas operacji, powinny zostać wysterylizowane w autoklawie. Należy nosić maskę chirurgiczną, czepkek oraz sterylne rękawiczki. Obszar roboczy oraz aparat stereotaktyczny powinny zostać dokładnie oczyszczone i zdezynfekowane 70% roztworem etanolu.
1. Procedury przedoperacyjne
- Przygotuj aparat stereotaktyczny oraz wszystkie niezbędne materiały. Podgrzej wcześniej matę grzewczą.
- Umieść kaniulę w uchwycie i sprawdź, czy jest prosta.
- Włącz system gazowy – mieszaninę powietrza atmosferycznego i tlenu (tlen powinien stanowić 30-35% całkowitego przepływu).
- Zważ szczura i podaj środek znieczulający. Stosujemy mieszaninę ketaminy (37,5 mg/kg) i deksmedetomidyny (0,25 mg/kg) podaną podskórnie. Różne protokoły znieczulania opisano u Flecknella.4 oraz Hellebrekers i wsp.7.
- Po utracie przytomności przez szczura, należy ogolić obszar głowy od uszu do miejsca pomiędzy oczami za pomocą maszynki elektrycznej.
- Umieść szczura na podkładce grzewczej, tak aby jego nos znajdował się przed rurką doprowadzającą powietrze. Użyj oksymetru, aby upewnić się, że szczur ma odpowiedni poziom natlenienia krwi (nie powinien on spaść <90%). Należy postępować zgodnie z instrukcjami producenta w celu prawidłowego użytkowania sprzętu.
- Nałóż krem do oczu (Duratears Z, Alcon) na obie rogówki, aby zapobiec ich odwodnieniu.
- Sprawdź odruchy szczura (odruch ogonowy lub odruchy wywołane uciskiem palców, zgodnie z demonstracją Walantusa) i wsp.8), aby upewnić się, że zwierzę jest odpowiednio znieczulone. Jeśli szczur nadal wykazuje silne odruchy, może być konieczne uzupełnienie znieczulenia.
- Jeśli nie występuje odruchy wycofania po ściśnięciu palca stopy, należy umieścić szczura w aparacie stereotaksycznym, wyregulować pręty uszne tak, aby odczyty po obu stronach były jednakowe, a następnie ponownie umieścić rurkę z powietrzem przed zwierzęciem, mocując ją za pomocą pręta nosowego. Ponownie sprawdzić, czy poziom natlenowania krwi szczura wynosi 90% lub więcej. W przeciwnym razie należy przesunąć rurkę bliżej nosa lub zwiększyć przepływ tlenu. Poziom natlenowania krwi oraz częstość akcji serca należy monitorować przez cały czas trwania operacji.
- Stale monitoruj temperaturę szczura za pomocą termometru rektalnego (najlepiej podłączonego do mata grzewczego) i zapisuj wartości na początku oraz na koniec zabiegu. Dostosuj działanie mata grzewczego lub użyj koca, aby utrzymać temperaturę ciała w zakresie od 37,5 do 38.5°C.
2. Operacja
- Wstrzyknij środek przeciwbólowy. Stosujemy jednorazowe podanie okołoperacyjne karprofenu (4,0–5,0 mg/kg, podskórnie). Inne protokoły przeciwbólowe opisano w pracy Hellebrekers. i wsp.7.
- Trzykrotnie oczyść zgoloną powierzchnię skóry, przecierając ją od środka ku obwodowi owłosionemu środkiem dezynfekującym (np. chloreksydyną 0,5%), a następnie wykonaj miejscowe znieczulenie, wstrzykując mieszaninę lidokainy (20 mg/ml) i adrenaliny (5 mg/ml) w celu znieczulenia miejscowego i wywołania skurczu naczyń krwionośnych (aby zapobiec nadmiernemu krwawieniu).
- Wykonaj nacięcie w kierunku przednio-tylnym o długości około 2,5 cm w linii środkowej skóry głowy, prowadząc je od miejsca między oczami aż do okolic za uszami. Użyj 4–6 klamer typu bulldog, aby odsunąć skórę i utrzymać nacięcie w pozycji otwartej. Usuń wszelką tkankę łączną za pomocą szpatułki i/lub patyczków bawełnianych, a następnie oczyść obszar, aby odsłonić powierzchnię czaszki.
- Sprawdzenie, czy głowa jest wypoziomowana: Najpierw należy zlokalizować punkt Lambda i umieścić kaniulę prowadzącą dokładnie nad tym miejscem, tak aby dotykała czaszki. Następnie należy odczytać współrzędną grzbietowo-brzuszną. Potem kaniulę prowadzącą należy umieścić dokładnie nad punktem Bregma, dotykając czaszki, i odczytać odpowiadającą mu współrzędną grzbietowo-brzuszną. Te dwie współrzędne powinny być identyczne. Jeśli różnica wynosi >0,3 mm; dostosować poprzeczkę nosową w celu korekty.
- Za pomocą sterylnego wiertła ręcznego wykonaj dwa małe otwory do mocowania śrub czaszkowych (jeden około 5 mm przed miejscem wprowadzenia kaniuli w jednej z półkul, a drugi 5 mm za miejscem wprowadzenia kaniuli w półkuli przeciwległej). W otwory te wprowadź dwie sterylne śruby, dokręcając je do momentu stabilnego zakotwiczenia, lecz nie wkręcając ich całkowicie w czaszkę.
- Po umieszczeniu kaniuli prowadzącej dokładnie w punkcie Bregma, należy zapisać współrzędne przednio-tylne oraz boczne. Prawidłowe położenie kaniuli prowadzącej dla każdego obszaru mózgu można obliczyć, dodając lub odejmując odpowiednie wartości od punktu Bregma z pomocą atlasu stereotaksycznego.9-11.
- Umieść kaniulę prowadzącą w odpowiednim miejscu, tak aby lekko dotykała czaszki. Zapisz współrzędną grzbietowo-brzuszną. W przypadku obustronnego umieszczenia kaniul, znajdź następnie miejsce na kaniulę w drugiej półkuli i ponownie zapisz współrzędną grzbietowo-brzuszną. Obie współrzędne powinny być identyczne (lub różnić się <0,3 mm).
- Zaznacz miejsca wprowadzenia kaniul na czaszce za pomocą sterylnego ołówka, a następnie za pomocą wiertarki ręcznej wykonaj otwory trepanacyjne, sprawdzając ich wielkość i prawidłowe rozmieszczenie przy użyciu kaniuli prowadzącej. Po wykonaniu otworów użyj sterylnej igły, aby delikatnie przebić oponu mózgowe, umożliwiając swobodne wprowadzenie kaniuli.
- Wprowadź kaniulę do pierwszego otworu i ostrożnie opuść ją, aż osiągnie końcową współrzędną brzuszna. Przygotuj cement stomatologiczny i nanieś go obficie wokół kaniuli oraz jednej lub obu śrub, aby ją unieruchomić. Odczekaj do całkowitego wyschnięcia cementu. Następnie ostrożnie usuń wspornik kaniuli, odchylając pręt grzbietowo-brzuszny do góry.
- Umieść drugą kaniulę w uchwycie i przejdź do miejsca wprowadzenia kaniuli w drugiej półkuli. Wprowadź kaniulę do otworu i powtórz poprzedni krok. Przykryj śruby oraz znaczną powierzchnię kaniul cementem, a przed jego wyschnięciem usuń nadmiar materiału ze skóry.
- Wstrzyknij ciepły (~37°C) sterylna sól fizjologiczna (~10 ml/kg, s.c.) w celu zapewnienia nawodnienia.
- Po całkowitym wyschnięciu cementu należy usunąć wspornik kaniul i włożyć sterylny pin do każdej kaniuli, aby zapobiec ich niedrożności.
- Oczyścić obszar rany sterylnym roztworem soli fizjologicznej i zaszyć przednią oraz tylną część rany.
- Wyjmij zwierzę z aparatu stereotaksycznego, usuwając rurkę doprowadzającą gaz z okolic nosa. Kontynuuj monitorowanie poziomu wysycenia tlenem oraz temperatury ciała.
- W przypadku zastosowania znieczulenia dożylnego z deksmedetomidyną, należy podać jego antagonistę, atipamezol (0,25 mg/kg, s.c.), i odczekać do przebudzenia zwierzęcia (około 5 minut).
- Umieść szczura w klatce regeneracyjnej. Aby uniknąć hipotermii, umieść klatkę w inkubatorze w temperaturze 28°C lub na podgrzewaczu w miejscu, w którym można obserwować zwierzę przez co najmniej jedną godzinę, przed jego powrotem do pomieszczenia zoologicznego.
3. Opieka pooperacyjna
- W ciągu pierwszych 4 dni po operacji należy monitorować rekonwalescencję szczura, prowadząc w dziennikach laboratoryjnych lub „dziennikach dobrostanu zwierząt” codzienne zapisy masy ciała oraz inne obserwacje dotyczące stanu zwierzęcia.
- Zwierzęta wykazujące jawne objawy choroby, infekcji rany, utraty masy ciała lub inne oznaki obniżonego stanu ogólnego muszą otrzymać specjalną opiekę: np. dodatkową dawkę leków przeciwbólowych w celu zminimalizowania bólu pooperacyjnego, mieszankę pokarmu w proszku i wody jako uzupełnienie standardowej karmy w celu pobudzenia apetytu szczura i/lub podskórny zastrzyk z soli fizjologicznej w celu wspomagania nawodnienia.
- Jeśli u szczura nie wystąpi żadna poprawa po tych interwencjach lub jeśli utrata masy ciała jest >15% (w porównaniu do masy ciała przed operacją), uśmiercić zwierzę poprzez podanie przedawki środka znieczulającego (humanitarny punkt końcowy).
- Szczury zazwyczaj wymagają co najmniej 7 dni rekonwalescencji przed rozpoczęciem eksperymentów behawioralnych.
4. Reprezentatywne wyniki
Aby ustalić, czy wprowadzone modyfikacje procedury chirurgicznej, w szczególności w zakresie suplementacji tlenu oraz ciągłego monitorowania poziomu natlenowania krwi, częstości akcji serca i temperatury ciała, zwiększyły przeżywalność zwierząt i poprawiły ich stan ogólny po operacji, porównaliśmy wskaźnik śmiertelności w 20 kohortach zwierząt (po 20 szczurów w każdej), które zostały poddane operacji po wdrożeniu tych modyfikacji, ze wskaźnikiem śmiertelności w 24 kohortach (po 20 szczurów w każdej) operowanych zgodnie ze standardowym protokołem. Jak pokazano na Rysunku 1a, wskaźnik śmiertelności był znacznie niższy w próbie kohort operowanych według zmodyfikowanego protokołu (P < 0,05; test U Manna-Whitneya, dwustronny). Ponadto, jak pokazano na Rysunku 1b, utrata masy ciała po operacji u szczurów operowanych według zmodyfikowanego protokołu była również znacznie mniejsza w porównaniu do szczurów operowanych standardową procedurą (1. doba pooperacyjna: P < 0,05; 2. doba pooperacyjna: P < 0,01; 3. doba pooperacyjna: P = 0,17; testy t Studenta).
Rysunek 1. Wpływ modyfikacji chirurgicznych na wskaźnik śmiertelności oraz pooperacyjną utratę masy ciała. (A.) Wskaźnik śmiertelności szczurów operowanych zgodnie ze zmodyfikowanym protokołem w porównaniu do szczurów operowanych zgodnie z protokołem standardowym. Wskaźnik śmiertelności (mediana ± rozstępy międzykwartylowe) obliczono jako procent szczurów w kohorcie 20 osobników, które nie przeżyły operacji. *p < 0,05, dwustronny test U Manna-Whitneya (n = 20 kohort dla protokołu zmodyfikowanego i 24 kohorty dla protokołu standardowego). (B.) Utrata masy ciała (średnia ± SEM jako procent masy przedoperacyjnej) podczas pierwszego (POD1), drugiego (POD2) i trzeciego (POD3) dnia po operacji. *P < 0,05, **P < 0,01, test t Studenta (n = 60 na grupę).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Głównym celem niniejszej prezentacji wideo jest zapoznanie neurobiologów behawioralnych z podstawowymi zasadami chirurgii stereotaktycznej. Badacze, którzy już przeprowadzają zabiegi stereotaktyczne, mogą również odnieść korzyść z tego materiału i rozważyć wprowadzenie niektórych udoskonaleń proceduralnych we własnych laboratoriach. stale rosnąca wiedza na temat optymalizacji technik chirurgicznych1-3, rozwój nowych środków znieczulających i przeciwbólowych stosowanych w medycynie ludzkiej i weterynaryjnej
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie zgłaszają żadnych konfliktów interesów.
Podziękowania
Autorzy dziękują dr. Peterowi Gerritsowi za rysunki wykorzystane w materiale wideo.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Alkohol 70% | VWR International | ||
| Antisedan (atipamezol) | Orion | ||
| Siarczan atropiny 0,5 | Teva Pharmachemie | ||
| Zacisk hemostatyczny typu bulldog | Aesculap | ||
| Kaniule | Component Supply Co. | ||
| Chlorheksydyna 0,5% | APP Pharmaceuticals | ||
| Proszek czyszczący | Alconox, Inc. | ||
| Patyczki bawełniane | Hartmann BV | ||
| Dexdomitor (deksmedetomidyna) | Orion | ||
| Wiertarka | Dremel | ||
| Duratears Z | Alcon | ||
| Igła Durogrip–zamów converse 130mm | Aesculap | ||
| Nożyczki Durotip precyzyjne, z przestrażeniem, proste/zakrzywione 110 mm | Aesculap | ||
| Gaza | Medicomp (5x5) | ||
| Podkładka grzewcza | Harvard Apparatus | ||
| Szliki entomologiczne | Entosphinx (Republika Czeska) | ||
| Ketamina 10% (ketamina) | Alfasan | ||
| Mikrokleszczyk Halsteda z prostą końcówką | Aesculap | ||
| Molinea | Hartmann BV | ||
| NaCl 0,9% | Baxter International Inc. | ||
| Igły (25G) | Terumo Medical Corp. | ||
| Oksymetr | Edan Instruments, Inc. | ||
| Pentobarbital | Apteka UMCG | ||
| Rimadyl | Pfizer Pharma GmbH | ||
| Ostrze skalpela nr 23 | Swann-Morton | ||
| Rączka skalpela nr 4 133 mm | Aesculap | ||
| Śrubokręt | Dowolny dostawca | ||
| Simplex Rapid (cement dentystyczny) | Kemdent | ||
| Śruby czaszkowe | Component Supply Co. | ||
| Szpatułka | VWR international | ||
| Spongestan special | Johnson &i Johnson | ||
| Stereotaktyki | Kopf Instruments | ||
| Kleszczyki chirurgiczne 100 mm | Aesculap | ||
| Materiał szewny Safil 5/0 | Aesculap | ||
| Strzykawka 10 ml | Omnifix | ||
| Strzykawka 1 ml | Terumo Medical Corp. | ||
| Strzykawka 5 ml | Omnifix | ||
| Xylocaine (lidokaina/adrenalina) | AstraZeneca |
Bibliografia
- Russell, W. M. S., Burch, R. L. The Principles of Humane Experimental Technique. , Methuen, London. (1959).
- Richardson, C. A., Flecknell, P. A. Anaesthesia and post-operative analgesia following experimental surgery in laboratory rodents: are we making progress? Altern. Lab Anim. 33, 119-127 (2005).
- Stokes, E. L., Flecknell, P. A., Richardson, C. A. Reported analgesic and anaesthetic administration to rodents undergoing experimental surgical procedures. Lab Anim. 43, 149-154 (2009).
- Flecknell, P. A. Laboratory Animal Anaesthesia - A Practical Introduction for Research Workers and Technicians. , Academic Press. (2009).
- DIRECTIVE 2010/63/EU OF THE EUROPEAN PARLIAMENT AND OF THE COUNCIL of 22 September 2010 on the protection of animals used for scientific purposes. Official Journal of the European Union. , (2010).
- Geiger, B. M., Frank, L. E., Caldera-Siu, A. D., Pothos, E. N. Survivable Stereotaxic Surgery in Rodents. J. Vis. Exp. (20), e880-e880 (2008).
- Hellebrekers, L. J., Booij, L. H. D. J., Flecknell, P. A. Anaesthesia, analgesia and euthanasia. Principles of Laboratory Animal Science. Van Zutphen, L. F. M., Baumans, V., Beynen, A. C. , Elsevier Science B.V. 277-311 (2001).
- Walantus, W., Elias, L., Kriegstein, A. In utero intraventricular injection and electroporation of E16 rat embryos. J. Vis. Exp. (6), e236-e236 (2007).
- Paxinos, G., Watson, C. The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates. , Academic Press. (1986).
- Paxinos, G., Watson, C. The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates. , Academic Press/Elsevier. (2007).
- Swanson, L. W. Brain Maps: Structure of the Rat Brain. , Elsevier. (1992).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
