Niniejszy film przedstawia model służący do badania rozwoju hiperplazji intimy po implantacji stentu z wykorzystaniem ludzkiego naczynia (IMA) w modelu szczura z niedoborem odporności.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Przeszczepianie i stentowanie ludzkiej tętnicy piersiowej wewnętrznej (IMA): model ludzki do badania rozwoju restenozy wewnątrzstentowej
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Przedkliniczne modele badawcze in vivo służące do badania procesów patobiologicznych i patofizjologicznych w rozwoju hiperplazji intimy po stentowaniu naczyń są kluczowe dla podejść translacyjnych1,2.
Powszechnie stosowane modele zwierzęce obejmują myszy, szczury, króliki i świnie3-5. Jednakże przekładanie tych modeli na warunki kliniczne pozostaje trudne, ponieważ procesy biologiczne te są już badane w naczyniach zwierząt, ale nigdy wcześniej nie były realizowane w modelach badawczych na ludziach6,7. W tym filmie prezentujemy nowy model zhumanizowany, który pozwala pokonać tę lukę translacyjną. Przedstawiona procedura jest powtarzalna, łatwa i szybka w wykonaniu oraz odpowiednia do badania rozwoju hiperplazji intimy i przydatności różnych stentów.
W niniejszym materiale wideo pokazano sposób wykonania techniki stentowej w naczyniach ludzkich, a następnie ich transplantacji do szczurów z niedoborem odporności, oraz zidentyfikowano ludzkie pochodzenie proliferujących komórek.
Protokół
1. Przygotowanie tętnicy piersiowej wewnętrznej (IMA)
- Śródbłonek tętnicy zostaje usunięty poprzez wprowadzenie cewnika do embolektomii tętniczej Fogarty o rozmiarze 2-french (Baxter Healthcare, Deerfield, IL, USA). Cewnik jest przeciągany przez całą długość naczynia dwukrotnie, aby zapewnić uszkodzenie śródbłonka.
- Należy użyć dowolnego ludzkiego stentu o długości 8 mm i średnicy od 2,5 mm do 3 mm (np. Translumina, Yukon stent). UWAGA: Średnica stentu nie powinna przekraczać średnicy naczynia o więcej niż 10%, aby uniknąć zwężenia przed i za stentem. UWAGA: Nie należy zmieniać długości stentu w obrębie tego samego badania.
- Stent należy wprowadzić, stosując odpowiednie ciśnienie balonu (podane na opakowaniu stentu), aby osiągnąć pożądaną średnicę.
- Stentowaną tętnicę IMA należy przechowywać w temperaturze 4 °C w pożywce RPMI + heparyna (500 IE/10 ml) na lodzie do momentu transplantacji.
2. Przygotowanie zwierząt
Szczury RNU Nude (Crl:NIH-Foxn1rnu) (300-350 g) są utrzymywane w warunkach konwencjonalnych w wentylowanych klatkach typu scantainer, z dostępem ad libitum do standardowej karmy dla szczurów i wody autoklawowanej.
- Uśpij szczura izofluranem (2,5-3%) przy użyciu komory indukcyjnej.
- Wygol owłosienie brzucha, połóż szczura na plecach i załóż maskę na nos i pysk, aby utrzymać znieczulenie.
- Szeroko zdezynfekuj obszar brzucha preparatem Provo-Iodine, a następnie 80% etanolem – powtórz ten krok dwukrotnie. Sprawdź odruchy, uciskając tylne łapy, aby upewnić się, że szczur jest dostatecznie znieczulony.
- Pod kontrolą mikroskopu wykonaj górną medianową laparotomię, aby odsłonić podnerkową aortę brzuszną.
- Umieść jelita w rękawiczce zwilżonej solą fizjologiczną. Zawiń rękawiczkę wokół jelit, aby zapobiec utracie wilgoci.
- Wypreparuj aortę od regionu podnerkowego do rozwidlenia, uważając, aby nie uszkodzić odgałęzień naczyń.
- Użyj mikro clampów, aby zatrzymać przepływ krwi w aorcie. Najpierw załóż clamp proksymalny, a następnie distalny.
- Usuń segment aorty o długości ok. 0,5-0,7 mm i przepłucz pozostałą część aorty heparyną (200 jednostek).
- Weź stentowaną IMA, skróć ją do odpowiedniej długości i umieść w luce.
- Połącz IMA z aortą biorcy, wykonując szwy ciągłe nicią prolene 8-0 (Ethicon, Norderstedt, Niemcy).
- Ostrożnie otwórz pierwszy clamp kranialny, a następnie clamp kaudalny.
- W przeszczepionej IMA oraz na dystalnym końcu aorty powinno być widoczne tętno.
- Umieść jelita z powrotem w jamie brzusznej.
- Przepłucz jamę brzuszną podgrzaną sterylną solą fizjologiczną.
- Zamknij warstwę mięśniową ściany brzucha, stosując szwy ciągłe prolene 6-0 (Ethicon, Norderstedt, Niemcy).
- Gdy szczur wciąż znajduje się pod wpływem znieczulenia, wstrzyknij podskórnie 4-5 mg/kg Karprofenu.
- Stosuj odpowiednią analgezję pooperacyjną (np. Karprofen lub Meloksykam) przez 3 dni po zabiegu.
3. Reprezentatywne wyniki
Do badań histologicznych preparaty utrwalono w 4% formalinie, odwodniono w szeregu alkoholi o rosnącym stężeniu, a następnie infiltrowano w mieszaninie (MMA I) składającej się z 80% metakrylanu metylu i 20% ftalanu dibutylu przez 1 dzień, w MMA I z dodatkiem 1% suchego nadtlenku benzoilu przez 1 dzień oraz w MMA I z dodatkiem 3% suchego nadtlenku benzoilu (MMA III) przez 1-2 dni w temperaturze 4 °C. Następnie preparaty poddano polimeryzacji w świeżym MMA III w szklanych fiolkach w łaźni wodnej na uprzednio spolimeryzowanej podstawie. Powolną polimeryzację uzyskano poprzez utrzymywanie fiolek w temperaturze 26 °C przez noc, zwiększenie temperatury do 28 °C następnego ranka, a następnie stopniowe podnoszenie temperatury o 0,5 °C w ciągu 12 h aż do momentu zajścia polimeryzacji. Spolimeryzowane bloki pocięto na skrawki o grubości 5 μm przy użyciu mikrotomu MICROM HM 360 wyposażonego w nóż z węglika wolframu.
Aby zidentyfikować pochodzenie proliferujących komórek (Rysunek 1), preparaty barwiono przeciwciałami rozpoznającymi białko fluorescencyjne GFP, MHC-I szczura oraz ludzkie komórki mięśni gładkich. Na potrzeby tych badań ludzką IMA inkubowano przez noc z genem reporterowym GFP przy użyciu cząsteczek lentiwirusowych w celu stabilnej transdukcji komórek IMA. Komórki potomne pochodzenia ludzkiego można było zidentyfikować dzięki ekspresji GFP. Po deparafinizacji przeprowadzono obróbkę termiczną w celu odmaskowania epitopów, podgrzewając preparaty w roztworze do odmaskowywania antygenów za pomocą parowaru. Do etapu blokowania można wykorzystać wzmacniacz sygnału Image-iT FX. Komórki pochodzenia ludzkiego zidentyfikowano za pomocą mysich przeciwciał monoklonalnych przeciwko GFP (rozcieńczonych 1:100 w rozcieńczalniku do przeciwciał pierwszorzędowych (Dako)), a następnie znakowano kozią IgG przeciwko mysim, Alexa Fluor 488 (rozcieńczoną 1:1000 w rozcieńczalniku do przeciwciał wtórnych). Komórki mięśni gładkich znakowano króliczymi poliklonalnymi przeciwciałami przeciwko α-aktynie mięśni gładkich (rozcieńczonymi 1:100 w rozcieńczalniku do przeciwciał pierwszorzędowych), a następnie kozią IgG przeciwko króliczym, Alexa Fluor 555 (rozcieńczoną 1:1000 w rozcieńczalnikach do przeciwciał wtórnych). Każdy etap inkubacji z przeciwciałami przeprowadzano w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę, z trzykrotnym płukaniem w PBS pomiędzy etapami. Jądra komórkowe barwiono DAPI przez 10 minut. Po zamontowaniu preparatów z użyciem odczynnika zapobiegającego blaknięciu Prolong Gold, próbki analizowano za pomocą mikroskopii konfokalnej.
Rycina 1. Komórki neointimy jako ludzkie komórki mięśni gładkich. A: Zielony= przeciwciało anty-GFP, znakujące komórki pochodzenia ludzkiego; czerwony= przeciwciało anty-aktyna komórek mięśni gładkich człowieka; niebieski= DAPI, identyfikujący jądra komórkowe. B: Zielony= przeciwciało anty-szczurzy MHC-I, znakujące komórki pochodzenia szczurzego; czerwony= przeciwciało anty-aktyna komórek mięśni gładkich człowieka; niebieski= DAPI, identyfikujący jądra komórkowe. Proliferujące komórki zostały zidentyfikowane jako komórki mięśni gładkich i są dodatnie w kierunku GFP, ale ujemne w kierunku cząsteczki szczurzego MHC-I. Zatem proliferujące komórki są pochodzenia ludzkiego.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Chociaż istnieją różne modele badawcze in vivo służące do badania rozwoju hiperplazji miażdżówki po implantacji stentów, modele te wciąż napotykają bariery translacyjne, które należy pokonać. Ponadto modele na dużych zwierzętach są kosztowne, a specjalne warunki utrzymania zwierząt oraz sprzęt chirurgiczny nie są dostępne dla wszystkich laboratoriów.
Wykorzystanie ludzkiej tętnicy piersiowej wewnętrznej (IMA) do badania rozwoju proliferacji intimy i restenozy wewnątrzstentowej było wc...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.
Podziękowania
Autorzy dziękują Christiane Pahrmann za jej wkład. Szczególne podziękowania kierujemy do firmy Ethicon, Norderstedt, Hamburg (Niemcy) za dostarczenie materiałów do szycia.
Finansowanie
Sonja Schrepfer otrzymała grant badawczy od Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) (SCHR992/3 1 oraz SCHR992/4-1). Prace były wspierane przez ISHLT Shumway Career Development Grant 2010 oraz fundusze Falk Research Funding (Stanford University).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Cewnik Fogarty 2 French | Baxter Internationl Inc. | 120602F | |
| Stent Yukon | Translumina GmbH, Hechingen, Niemcy | Użyć stentu wybranego zgodnie z protokołem badania | |
| Pożywka RPMI | Biochrom AG | Nr.F1275 | |
| heparyna | Baxter Internationl Inc. | 2B0953 | |
| izofluran | Abbott Laboratories | B506 | |
| Provo-Iodine | Betadine Puredue Pharma | EAN:5995327165830 | |
| 80% etanol | Geyer | ETV 80/0500 | |
| Mikrozacisk | Harvard Apparatus | PY2-61-0186 | |
| Szycie 8-0 | Johnson & Johnson | 2808G | |
| Szycie 6-0 | Johnson & Johnson | 1698 H | |
| Karprofen | Feizer Vet | PZN:0110208 | |
| Metamizol | Ratiopharm | ||
| Roztwór do odzyskiwania celu, pH9 | Dako | S2368 | |
| Wzmacniacz sygnału Image-iT FX | Invitrogen | I36933 | |
| mysi monoklonalny przeciwciało anty-GFP | BD Biosciences | 632381 | |
| rozcieńczalnik do przeciwciał pierwotnych | Dako | S3022 | |
| kozia anty-mysia IgG, Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A11017 | |
| rozcieńczalnik do przeciwciał wtórnych | Dako | S0809 | |
| królicze poliklonalne przeciwciało anty- α-aktyna mięśni gładkich | Abcam | ab5694 | |
| kozia anty-królicza IgG, Alexa Fluor 555 | Invitrogen | A21430 | |
| Odczyn antywyblakający Prolong Gold | Invitrogen | P36930 |
Bibliografia
- Deuse, T., Ikeno, F., Robbins, R. C., Schrepfer, S. Imaging In-Stent Restenosis: An Inexpensive, Reliable, and Rapid Preclinical Model. J. Vis. Exp. (31), e1346(2009).
- Oyamada, S. Trans-iliac rat aorta stenting: a novel high throughput preclinical stent model for restenosis and thrombosis. J. Surg. Res. 166, e91-e95 (2011).
- Chamberlain, J. A novel mouse model of in situ stenting. Cardiovascular research. 85, 38-44 (2010).
- Deuse, T. Introducing the first polymer-free leflunomide eluting stent. Atherosclerosis. 200, 126-134 (2008).
- Finn, A. V. Differential healing after sirolimus, paclitaxel, and bare metal stent placement in combination with peroxisome proliferator-activator receptor gamma agonists: requirement for mTOR/Akt2 in PPARgamma activation. Circulation research. 105, 1003-1012 (2009).
- Tellez, A. Coronary bare metal stent implantation in homozygous LDL receptor deficient swine induces a neointimal formation pattern similar to humans. Atherosclerosis. 213, 518-524 (2010).
- Suzuki, Y., Yeung, A. C., Ikeno, F. The pre-clinical animal model in the translational research of interventional cardiology. JACC Cardiovasc. Interv. 2, 373-383 (2009).
- Holt, C. M. Intimal proliferation in an organ culture of human internal mammary artery. Cardiovascular research. 26, 1189-1194 (1992).
- Swanson, N., Javed, Q., Hogrefe, K., Gershlick, A. Human internal mammary artery organ culture model of coronary stenting: a novel investigation of smooth muscle cell response to drug-eluting stents. Clin. Sci. (Lond). 103, 347-353 (2002).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
