Metoda izolacji i identyfikacji mRNA, mikroRNA i składników białkowych kompleksów rybonukleoproteinowych z ekstraktów komórkowych za pomocą RIP-Chip

Podsumowanie

Protokół krok po kroku do izolowania i identyfikacji kompleksów związanych z RNA za pomocą RIP-Chip.

Streszczenie

W wyniku rozwoju wysokoprzepustowego sekwencjonowania i efektywnej analizy mikromacierzy, globalna analiza ekspresji genów stała się łatwą i łatwo dostępną formą zbierania danych. Jednak w wielu badaniach i modelach chorób poziomy mRNA w stanie stacjonarnym genu docelowego nie zawsze są bezpośrednio skorelowane z poziomami białka w stanie stacjonarnym. Potranskrypcyjna regulacja genów jest prawdopodobnym wyjaśnieniem rozbieżności między nimi. Regulacja potranskrypcyjna, napędzana wiązaniem białek wiążących RNA (RBP), wpływa na lokalizację, stabilność i translację mRNA poprzez tworzenie kompleksu rybonukleoproteiny (RNP) z docelowymi mRNA. Identyfikacja tych nieznanych de novo celów mRNA z ekstraktów komórkowych w kompleksie RNP ma kluczowe znaczenie dla zrozumienia mechanizmów i funkcji RBP oraz ich wpływu na produkcję białek. Protokół ten przedstawia metodę określaną jako RNP immunoprecypitacja-mikromacierz (RIP-Chip), która pozwala na identyfikację specyficznych mRNA związanych z kompleksem rybonukleoproteinowym w zmieniających się warunkach eksperymentalnych, wraz z opcjami dalszej optymalizacji eksperymentu dla indywidualnego badacza. Dzięki temu ważnemu narzędziu eksperymentalnemu naukowcy mogą badać skomplikowane mechanizmy związane z potranskrypcyjną regulacją genów, a także innymi interakcjami rybonukleoprotein.

Protokół

Przygotowanie do eksperymentu

Przed rozpoczęciem eksperymentu, ważne jest, aby wszystkie odczynniki, pojemniki i naczynia były wolne od RNazy. Potraktuj szklane naczynia inhibitorem RNazy (RNaseZAP, Ambion), a następnie spłucz wodą uzdatnioną DEPC. Upewnij się, że wszystkie odczynniki są potwierdzone jako wolne od RNazy.

1. Przygotuj lizat mRNP

1. Hoduj i zbieraj wykładniczo rosnące komórki tkankowe, aby wyprodukować od 2 do 5 mg całkowitego białka na każdy RIP.
   1. Zwykle wystarczą dwie szalki z kulturą P150.
   2. Dla każdego badanego RBP całkowita liczba komórek i ilości białek muszą być zoptymalizowane, aby zmaksymalizować odpowiednie docelowe interakcje mRNA i RBP.
   3. RIP do analizy qRT-PCR może wymagać mniejszej ilości lizatu komórkowego (około 400 μg białka całkowitego) ze względu na jego metodę amplifikacji i wykrywania, szczególnie w przypadku RBP o wysokiej obfitości, takich jak HuR, AUF1, TIAR.
2. Komórki osadu należy rozdrabniać przez odwirowanie w temperaturze 200 x g przez 8-10 minut w temperaturze 4 °C, a następnie trzykrotnie przemyć lodowatym PBS.
3. Po końcowym płukaniu delikatnie strzepnąć spód probówki i ponownie zawiesić osad komórkowy w równych objętościach przygotowanego buforu do lizy polisomów (PLB) z inhibitorami RNazy i proteazy.
   1. Zaleca się odmierzenie dokładnej objętości osadu komórkowego.
4. Delikatnie odpipetować mieszaninę (nie wirować), aby rozbić grudki komórek i inkubować lizat na lodzie przez 5 minut.
5. Wirować przy 13 000 x g przez 20 minut w temperaturze 4 °C w celu oczyszczenia lizatu z zanieczyszczeń.
6. Natychmiast przenieść oczyszczony supernatant do wstępnie schłodzonej probówki do mikrofuge.
7. Przechowywać na lodzie i przechowywać w temperaturze -80 °C.
   1. Natychmiastowe zamrożenie uzupełnia prawidłową lizę komórek i zapobiega niepożądanemu wiązaniu. Kontynuuj RIP natychmiast po rozmrożeniu próbki i trzymaj próbki na lodzie, aby uniknąć degradacji RNA.
   2. Lis ten może być przechowywany do sześciu miesięcy w temperaturze -80 °C. Unikaj powtarzających się cykli zamrażania i rozmrażania, ponieważ może to prowadzić do degradacji białka i/lub mRNA.
8. Określ ilościowo stężenie białka w lizacie za pomocą standardowego testu białka Bradforda.

2. Pokryj białko A Sefaroza Koraliki przeciwciałem i umyj

1. Wstępnie pęczniejące białko A Sepharose (PAS) kulki przez noc w buforze NT2 (3-4 objętości) z 5% BSA. Przechowywać w temperaturze 4 °C.
   1. Długotrwałe przechowywanie, do kilku miesięcy, w temperaturze 4 °C jest możliwe po uzupełnieniu 0,1% azydkiem sodu.
   2. Kulki białkowe sefarozy powinny być dobierane na podstawie izotypu docelowego przeciwciała RBP. Białka A, G i A/G mają określone cele izotypowe i różnią się powinowactwem do celu. Zastosowano kulki sefarozy białka A w oparciu o swoistość izotypową i powinowactwo do przeciwciała białkowego HuR.
2. Przed użyciem należy usunąć nadmiar bufora NT2, tak aby stosunek końcowych kulek do buforu wynosił 1:1.
3. Używając 1,5 ml probówek wirówkowych bez RNAzy, usuń 100 μl zawiesiny PAS i dodaj 30 μg przeciwciała dla każdej indywidualnej reakcji IP (tj. specyficznej kontroli RBP i izotypu).
4. Dodać 100-200 μl buforu NT2 do mieszanki kulek przeciwciał.
   1. Mieszanina może być przechowywana przez kilka tygodni w temperaturze 4 °C po uzupełnieniu 0,1% azydkiem sodu.
   2. Przeciwciało dopasowane izotypowo lub całe normalne surowice tego samego gatunku powinny być stosowane równolegle jako kontrola przeciwciał przeciwko RNA tła.
5. Dodać odpowiednie przeciwciało do mieszanki kulek i inkubować przez noc, przewracając się od końca do końca w temperaturze 4 °C.
   1. Zoptymalizuj miano przeciwciał dla konkretnego badanego białka (zwykle wystarcza 1, 5, 10 lub 30 μg przeciwciała).
6. Bezpośrednio przed użyciem przygotować kulki pokryte przeciwciałami, przemywając 1 ml lodowatego buforu NT2 5 razy.
   1. Płukać mieszankę kulek przez odwirowanie w temperaturze 13 000 x g przez 1-2 minuty w temperaturze 4 °C.
   2. Ostrożnie usunąć maksymalną ilość supernantantu za pomocą pipetora ręcznego lub aspiratora, ale należy uważać, aby nie rozerwać osadu.
   3. Mycie pomaga usunąć niezwiązane przeciwciała, a także zanieczyszczenia RNazą z mieszaniny przeciwciał.
7. Po zakończeniu końcowego płukania ponownie zawieś kulki w 700 μl lodowatego buforu NT2, a następnie poddaj działaniu różnych inhibitorów RNazy w celu ochrony docelowych mRNA, w tym 10 μl RNazy przy 40 U/μl, 10 μl 100 mM DTT i 15 μl EDTA (15 mM). Doprowadzić objętość do 1 000 μl za pomocą bufora NT2.
   1. Kompleksy rybonukleozydowe wanadylu nie są stosowane ze względu na hamujące działanie EDTA.

3. Immunoprecypitacja i wytrącanie RNA

1. Opcjonalny krok Preclear:
   1. Aby zredukować tło, do wstępnej lizy można użyć kulek i przeciwciała kontrolnego. Może to zmniejszyć sygnał na wyjściu.
   2. Ten krok może być konieczny do zmniejszenia tła podczas wykonywania adresu IP, a następnie mikromacierzy. Na ogół nie jest konieczne stosowanie IP, a następnie qRT-PCR.
   3. Przygotowanie do czyszczenia za pomocą kontrolnej izotypu 15 μg przez 30 minut/4 °C, przewracanie się od końca do końca.
   4. Dodać 50 μl napęcznionych kulek PAS niepokrytych przeciwciałem z kroku 2.1.
   5. Inkubować 30 min/4 °C z obrotem koniec na koniec
   6. Odwirować przy 10 000 x g w temperaturze 4 °C. Zapisz supernatant dla adresu IP.
2. Dodać 100 μl wyizolowanego oczyszczonego lizatu (około 2-5 mg) do przygotowanej mieszanki przeciwciał.
   1. Rozcieńczenie lizatu pomoże zmniejszyć wiązanie tła i niespecyficzne.
   2. Ilość wprowadzanego lizatu może się różnić w zależności od metody wykrywania i obfitości RBP lub skuteczności przeciwciała RBP, jak podano w kroku 1.1.c.
3. (Opcjonalnie) Natychmiast wymieszać probówkę, delikatnie przesuwając kilka razy, a następnie krótko odwirować przy 10 000 x g w temperaturze 4 °C do granulek i natychmiast usunąć 100 μl supernatantu jako całkowitą wejściową reprezentację mRNA do analizy qPCR przy użyciu standardowych technik izolacji RNA.
   1. Ten krok ma na celu potwierdzenie, że wejściowy RNA lizatu jest optymalny dla IP i powinien być wykonywany tylko jako krok kontrolny lub jako krok rozwiązywania problemów po RIP ze słabymi wynikami RNA.
4. Owinąć probówkę w parafilm, aby zapewnić szczelne uszczelnienie i inkubować w temperaturze 4 °C przez 2 do 4 godzin, przewracając koniec na końcu.
   1. Czas inkubacji powinien być zoptymalizowany w oparciu o docelową liczebność i powinien być zminimalizowany, aby uniknąć skomplikowanego przegrupowania lub degradacji. W przypadku niektórych RBP krótsze inkubacje mogą być bardziej optymalne.
5. Granulki w ilości 5 000 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C i zachować supernatant do potencjalnej analizy metodą Western blot. Przechowywać podwielokrotności w temperaturze -80 °C.
   1. Porcje supernatantu z dużą ilością resztkowego białka docelowego mogą wskazywać na niepowodzenie w wytrącaniu się białka przez kulki sefarozy.
6. Jak opisano wcześniej, przemyć kulki 5 razy 1 ml lodowatego buforu NT2 i odwirować (5 000 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C), a następnie usunąć supernatant za pomocą pipetora ręcznego lub aspiratora.
   1. Bardziej rygorystyczne metody mycia mogą być stosowane w celu redukcji tła poprzez uzupełnienie buforu NT2 deoksycholanem sodu, mocznikiem lub SDS.
   2. Utrzymuj próbki na lodzie tak często, jak to możliwe i pracuj szybko, aby zminimalizować degradację docelowego mRNA.
7. Opcjonalnie: Zaoszczędź niewielką porcję (10%) mieszanki perełkowej lub uruchom dodatkową próbkę równolegle w celu sprawdzenia wydajności IP docelowego białka za pomocą analizy Western blot.

4. Leczenie DNazą i proteinazą K

1. Po umyciu ponownie zawiesić kulki ze 100 μl buforu NT2 uzupełnionym 5 μl DNazy 1 wolnej od RNaz (2 U/μl).
2. Przechowywać w temperaturze 37 °C przez 5-10 minut. Dodać 1 ml buforu NT2 i odwirować przy 5 000 x g przez 1 minutę w temperaturze pokojowej.
   1. Niewielka (~10%) porcja koralików może być użyta do sprawdzenia wydajności IP za pomocą analizy SDS-PAGE.
3. Zawiesić osad PAS w 100 μl buforu NT2, 5 μl proteinazy K (10 mg/ml) i 1 μl 10% SDS.
4. Mieszaninę zawieszonych kulek inkubować przez 30 minut w temperaturze 55 °C w łaźni wodnej, delikatnie przesuwając co 10 minut.
   1. Proteinaza K pomoże w uwalnianiu składników RNP.
5. Granulki o wielkości 5 000 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej (RT) i zebrać supernatant (~100 μl).
6. Dodać 200 μl buforu NT2 do kulek, odwirować 5 000 x g przez 2 minuty w temperaturze pokojowej, zebrać supernatant (~200 μl) i wyrzucić kulki.
7. Połączyć supernatanty (100 μl i 200 μl) i dodać 300 μl dolnej warstwy kwaśnego fenolu-CHCl₃.
8. Wirować, 1 min RT (lub 37 °C w shakerze) i wirować przy 16 000 x g przy RT przez 1 min.
9. Zbierz 250 μl górnej warstwy (NIE zakłócaj interfejsu), dodaj 25 μl octanu sodu o pH 5,2, 625 μl 100% ETOH i 5 μl glikoniebieskiego i dobrze wymieszaj.
10. Przechowywać przez noc w temperaturze -20 °C.
    1. Aby zapewnić prawidłowy odzysk RNA, dodanie glycoblue zwiększy widoczność osadu RNA, działając jako cząsteczka nośnikowa.
11. Następnego dnia wymieszać probówki metodą inwersji 3-5 razy, wirować w temperaturze 12 000 x g w temperaturze 4 °C przez 30 minut i wyrzucić supernatant.
12. Dodaj 1 ml 70% ETOH do niebieskiego granulatu i wymieszaj przez odwrócenie lub wirowanie.
13. Wirować 12 000 x g w temperaturze 4 °C przez 2 min.
14. Odrzucić supernatant i odwirować 12 000 x g przez 1 minutę w temperaturze 4 °C.
15. Usuń resztki 70% ETOH za pomocą pipety i suchego granulatu na powietrzu w temperaturze pokojowej przez 5 minut.
16. Zawiesić w 20-40 μl wody wolnej od RNaz/DNaz lub innej odpowiedniej objętości w zależności od potrzeb.
    1. Próbka jest teraz gotowa do dalszych zastosowań, takich jak qRT-PCR lub mikromacierz.
    2. Spektrofotometria nanokropli może być stosowana do oceny stężenia próbki, jednak w przypadku cennych próbek korzystne może być unikanie nanokropli próbek, ponieważ może to być marnotrawstwem i stosunkowo niedokładne. Sugerujemy normalizację próbek do transkryptów genów porządkowych w celu oceny czystości i wydajności IP dla próbek cennych lub o niskiej wydajności.

5. Reprezentatywne wyniki

Jeśli procedura zostanie zoptymalizowana i wykonana poprawnie, immunoprecypitacja powinna przynieść znaczne wzbogacenie celów mRNA. Zazwyczaj, w zależności od RBP i jego celu (celów) mRNA, obserwujemy wzbogacenie około 10 do 50-krotne podczas oceny za pomocą qRT-PCR. Wiele celów RBP można masowo wykryć za pomocą analizy mikromacierzy. Jednak ta metoda jest bardziej wrażliwa na degradację w porównaniu z qRT-PCR. W zależności od RBP, liczby celów i wydajności reakcji, mikromacierz może ujawnić setki nowych celów lub może odkryć tylko kilka, jeśli w ogóle. Na przykład jedno z lepiej scharakteryzowanych białek wiążących RNA, HuR, po transkrypcji reguluje ekspresję i translację wielu ważnych genów fizjologicznych ^{1, 2}. Na przykład izolacja kompleksu rybonukleologicznego HuR za pomocą RIP-Chip w liniach komórkowych raka piersi ujawniła wzbogacenie kilku ważnych znanych celów HuR, w tym β-aktyny za pomocą qRT-PCR, jak pokazano na rycinie 1. W obu liniach komórek nowotworowych β-aktyna jest wzbogacona od 12 do 15 razy. Zazwyczaj, gdy jest wykonywany prawidłowo, obserwujemy znaczne wzbogacenie β-aktyny w różnych liniach komórkowych. Jeżeli jednak RIP nie ujawnia żadnego znaczącego wzbogacenia w β-aktynę, oznacza to problem z RIP i może być konieczne powtórzenie procedury. Ponadto analiza mikromacierzy immunoprecypitowanych próbek z tych linii komórkowych ujawniła odrębne podzbiory ekspresji celów HuR w różnych komórkach rakowych MCF-7 z dodatnim receptorem estrogenowym (ER) w porównaniu z liniami komórkowymi raka piersi MB-231 z ujemnym ER, jak pokazano na rycinie 2 ¹. Cele te dzielą się na kilka kategorii: znane i nieznane cele HuR, które były związane lub nie były związane z rakiem. Na przykład CALM2 i CD9 są genami nowotworowymi, które nie zostały wcześniej zidentyfikowane jako cele HuR. Korzystając z mikromacierzy i potwierdzając za pomocą qRT-PCR, stwierdzono, że CALM2 i CD9 są od 5 do 180 razy wzbogacone w osad HuR, co wskazuje na wyraźną interakcję między białkiem HuR a tymi docelowymi genami.

Rysunek 1. Immunoprecypitacja i RIP w komórkach raka piersi MB-231 (ER-) i MCF-7 (ER+). Immunoprecypitację przeprowadzono z lizatów komórkowych MB-231 lub MCF-7 przy użyciu przeciwciała monoklonalnego anty-HuR (3A2) i kontroli izotypu IgG1. A. IP Western of HuR ujawniło oczekiwany zakres rozmiarów wykryty przez 3A2. Panel po prawej stronie ujawnia ilości HuR w lizatach wejściowych używanych z obu linii komórkowych, z β-tubuliną jako kontrolą obciążenia. B. Weryfikacja za pomocą ilościowego RT-PCR wykazała piętnasto- i jedenastokrotne wzbogacenie β-aktyny, znanego celu HuR, w IP 3A2 odpowiednio z MB-231 i MCF-7. Wszystkie wartości ΔΔCT zostały znormalizowane do GAPDH. Eksperymenty przeprowadzono w dwóch egzemplarzach (n = 2).

Rysunek 2. HuR RIP-CHIP identyfikuje odrębne profile genetyczne w komórkach raka piersi ER+ i ER. Immunoprecypitacje HuR przeprowadzono z lizatów komórkowych MB-231 lub MCF-7 przy użyciu przeciwciała HuR i kontroli izotypu IgG1 zhybrydyzowanych z macierzami Illumina Sentrix (47 000 genów). Sygnały sterujące zostały odjęte. Wyniki reprezentują skumulowane dane z 12 różnych tablic. Eksperymenty przeprowadzono w trzech egzemplarzach (n = 3) dla każdej linii komórkowej z pasującymi kontrolami. Skale to log2.

Dyskusja

Ze względu na charakter tego eksperymentu, optymalizacja i doświadczenie będą jedynymi gwarantowanymi sposobami na skuteczne uzyskanie zamierzonych rezultatów. Na wielu etapach tej procedury temperatura i efektywne obchodzenie się z odczynnikami i produktami są niezwykle ważne. Właściwe zaplanowanie i wykonanie techniki pomoże zapewnić, że eksperyment został przeprowadzony w odpowiednim czasie w zalecanych optymalnych temperaturach. Głównym problemem związanym z eksperymentami z izolacją RNA jest wrażliwość RNA na degradację przez RNazy. Wszystkie odczynniki muszą być wolne od RNaz i przechowywane lub używane w pojemnikach wolnych od RNaz. Jest to kluczowy krok w zapewnieniu integralności próbki mRNA. Jednak nawet jeśli eksperyment zostanie przeprowadzony prawidłowo, pożądany wynik może nie zostać osiągnięty ze względu na charakter interakcji między RBP a jego docelowymi mRNA.

Jednym z potencjalnych problemów jest niski lub nawet brak sygnału z RNA izolowanego przez RIP-Chip. Chociaż może istnieć sygnał z całkowitego RNA, może to być wynikiem nieodpowiedniego białka wiążącego ciągniętego w dół przez kulki. Pierwszym krokiem rozwiązywania problemów jest potwierdzenie, że używany lizat komórkowy ma odpowiednią ekspresję określonego RBP. Po potwierdzeniu, białko może zostać wyizolowane po ostatnim płukaniu NT2 i ponownie zawieszone w buforze Laemmli lub innym odpowiednim buforze denaturującym i ogrzewane w temperaturze 95 °C przez 5 minut. Analiza Western blot może być stosowana w tych próbkach w koordynacji z wejściowym lizatem, jak również kontrolami ujemnymi, aby zapewnić wystarczające obniżenie powiązanego białka.

Ponadto, ponieważ liza komórki jest wymagana w celu uzyskania dostępu do tych składników, może pojawić się potencjał nieprawidłowych i niepożądanych interakcji między normalnie oddzielonymi białkami a mRNA. Interakcje te mogą potencjalnie wiązać i "wchłaniać" docelowe mRNA lub białka wiążące poprzez niespecyficzne interakcje. Ponadto białka w tych różnych warunkach mogą fałdować się w wielu odmianach, a ich motywy wiążące mogą stać się niedostępne dla docelowych mRNA, uniemożliwiając ich interakcje. Oba te czynniki zwiększają znaczenie wydajnej pracy, a także wykorzystania optymalnych temperatur wymienionych w celu ograniczenia tych niepożądanych interakcji. Dodatkowo, optymalizacja warunków mycia dla każdego konkretnego białka docelowego będzie miała kluczowe znaczenie dla maksymalizacji czystości interakcji. Mogą być potrzebne bardziej rygorystyczne warunki prania. Na przykład bufor płuczący może być uzupełniony SDS lub odpowiednią ilością mocznika, aby zredukować niespecyficzne interakcje i tło w sygnale wyjściowym. Będzie to całkowicie zależne od docelowego RBP eksperymentatora, a także od docelowego mRNA w ich unikalnych warunkach fizjologicznych. Niektóre warunki nie będą odpowiednie dla niektórych narzędzi do analizy mRNA, na co należy zwrócić uwagę podczas przygotowywania próbek.

Wreszcie, chociaż RIP odnosi sukcesy we wzbogacaniu interakcji RNA-RBP, dobrze znanym problemem związanym z metodą RIP (CHIP) jest niemożność zidentyfikowania specyficznych domen wiążących RBP na przejściowych celach mRNA. Można zastosować kilka technik sieciowania, a następnie RIP w celu wyizolowania unikalnych celów sekwencji; jednak stosowanie krótkofalowego promieniowania UV ma tendencję do prowadzenia do uszkodzenia kwasów nukleinowych. Nowa metoda znana jako PAR-CLIP, czyli fotoaktywowane sieciowanie rybonukleozydowe i immuoprecipitacja, wykorzystuje długofalowe promieniowanie UV do włączenia tiourydyny do powstającego RNA, umożliwiając identyfikację unikalnych miejsc wiązania zarówno ze stabilnych, jak i przejściowych interakcji RNA.

Ogólnie rzecz biorąc, RIP-Chip został uznany za doskonałe narzędzie wykorzystywane do izolowania i badania interakcji między białkami wiążącymi RNA a ich celami mRNA przez naszą grupę, a także przez wiele innych grup badawczych. Choć jest to wrażliwe w swej naturze i praktyce, prawidłowe wykonanie tej procedury pozwoli na wyizolowanie tych kompleksów RNP, które do niedawna były niedostępne do odkrycia i analizy.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
1 M ditiotreitol	Fisher	BP172-5	DTT
DNaza 1	Ambion	2235	RNaz
Kwas etylenodiaminowy Tetraccetic	Fisher	BP118-500	EDTA
Glikogen	Ambion	9516
1 HEPES	Sigma	H3375-100G	pH 7.0
Igepal Nonidet P-40	USB	78641	NP40
1 M KCl	Fisher	BP366-500
1 M MgCl2	Fisher	BP214-500
NT2 Buffer	*Patrz poniżej
Bufor do lizy polisomów	*Zobacz poniżej
Tabletki koktajlowe inhibitora proteazy	Roche	11873580001
Protein A Sepharose	Beads Sigma	P3391
Proteinaza K	Fisher	BP1700-100
Inhibitor RNazy Out	Invitrogen	10777-019	40 U/μ l
1 M NaCl	Fisher	BP358-212
Dodecylosiarczan sodu	Fisher	BP166-500	SDS
1 M Tris-HCl	Fisher	BP153-500	pH 7,4
Trizol	Invitrogen	15596-026
Kompleksy rybonukleozydu wanadylu	New England Labs	S1402S	VRC
Reagent Workup
Przygotować odczynniki w naczyniach
DEPC< silny>bufor do lizy polisomów
100 mM KCl
5 mM MgCl2
10 mM HEPES (pH 7,0)
0,5% NP40
1 mM DTT
100 jednostek/ml RNaza Out
400 μ M VRC
Inhibitor proteazy tabletka
5 ml buforu do lizy polisomów
Dodać 50 μ l z 1 M HEPES (pH 7,0)
500 μ l z 1 M KCL
25 μ l z 1 M MgCl2
25 μ l NP40
4,7 ml H2O
50 μ l z 1 M DTT
12.5 μ l 100 U/ml RNaza Out
200 μ l Koktajl inhibitorów proteazy (rozpuszczony wg producenta)
10 μ l 200 mM VRC (w momencie użytkowania)
NT2 Buffer
50 mM Tris-HCl (pH 7,4)
150 mM NaCl
1 mM MgCl2
0,05% NP40
1 L buforu NT2
50 ml Tris (pH 7,4)
30 ml 5 M NaCl
1 ml 1 M MgCl2
500 μ l NP40
820 ml Wolne od RNaz i DNaz H2O