Izolacja chromatyny poprzez oczyszczanie RNA (ChIRP)

Podsumowanie

ChIRP to nowatorska i szybka technika mapowania genomowych miejsc wiązania długich niekodujących RNA (lncRNAs). Metoda ta wykorzystuje specyficzność komplementarnych, kafelkowych oligonukleotydów, co pozwala na wyliczenie genomowych miejsc związanych z lncRNA.

Streszczenie

Długie niekodujące RNA są kluczowymi regulatorami stanów chromatyny w ważnych procesach biologicznych, takich jak kompensacja dawki, imprinting oraz ekspresja genów rozwojowych ^{1,2,3,4,5,6,7}. Niedawne odkrycie tysięcy lncRNA powiązanych ze specyficznymi kompleksami modyfikacji chromatyny, takimi jak kompleks represyjny Polycomb 2 (PRC2), który pośredniczy w trymetylacji lizyny 27 histonu H3 (H3K27me3), sugeruje szeroką rolę licznych lncRNA w zarządzaniu stanami chromatyny w sposób specyficzny dla poszczególnych genów ^8,9. Podczas gdy niektóre lncRNA działają prawdopodobnie w cis na sąsiednie geny, inne lncRNA działają w trans, regulując geny położone w odległości. Na przykład lncRNA roX1 i roX2 u Drosophila wiążą się z licznymi regionami chromosomu X w komórkach męskich i są kluczowe dla kompensacji dawki ^10,11. Jednak dokładne lokalizacje ich miejsc wiązania nie są znane z wysoką rozdzielczością. Podobnie ludzkie lncRNA HOTAIR może wpływać na zajęcie PRC2 w setkach genów w całym genomie ^3,12,13, ale sposób osiągania tej specyficzności pozostaje niejasny. LncRNA mogą również służyć jako modularne rusztowania do rekrutacji i montażu wielu kompleksów białkowych. Klasycznym przykładem rusztowania RNA działającego w trans jest RNA TERC, który służy jako matryca i rusztowanie dla kompleksu telomerazy ¹⁴; HOTAIR może również służyć jako rusztowanie dla PRC2 oraz kompleksu demetylazy H3K4 ¹³.

Wcześniejsze badania mapujące zajętość RNA w chromatynie dostarczyły istotnych informacji ^15,16, lecz jedynie w odniesieniu do pojedynczych loci genowych. Miejsca zajętości większości lncRNA nie są znane, a role lncRNA w regulacji chromatyny wnioskowano głównie na podstawie pośrednich efektów zaburzeń lncRNA. Podobnie jak immunoprecypitacja chromatyny z następującym po niej badaniem mikromacierzy lub głębokim sekwencjonowaniem (odpowiednio ChIP-chip lub ChIP-seq) znacznie poprawiła nasze zrozumienie oddziaływań białko-DNA w skali genomowej, tutaj prezentujemy niedawno opublikowaną strategię mapowania zajętości długich RNA w całym genomie z wysoką rozdzielczością ¹⁷. Metoda ta, izolacja chromatyny poprzez puryfikację RNA (ChIRP, ang. Chromatin Isolation by RNA Purification) (Rysunek 1), opiera się na wychwycie powinowactwa kompleksu lncRNA:chromatyna za pomocą mozaikowych oligosonda antisense, co pozwala na wygenerowanie mapy genomowych miejsc wiązania z rozdzielczością kilku stu zasad, wysoką czułością i niskim tłem. Metoda ChIRP jest możliwa do zastosowania w przypadku wielu lncRNA, ponieważ projektowanie sond powinowactwa jest proste przy znanej sekwencji RNA i nie wymaga wiedzy o strukturze RNA ani jego domenach funkcjonalnych.

Protokół

1. Projektowanie sondy

Projektowanie antysensownych sond DNA typu tiling do selektywnego wyodrębniania docelowego RNA metodą ChIRP.

1. Zaprojektuj oligosondy antysensowne, korzystając z internetowego projektanta sond na stronie singlemoleculefish.com ¹⁸.
2. Zastosuj następujące parametry: liczba sond = 1 sonda / 100 bp długości RNA; 2) zawartość GC w sekwencji docelowej = 45%; 3) długość oligonukleotydu = 20; 4) długość odstępu = 60-80. Jeśli RNA jest zbyt długie dla programu do projektowania, podziel je na segmenty. Pomiń regiony powtórzeń lub obszary o znacznej homologii.
3. Zamów sondy DNA antysensowne z BiotinTEG na końcu 3'.
4. Oznakuj sondy zgodnie z ich pozycjami wzdłuż RNA. Rozdziel je na dwie pule w taki sposób, aby pula „parzysta” zawierała wszystkie sondy o numerach 2, 4, 6 itd., a pula „nieparzysta” sondy o numerach 1, 3, 5 itd. Rozcieńcz pule sond do stężenia 100 μM i przechowuj w temperaturze -20 °C.
5. Wszystkie eksperymenty należy przeprowadzić z użyciem obu pul, które służą sobie nawzajem jako kontrole wewnętrzne. Prawdziwy sygnał zależny od RNA byłby obecny w obu pulach, podczas gdy szumy specyficzne dla sond byłyby unikalne dla każdej z pul. Dotyczy to zarówno metody ChIRP-qPCR, jak i ChIRP-seq.

2. Zbiór komórek

Zebrać komórki, które zostaną wykorzystane w eksperymencie ChIRP.

1. Hodować komórki w płytkach do hodowli tkankowych lub kolbach do momentu osiągnięcia konfluencji. Przepłukać raz roztworem soli fizjologicznej z buforem fosforanowym (PBS) i poddać trypsynizacji. Zneutralizować trypsynę, dodając medium w objętości >2x, pipetować w górę i w dół, aby odczepić komórki, a następnie resuspender do uzyskania zawiesiny pojedynczych komórek. Przenieść całe medium wraz z resuspenderowanymi komórkami do probówek Falcon 50 ml. Zazwyczaj 20 milionów komórek jest wystarczające dla jednej próbki ChIRP.
2. Wirować komórki przy 800RCF przez 4 min. Odessać medium i resuspender 40 milionów komórek w 40 ml PBS, w razie potrzeby łącząc probówki. Wirować komórki przy 800RCF przez 4 min. Odlać PBS, a następnie ostrożnie odessać pozostały płyn pod kątem.

3. Sieciowanie komórek i zbieranie osadu komórkowego

Usieciuj zebrane komórki za pomocą glutaraldehydu, aby zachować oddziaływania RNA-chromatyna i przygotować osad komórkowy.

1. Wszystkie etapy należy przeprowadzić w temperaturze pokojowej.
2. Przygotować 1% glutaraldehydu w PBS w temperaturze pokojowej. Przygotować 10 ml na 10 milionów komórek (0,4 mL 25% roztworu stokowego glutaraldehydu + 9,6 mL PBS). Glutaraldehyd musi być świeżo przygotowany.
3. Opukać dno probówek typu Falcon, aby oderwać osady. Resuspender osad komórkowy w 1% glutaraldehydzie, zaczynając od małej objętości, aby uniknąć powstawania grudek, a następnie dopełnić do pełnej objętości. Wymieszać poprzez odwracanie probówek. Przeprowadzić sieciowanie przez 10 min w temperaturze pokojowej na wytrząsarce end-to-end lub rotatorze.
4. Zahamować reakcję sieciowania, dodając 1/10 objętości 1,25 M glicyny, i inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 min.
5. Wirować przy 2000RCF przez 5 min. Odessać nadsącz i raz przemyć osad 20 mL schłodzonego PBS, wirować przy 2000RCF przez 5 min.
6. Odessać nadsącz i resuspender przemyty, sieciowany osad w 1 ml schłodzonego PBS na 20 milionów komórek. Przenieść każdy 1 ml do probówki typu Eppendorf i wirować przy 2000RCF przez 3 min w 4 °C. Ostrożnie usunąć jak największą ilość PBS za pomocą końcówki pipety.
7. Szybko zamrozić osady komórkowe w ciekłym azocie i przechowywać w -80 °C bez określonego terminu ważności.

4. Lizy komórek

Zlizuj sieciowane komórki w celu przygotowania lizatu komórkowego.

1. Zamrożone pellety komórkowe rozmrozić w temperaturze pokojowej. Mocno opukać probówki, aby odczepić i wymieszać pellet komórkowy. Wirować pellet przy 2000RCF przez 3 min w 4 °C. Za pomocą ostrego końcówki do pipety 10 μl usunąć pozostały PBS.
2. Na wadze elektronicznej (z dokładnością do 1mg) odtarcować masę pustej probówki Eppendorf (nasze probówki ważą bardzo stabilnie 1,060 grama). Zważyć każdy pellet i zapisać jego masę. Pełna szalka 15 cm z sieciowanymi komórkami HeLa waży zazwyczaj 100 mg.
3. Uzupełnić bufor do lizy (10X masy pelletu, np. 1 ml na 100mg) świeżym inhibitorem proteaz, PMSF oraz Superase-in (patrz załączona lista buforów). Dokładnie wymieszać.
4. Do każdej probówki dodać 10X objętości uzupełnionego buforu do lizy i resuspendować pellet. W przypadku małych pelletów <25 mg, resuspendować w 250 μl uzupełnionego buforu do lizy. Suspensja powinna być jednorodna. Jeśli nie, podzielić zawiesinę na aliquoty 500 μl i użyć zmotoryzowanego mieszadła do pelletów, aby rozbić grudki. Niezwłocznie przystąpić do sonikacji.

5. Sonikacja

Rozfragmentuj DNA poprzez sonikację sieciowanych lizatów komórkowych.

1. Poddać lizat komórkowy sonikacji w urządzeniu Bioruptor w probówkach Falcon 15 ml. W każdej probówce należy umieścić <1,5 ml lizatu; aby przyspieszyć proces, sonikować nie więcej niż dwie probówki jednocześnie.
2. Sonikować w kąpieli wodnej o temperaturze 4 °C na najwyższym ustawieniu, stosując impulsy 30 sekund włączania i 45 sekund przerwy. Kontrolować lizat co 30 min. Kontynuować sonikację do momentu, aż lizat komórkowy przestanie być mętny. Może to zająć od 30 min do 4 h. Czas trwania procesu zależy od liczby probówek, objętości próbki, temperatury kąpieli oraz całkowitego czasu sonikacji. Probówki mogą sonikować w różnym tempie, dlatego należy je co 30 min łączyć i ponownie rozdzielać do pierwotnych probówek w celu zapewnienia homogeniczności. Uwaga: komórki sieciowane glutaraldehydem wymagają znacznie dłuższego czasu sonikacji niż ich odpowiedniki sieciowane formaldehydem.
3. Gdy lizat stanie się przejrzysty, przenieść 5 μL lizatu do nowej probówki Eppendorf. Dodać 90 μL buforu DNA Protease K (PK) (patrz lista buforów) oraz 5 μL PK. Wymieszać w wirówce typu vortex i krótko odwirować. Inkubować przez 45 min w temperaturze 50 °C.
4. Wyekstrahować DNA za pomocą zestawu do oczyszczania PCR firmy Qiagen. Eluować DNA w 30 μL buforu elucyjnego (EB) firmy Qiagen i sprawdzić wielkość DNA na 1% żelu agarozowym. Jeśli główna część smugi DNA mieści się w zakresie 100-500 bp, sonikacja jest zakończona. W przeciwnym razie kontynuować sonikację.
5. Odwirować zsonikowane próbki przy 16100RCF przez 10 min w temperaturze 4 °C. Połączyć nadsączniki, rozdzielić na aliquoty po 1 mL i zamrozić błyskawicznie w ciekłym azocie. Przechowywać w temperaturze -80 °C.

6. ChIRP

Hybrydyzacja biotynylowanych sond DNA z RNA i izolacja związanej chromatyny.

1. Rozmrozić probówki z chromatyną w temperaturze pokojowej.
2. Przygotować bufor do hybrydyzacji (patrz lista buforów, przygotować 2 ml na każdy 1 ml chromatyny). Wymieszać za pomocą wortexa.
3. W przypadku typowej próbki ChIRP z użyciem 1 ml lizatu, pobrać 10 μL na RNA INPUT oraz 10 μL na DNA INPUT i przenieść do probówek typu Eppendorf. Przechowywać w lodzie do momentu użycia.
4. Przenieść 1 mL chromatyny do probówki Falcon 15 mL. Do każdej probówki dodać 2 mL buforu do hybrydyzacji. W przypadku objętości całkowitej <1,5 ml, należy użyć probówek typu Eppendorf.
5. Rozmrozić sondy w temperaturze pokojowej. Zmierzyć stężenie sond za pomocą Nanodrop, aby sprawdzić ich ilość, jeśli nie były używane przez dłuższy czas (sondy 100 μM powinny wykazywać stężenie ~500-600 ng/μl przy ustawieniu dla jednoniciowego DNA). Dodać odpowiednią objętość sond do poszczególnych probówek (100 pmol sondy na 1 mL chromatyny, czyli 1 μL sondy o stężeniu 100 pmol/μL na 1 mL chromatyny). Dokładnie wymieszać. Inkubować w 37 °C przez 4 h z wytrząsaniem.
6. Na 20 min przed zakończeniem hybrydyzacji przygotować magnetyczne kulki C-1 (przechowywane w 4 °C). Użyć 100 μL na każde 100 pmol sond. Przemyć trzykrotnie 1 mL nieuzupełnionego buforu do lizy, używając paska magnetycznego DynaMag-2 do oddzielenia kulek od buforu.
7. Resuspendować kulki w pierwotnej objętości buforu do lizy; uzupełnić świeżym PMSF, P.I oraz Superase-in. Po zakończeniu 4-godzinnej reakcji hybrydyzacji dodać 100 μL kulek do każdej probówki. Dokładnie wymieszać. Inkubować w 37 °C przez 30 min z wytrząsaniem.
8. Przygotować bufor do przemywania (5 mL na próbkę). Wymieszać za pomocą wortexa. Podgrzać wstępnie do 37 °C. Przed użyciem dodać PMSF.
9. Przemyć kulki pięciokrotnie 1 mL buforu do przemywania. Podczas pierwszego przemywania użyć paska magnetycznego DynaMag-15 do oddzielenia kulek, odlać nadsącz i resuspendować w 1 mL buforu do przemywania. Przenieść objętość do probówki Eppendorf 1,5 mL. Inkubować w 37 °C z wytrząsaniem przez 5 min.
10. Podczas kolejnych przemywań wirować każdą probówkę w mikrowirówce, następnie umieścić próbkę na pasku magnetycznym DynaMag-2 na 1 min. Odlać próbkę, wytrzeć ewentualne krople chusteczką Kimwipe i resuspendować w 1 mL buforu do przemywania. Inkubować w 37 °C z wytrząsaniem przez 5 min. Powtórzyć do uzyskania łącznie pięciu przemyć.
11. Przy ostatnim przemywaniu dokładnie resuspendować kulki. Pobrać 100 μL i odstawić do izolacji RNA. Pozostałe 900 μL zarezerwować dla frakcji DNA. Umieścić wszystkie probówki na pasku magnetycznym DynaMag-2 i usunąć bufor do przemywania. Krótko odwirować wszystkie probówki, a następnie ponownie umieścić je na pasku magnetycznym. Całkowicie usunąć ostatnie pozostałości buforu do przemywania za pomocą ostrej końcówki pipety 10 μl.

7. Izolacja RNA

Wyodrębnij frakcję RNA z próbek ChIRP w celu ilościowego oznaczenia za pomocą qRT-PCR.

1. Pobrać 100 μL próbek kulek oraz 10 μL próbki RNA INPUT. Do RNA INPUT dodać 85 μL buforu RNA PK Buffer pH 7.0. Resuspendować kulki w 95 μL buforu RNA PK Buffer pH 7.0. Dodać 5 μL proteinazy K i inkubować w temperaturze 50 °C przez 45 min przy jednoczesnym wstrząsaniu end-to-end.
2. Krótko odwirować wszystkie probówki i gotować próbki przez 10 min w bloku grzewczym w temperaturze 95 °C.
3. Schłodzić próbki na lodzie, dodać 500 μL TRIzol i intensywnie mieszać w wortexie przez 10 s. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 10 min. Przechowywać w temperaturze -80 °C lub przejść do kroku 4.
4. Do próbek traktowanych TRIzol dodać 100 μL chloroformu. Intensywnie mieszać w wortexie przez 10 s. Wirować w wirówce laboratoryjnej przy 16100RCF przez 15 min w temperaturze 4 °C.
5. Pobrać ~400 μL wodnistego supernatantu, unikając fazy organicznej i interfazy.
6. Dodać 600 μL (1,5 objętości) 100% etanolu i dokładnie wymieszać. Przepuścić próbkę przez kolumny MIRNeasy mini. Przemyć 1x buforem RWT (z zestawu MIRNeasy mini) oraz 2x buforem RPE zgodnie z protokołem producenta. Eluować w 30 μL wody wolnej od nukleaz nuclease-free H₂O (nfH₂O).
7. Eluat RNA traktować zestawem DNA-free zgodnie z protokołem producenta. Po zakończeniu reakcji podgrzać próbkę przez 15 minut w temperaturze 65 °C, aby całkowicie inaktywować pozostałą DNazę.
8. Do analizy qRT-PCR w celu potwierdzenia odzyskania lncRNA użyć 1 μL izolowanego RNA na dołek. Jako kontrolę negatywną często stosuje się GAPDH.

8. Izolacja DNA

Wyodrębnij frakcję DNA z próbek ChIRP w celu identyfikacji poprzez sekwencjonowanie lub ilościowego oznaczenia za pomocą qPCR.

1. Przygotować bufor do elucji DNA (patrz lista buforów), 150 μl na próbkę, wliczając DNA INPUT.
2. Do każdego ml buforu do elucji DNA dodać 10 μL RNazy A (10 mg/mL) oraz 10 μL RNazy H (10 U/μl), a następnie wymieszać na wirówce typu vortex.
3. Każdą próbkę kulek resuspendować w 150 μL buforu do elucji DNA z RNazami. (DNA INPUT resuspendować w 140 μL). Inkubować w temperaturze 37 °C przez 30 min z wytrząsaniem.
4. Oddzielić kulki od nadsączu za pomocą paska magnetycznego DynaMag-2. Usunąć nadsącz i przenieść go do oznakowanych probówek.
5. Przygotować drugą porcję buforu do elucji DNA z 10 μL RNazy A (10 mg/mL) i RNazy H (10 U/μL) dokładnie tak, jak opisano w punkcie 8.2). Dodać 150 μL do każdej próbki (wliczając DNA INPUT), inkubować i usunąć nadsącz. Zebrać cały nadsącz (powinno być ok. 300 μL).
6. Do każdej próbki dodać 15 μL PK. Inkubować w temperaturze 50 °C przez 45 min z wytrząsaniem.
7. Wstępnie odwir {ować} żółte probówki z żelem fazowym (5PRIME). Przenieść próbki DNA do probówek z żelem fazowym i dodać 300 μL PhOH:Chloroform:Isoamyl na próbkę. Wstrząsać energicznie przez 10 min, a następnie wirować w wirówce laboratoryjnej przy 16100RCF przez 5 min w temperaturze 4 °C. Pobrać fazę wodną z góry (ok. 300 μL). Dodać 3 μL GlycoBlue, 30 μL NaOAc i 900 μL 100% EtOH. Dobrze wymieszać i przechowywać w temperaturze -20 °C przez noc.
8. Wirować próbki przy 16100RCF przez 30 min w temperaturze 4 °C.
9. Ostrożnie odlać nadsącz. Dodać 1 mL 70% EtOH i wymieszać na wirówce typu vortex. Wirować przy 16100RCF przez 5 min. Usunąć nadsącz za pomocą pipety. Suszyć na powietrzu przez 1 min. Resuspendować w 30 μL EB.
10. Próbki DNA są gotowe do analizy metodą qPCR lub do przygotowania bibliotek do sekwencjonowania wysokoprzepustowego zgodnie z protokołem firmy Illumina.

10. Reprezentatywne wyniki

Rycina 1 przedstawia schemat procedury ChIRP. Pomyślny eksperyment ChIRP zazwyczaj prowadzi do znacznego wzbogacenia docelowego RNA w stosunku do RNA nieswoistych. Rycina 2 pokazuje wzbogacenie ludzkiego RNA telomerazy (TERC) z komórek HeLa w stosunku do GAPDH, obfitego RNA komórkowego, który służy jako kontrola negatywna. Większość cząsteczek RNA TERC (~88%) obecnych w komórce została wyizolowana za pomocą metody ChIRP, podczas gdy odzyskano jedynie 0,46% RNA GAPDH, co wykazuje współczynnik wzbogacenia wynoszący ok. 200 razy. Sondy nieswoiste, takie jak sondy celujące w RNA LacZ, który nie jest eksprymowany w komórkach ssaków (Rycina 2), mogą być stosowane jako dodatkowe kontrole negatywne.

Regiony DNA, w których oczekiwano wiązania docelowego lncRNA, są zazwyczaj wzbogacone w porównaniu do regionów negatywnych w pomiarach za pomocą qPCR. Rycina 3 przedstawia walidację qPCR czterech miejsc wiązania HOTAIR w pierwotnych fibroblastach napletka ludzkiego, które zidentyfikowano poprzez przeprowadzenie ChIRP-seq w tej samej linii komórkowej, podczas gdy miejsca DNA TERC i GAPDH służą jako negatywne regiony kontrolne. Zarówno „parzyste”, jak i „nieparzyste” zestawy sond wykazały porównywalne wzbogacenie oczekiwanych miejsc wiązania HOTAIR względem regionów negatywnych, co jest charakterystyczne dla rzeczywistych miejsc wiązania lncRNA.

Wysokoprzepustowe sekwencjonowanie DNA wzbogaconego metodą ChIRP pozwala na uzyskanie globalnej mapy miejsc wiązania lncRNA. Znane jest, że lncRNA roX2 u Drosophila oddziałuje z chromosomem X w sposób niezbędny do kompensacji dawki. Rysunek 4 przedstawia profil wiązania roX2 na fragmencie chromosomu X. Zsekwencjonowano zarówno próbki „parzyste”, jak i „nieparzyste”, a ich specyficzny szum został wyeliminowany w celu uzyskania ścieżki sygnałów nakładających się. Każdy „pik” wskazuje tutaj na silne miejsce wiązania roX2. Pełna ścieżka oraz lista genów docelowych roX2 zostały opisane w pracy Chu et al. 2011 ¹⁷.

Rycina 1. Schemat procedury ChIRP. Chromatyna jest sieciowana z adduktami lncRNA:białko in vivo. Biotynilowane sondy mozaikowe (tiling probes) są hybrydyzowane z docelowym lncRNA, a kompleksy chromatyny są oczyszczane przy użyciu magnetycznych kulek streptawidynowych, a następnie poddawane rygorystycznym przemywaniom. Eluujemy DNA lub białka związane z lncRNA za pomocą koktajlu RNazy A i H. Domniemana sekwencja wiążąca lncRNA została przedstawiona schematycznie w kolorze pomarańczowym. Opublikowano wcześniej w pracy Chu et al. 2011.¹⁷

Rycina 2. ChIRP wzbogaca ludzkie RNA TERC. Sondy TERC-asDNA odzyskują ~88% komórkowego RNA TERC oraz niewykrywalną ilość GAPDH. Sondy LacZ-asDNA są wykorzystywane jako kontrole negatywne i nie odzyskują żadnego z tych RNA. Przedstawiono średnią + s.d. Opublikowano wcześniej w pracy Chu et al. 2011.¹⁷

Rycina 3. HOTAIR ChIRP-qPCR w pierwotnych ludzkich fibroblastach napletka. NFKBIA, HOXD3-4, SERINC5 i ABCA2 to regiony oddziałujące z HOTAIR. TERC i GAPDH służyły jako kontrole negatywne. Przedstawiono średnią + s.d. Opublikowano wcześniej w pracy Chu et al. 2011.¹⁷

Rycina 4. Dane ChIRP-seq dla RNA roX2 w komórkach Drosophila Sl2. Próbki „parzyste” i „nieparzyste” sekwencjonowano oddzielnie; ich dane połączono, aby odzwierciedlić tylko wspólne piki w obu grupach. Przedstawiono ścieżkę połączoną. Opublikowano wcześniej w Chu et al. 2011.¹⁷

Dyskusja

Opisano tutaj metodę ChIRP-seq, służącą do mapowania miejsc wiązania lncRNA in vivo w całej skali genomu. Kluczowymi parametrami warunkującymi sukces są podzielone pule płytek sond oligonukleotydowych oraz sieciowanie glutaraldehydem. Projektowanie sond powinowactwa jest proste, mając do dyspozycji sekwencję RNA, i nie wymaga wcześniejszej wiedzy o strukturze RNA czy domenach funkcjonalnych. Odniesione sukcesy w przypadku roX2, TERC oraz HOTAIR — trzech dość różnych RNA u dwóch gatunków — sugerują, że metoda ChIRP-seq jest prawdopodobnie możliwa do zastosowania w przypadku wielu lncRNA. Jak przy wszystkich eksperymentach, interpretacja wyników wymaga staranności i zastosowania odpowiednich kontroli. Różne lncRNA mogą wymagać miareczkowania warunków, a rozważna zmiana parametrów, takich jak wybór innych sond powinowactwa lub czynników sieciujących, może uwydatnić różne aspekty oddziaływań RNA z chromatyną. Podobnie jak w przypadku ChIP-seq, nie wszystkie zdarzenia wiązania sąkoniecznie funkcjonalne i wymagane są dodatkowe badania w celu ustalenia biologicznych konsekwencji obecności RNA na chromatynie. Niemniej jednak przewidujemy wiele interesujących zastosowań tej technologii dla badaczy innych lncRNA związanych z chromatyną, których liczba obecnie idzie w tysiące^8,9. Tak jak ChIP-seq otworzył drogę do genomowych badań nad oddziaływaniami DNA-białko, tak badania "interaktomu RNA" za pomocą ChIRP-seq mogą ujawnić wiele nowych kierunków w biologii.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Lista buforów:
Rozpuścić pellet kompletnego inhibitora proteaz w 1 ml wody jako roztwór stokowy 50x. Przygotować 100 mM PMSF w izopropanolu (roztwór stokowy 100x). Superase-in stosować jako roztwór stokowy 200x. Wszystkie odczynniki przechowywać w temperaturze -20 °C.
Bufor do lizy:
50 mM Tris-Cl pH 7.0 10 mM EDTA 1% SDS Zawsze dodawać świeży PMSF, inhibitor proteaz (P.I.) oraz Superase-in przed użyciem, z wyjątkiem etapu przemywania kulek
Bufor do Proteinazy K (dla DNA)
100 mM NaCl 10 mM TrisCl pH 8.0 (dla RNA stosować pH 7.0) 1 mM EDTA 0.5% SDS Przed użyciem dodać 5% objętościowo świeżej Proteinazy K (Ambion AM2546 20 mg/ml)
Bufor do hybrydyzacji
750 mM NaCl 1% SDS 50 mM Tris-Cl pH 7.0 1 mM EDTA 15% formamidu (przechowywać w ciemności w temperaturze 4 °C) Zawsze dodawać świeży PMSF, inhibitor proteaz (P.I.) oraz Superase-in przed użyciem
Bufor do przemywania
2x NaCl i cytrynian sodu (SSC) (rozcieńczony z roztworu stokowego 20x SSC Invitrogen) 0.5% SDS Zawsze dodawać świeży PMSF przed użyciem
Bufor do elucji DNA
50 mM NaHCO3 1% SDS
Tabela specyficznych odczynników i sprzętu:
Glutaraldehyd (klasa EM)	Sigma-Aldrich	G5882-10x10ml
Zmotoryzowany mieszalnik do pelletów	VWR international	V8185-904
Inhibitor proteaz	Roche Group	11873580001
PMSF	Sigma-Aldrich	78830
Superase-in	Ambion	AM2696
Bioruptor	Diagenode	UCD-200
Probówki Falcon (do sonikacji)	Corning	430790
Proteinaza K	Ambion	AM2546
Zestaw do oczyszczania PCR	Qiagen	28106
Magnetyczne kulki C-1	Invitrogen	65002
PMSF	Sigma-Aldrich	P7626-25G
Magnes DynaMag-15	Invitrogen	123-01D
Magnes DynaMag-2	Invitrogen	123-21D
Zestaw MIRNeasy mini	Qiagen	217004
Rnaza H	Epicentre Biotechnologies	R0601K
Rnaza A	Sigma-Aldrich	R4875-100MG
Phase Lock Gel Heavy	5 PRIME	2302810
Trizol	Invitrogen	15596-018
Fenol:chloroform:izoamylol	Invitrogen	15593-031
Chloroform	Ricca	RSOC0020-1C
GlycoBlue	Ambion	AM9515
Glicyna	JT Baker	4057-06
PBS, pH 7.4	Invitrogen	10010-049
Bufor do elucji (EB)	Qiagen	19086
20x SSC	Invitrogen	15557-036
10% SDS	Invitrogen	15553-027
Woda wolna od DNA	Ambion	AM1906
Zestaw buforów	Ambion	AM9010
Formamid	Invitrogen	15515-026