Artykuł metodologiczny

Opracowywanie tkanki pierwotnego guza mózgu do testów komórek macierzystych i sortowania przepływowego

16.6K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/4111

⸱

25 września 2012

 ,  ,  ,  , 
1Stem Cell and Cancer Research Institute, McMaster University

W tym artykule

Podsumowanie

Identyfikacja komórek inicjujących guz mózgu (BTICs), czyli rzadkich komórek w obrębie heterogennego guza posiadających właściwości komórek macierzystych, dostarcza nowych informacji na temat patogenezy nowotworów mózgu u ludzi. Zoptymalizowaliśmy specyficzne warunki hodowli w celu wzbogacenia populacji BTICs, a do dalszej selekcji tych populacji rutynowo wykorzystujemy cytometrię przepływową. Następnie w tych wyizolowanych komórkach można przeprowadzić testy samoodnawiania oraz analizę transkrypcji za pomocą RT-PCR pojedynczych komórek.

Streszczenie

Guzy mózgu składają się zazwyczaj z morfologicznie zróżnicowanych komórek wykazujących ekspresję wielu markerów linii neuronalnej. Tylko stosunkowo niewielka frakcja komórek w guzie o właściwościach komórek macierzystych, określanych jako komórki inicjujące guzy mózgu (BTICs), posiada zdolność do różnicowania się w wielu kierunkach, samoodnawiania oraz inicjowania guzów in vivo. Zastosowaliśmy warunki hodowli pierwotnie wykorzystywane dla normalnych neuronalnych komórek macierzystych (NSCs) w odniesieniu do różnych ludzkich guzów mózgu i stwierdziliśmy, że ta metoda hodowli specyficznie selekcjonuje populacje o charakterze macierzystym. Pożywka bezsurowicza (NSC) umożliwia utrzymanie nieróżnicowanego stanu komórek macierzystych, a dodatek bFGF i EGF pozwala na proliferację wielopotencjalnych, samoodnawiających się i ekspansywnych tumorsfer.

Aby dalej scharakteryzować populację BTIC w każdym guzie, oceniamy markery powierzchniowe komórek za pomocą cytometrii przepływowej. Możemy również sortować interesujące nas populacje w celu bardziej szczegółowej charakterystyki. Testy samoodnowienia przeprowadza się na pojedynczych komórkach BTIC posortowanych do płytek 96-dołkowych; tworzenie sfer nowotworowych po inkubacji w 37 °C wskazuje na obecność komórki macierzystej lub progenitorowej. Dla analizy rozcieńczeń ograniczających, w celu zbadania zdolności do samoodnowienia, do różnych dołków można posortować również różną liczbę komórek danej populacji. Możemy również badać różnicową ekspresję genów w konkretnej populacji komórek, stosując RT-PCR pojedynczych komórek.

Poniższe protokoły opisują nasze procedury dysocjacji i hodowli pierwotnych próbek ludzkich w celu wzbogacenia populacji BTIC, a także dysocjacji tumorsfer. Uwzględniono również protokoły barwienia do analizy cytometrii przepływowej lub sortowania, testy samoodnowy oraz RT-PCR pojedynczych komórek.

Wprowadzenie

Guzy mózgu należą do najbardziej agresywnych i heterogenicznych nowotworów znanych u ludzi. Choć ich wcześniejsze wykrywanie i diagnozowanie zostało ułatwione dzięki nowoczesnej technologii neuroobrazowania, wciąż brakuje nam terapii leczniczych dla wielu guzów mózgu, zwłaszcza tych rozsianych, naciekających lub zlokalizowanych głęboko w mózgu.

Guzy mózgu stanowią główną przyczynę śmiertelności z powodu nowotworów u dzieci ze względu na ich wysoce agresywny i często nieuleczalny charakter. Glejak wielopostaciowy (GBM), najczęstszy pierwotny nowotwór mózgu u dorosłych, jest jednym z najbardziej agresywnych nowotworów u ludzi, budzącym lęk ze względu na jednolicie fatalną prognozę1. Ten wysoce złośliwy nowotwór astrocytarny (stopień 4 wg WHO) występuje zazwyczaj w półkulach mózgu dorosłych, ale może pojawić się również u małych dzieci i niemowląt. Jego wzrost jest szybki i naciekający, a diagnostyczne cechy patologiczne obejmują pleomorfizm jąder komórkowych, proliferację mikro naczyniową oraz martwicę2,3. W przypadku dorosłych z nowo zdiagnozowanym GBM mediana przeżycia rzadko przekracza 12 miesięcy1, przy zazwyczaj słabej odpowiedzi na wszystkie metody terapeutyczne. Zauważyliśmy, że istnieje wiele podobieństw funkcjonalnych i genetycznych wspólnych dla somatycznych komórek macierzystych i komórek nowotworowych oraz że szlaki molekularne regulujące prawidłowy rozwój mózgu są często rozregulowane w nowotworach. Stosując paradygmaty biologii komórek macierzystych w badaniach nad guzami mózgu, byliśmy pierwszymi badaczami, którzy prospektywnie zidentyfikowali i wyizolowali subpopulację komórek z ludzkich GBM, wykazujących właściwości komórek macierzystych, takie jak proliferacja, samoodnawianie i różnicowanie in vitro4 oraz in vivo5. Zastosowaliśmy warunki hodowli i testy pierwotnie używane do charakteryzacji prawidłowych neuralnych komórek macierzystych (NSCs) in vitro 6,7 w odniesieniu do wielu nowotworów mózgu u dzieci i dorosłych, a następnie wzbogaciliśmy populację o te komórki macierzystopodobne poprzez sortowanie komórek pod kątem markera powierzchniowego komórek progenitorowych neuronów CD1338,9. Frakcja guza mózgu CD133+ zawierała komórki o znacznie wyższej częstotliwości inicjacji guza niż frakcja CD133- w mózgach myszy NOD-SCID5,10. Formalnie potwierdziło to, że tylko rzadki podzbiór komórek guza mózgu o właściwościach komórek macierzystych ma zdolność inicjowania guza, co przyniosło im nazwę „komórki inicjujące guz mózgu” (brain tumor initiating cells) lub „BTICs”. Nowa identyfikacja BTICs dostarcza nowych informacji na temat tumorigenezy ludzkiego mózgu, stanowiąc silne wsparcie dla hipotezy nowotworowych komórek macierzystych10-13 jako podstawy wielu guzów litych oraz wyznaczając nowy cel komórkowy dla skuteczniejszych terapii przeciwnowotworowych14-20. Terapie skupiające się na niszczeniu głównej masy guza mogą pominąć rzadką frakcję macierzystopodobną, co pozwala guzowi na dalszy wzrost. Terapie koncentrujące się na zabijaniu nowotworowych komórek macierzystych mogą zapewnić lepsze leczenie i rokowania dla pacjentów z guzami mózgu.

W celu zbadania populacji BTIC udoskonaliliśmy nasze protokoły hodowli, aby specyficznie wyselekcjonować populacje komórek w obrębie ludzkich guzów mózgu, które posiadają właściwości komórek macierzystych. Bezsierykowe pożywka dla neuralnych komórek macierzystych (NSC) umożliwia utrzymanie niedróżnicowanego stanu komórek macierzystych, a dodatek podstawowego czynnika wzrostu fibroblastów (bFGF), epidermalnego czynnika wzrostu (EGF) oraz czynnika hamującego białaczkę (LIF) pozwala na proliferację wielopotencjalnych, samoodnawiających się i ekspandowalnych ludzkich tumorsfer. W niniejszej pracy opisujemy metody przetwarzania pierwotnych guzów mózgu oraz ich hodowlę w pożywce NSC w celu wzbogacenia populacji BTIC. Nasz eksperymentalny system modelowy nazwaliśmy „izolatami pacjentów BTIC”, aby podkreślić fakt, że komórki te są hodowane w warunkach komórek macierzystych jedynie w minimalnym stopniu w celu selekcji populacji komórek macierzystych. Opisano również późniejsze znakowanie immunologiczne populacji BTIC w kierunku kluczowych markerów komórek macierzystych, takich jak CD133 i CD15, oraz analizę cytometryczną. Następnie omawiamy analizę rozcieńczeń ograniczających, która pomaga w badaniu potencjału samoodnowy BTIC. Na koniec analizujemy ekspresję genów tych rzadkich komórek poprzez sortowanie pojedynczych komórek na szkiełka AmpliGrid i przeprowadzanie RT-PCR pojedynczych komórek. Techniki te mają zastosowanie również w przypadku innych guzów mózgu, takich jak medulloblastoma, ependymoma i glejaki dziecięce.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Hodowla tkanki guza mózgu

  1. Do 15 ml sztucznego płynu mózgowo-rdzeniowego (aCSF – patrz Tabela 1) dodać 200 μl rozmrożonej Liberasy (Roche Applied Science) i umieścić w kąpieli wodnej o temperaturze 37 °C. Liberase TM jest mieszaniną enzymów proteolitycznych stosowaną do dysocjacji pierwotnych próbek tkanek, a także hodowlanych tumorsfer. W przeciwieństwie do trypsyny z EDTA, metoda z użyciem Liberasy pozwala zachować antygen powierzchniowy CD133. Dla próbki tkanki o objętości około 0,5 cm3 stosujemy 200 μl Liberasy. W przypadku mniejszej ilości tkanki stosujemy 100 μl.
  2. Doprowadzić roztwór chlorku amonu (Stem cell technologies) do temperatury pokojowej. Roztwór chlorku amonu łagodnie lysuje erytrocyty, wywierając minimalny wpływ na pozostałe komórki. Nie zawiera on utrwalacza.
  3. W sterylnej komorze z laminarnym przepływem powietrza dodać 5 ml aCSF do pojemnika z próbką, zamieszać okrężnie, aby wypłukać tkankę, a następnie odessać płyn pipetą. Ten krok pomaga usunąć erytrocyty (RBC).
  4. Przenieść tkankę guza mózgu do sterylnej szalki Petriego o średnicy 100 mm.
  5. Za pomocą precyzyjnych nożyczek lub skalpeli oraz pęsety rozdrobnić tkankę do konsystencji papki.
  6. Zebrać próbkę za pomocą zwykłej pipety 10 ml lub pęsety i przenieść fragmenty do probówki zawierającej uprzednio ogrzany aCSF z Liberasą.
  7. Umieścić na inkubatorze z wytrząsarką (30 rpm) w temperaturze 37 °C na 15 min.
  8. Przefiltrować lizat tkankowy przez sitko komórkowe 70 μm do probówki Falcon 50 ml.
  9. Odwirować filtrat z prędkością 280 x g przez 5 min.
  10. Ostrożnie usunąć nadsącz i ocenić wielkość oraz kolor powstałego osadu komórkowego: osady o kolorze różowym lub czerwonym wskazują na zwiększoną liczbę erytrocytów.
  11. Resuspendować osad w 1 ml PBS.
  12. Dodać odpowiednią ilość roztworu chlorku amonu (4-12 ml) w zależności od wielkości osadu i stopnia zanieczyszczenia erytrocytami (roztwór chlorku amonu jest bardzo łagodny, a zwiększone ilości nie są szkodliwe dla innych komórek niż erytrocyty).
  13. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 min.
  14. Odwirować komórki z prędkością 280 x g przez 5 min.
  15. Przemyć raz 10 ml sterylnego PBS.
  16. Resuspendować w 5 ml pełnej pożywki dla NSC (Tabela 2) i przenieść na płytkę hodowlaną 60 mm o ultra-niskim stopniu wiązania (Corning). Stosujemy płytki hodowlane o ultra-niskim stopniu wiązania z kowalencyjnie związanymi powierzchniami hydrożelowymi, które są hydrofilowe i obojętnie naładowane, aby zminimalizować różnicowanie komórek indukowane adhezją.

Przez pierwsze dni hodowli nie należy wymieniać pożywki: wyłącznie uzupełniać ją o 1-2 ml pożywki w razie potrzeby, a następnie kontynuować obserwację hodowli i wymienić pożywkę, gdy jej kolor stanie się lekko żółty.

2. Dysocjacja tumorsfer do cytometrii przepływowej

  1. Ocenić tumorsfery pod mikroskopem: jeśli rozmiar sfery wynosi >100 μm, zaleca się dysocjację, ponieważ większe sfery mogą ulec nekrozie w centrum.
  2. Przenieść kulturę do stożkowej probówki 15 ml.
  3. Dodać 2-3 ml sterylnego PBS, aby dokładnie wypłukać płytkę, i przenieść płyn do probówki stożkowej.
  4. Wirować przy 280 x g przez 5 min.
  5. Usunąć nadsącz i resuspendować w 1- 2 ml sterylnego PBS.
  6. Dodać 10 μl Liberazy.
  7. Inkubować w kąpieli wodnej w temperaturze 37 °C przez 3 min. Wyjąć i ocenić wizualnie zawiesinę; jeśli widoczne są liczne grudki, delikatnie triturować za pomocą końcówki do pipety 1 000 μl.
  8. Jeśli agregacja utrzyma się, kontynuować inkubację przez dodatkowe 1-2 min.
  9. Przemyć komórki, dodając 5 ml sterylnego PBS i wirując przy 280 x g przez 5 min.
  10. Usunąć nadsącz i resuspendować w 500-1 000 μl sterylnego PBS+2 mM EDTA.
  11. Ocenić liczbę i żywotność komórek z użyciem błękitu trypanu.
  12. Dostosować zagęszczenie komórek do 1 miliona/ml w PBS+2 mM EDTA.

3. Barwienie powierzchniowe

  1. Przenieś 100 μl zawiesiny komórek o stężeniu 1x106/ml na próbę do probówek do cytometrii przepływowej o wymiarach 12x75 mm.
  2. Dodaj odpowiednią ilość przeciwciał. Dla każdego przeciwciała należy zastosować dopasowane kontrole izotypowe (patrz Tabela 3).
  3. Inkubuj przez 30 min w lodzie.
  4. Dodaj 2 ml PBS+2 mM EDTA do każdej probówki.
  5. Wiruj przy 200 x g przez 4 min, odlej nadsącz i osusz.
  6. Resuspenduj osad w 300 μl PBS+2 mM EDTA.
  7. Dodaj 10 μl barwnika żywotności 7AAD do każdej probówki i inkubuj przez co najmniej 15 min w lodzie.
  8. Przeanalizuj metodą cytometrii przepływowej.

4. Akwizycja i analiza w cytometrii przepływowej

Szczegóły akwizycji i analizy danych z cytometrii przepływowej zależą od urządzenia. Przeprowadza się pomiary reprezentatywnych próbek negatywnych i ustala ustawienia instrumentu dla rozproszenia przedniego (rozmiar) oraz bocznego (ziarnistość). Taki wzorzec rozproszenia pozwala użytkownikowi końcowemu na obserwację wszystkich komórek w próbce, w tym zanieczyszczeń (debris). Zazwyczaj wykreśla się obszar (gate) wokół interesujących nas komórek. (Rycina 4a) Następnie ustala się ustawienia dla wszystkich detektorów fluorescencji, aby komórki negatywne znajdowały się w pierwszej dekadzie wykresu intensywności fluorescencji. W przypadku zastosowania więcej niż jednego barwnika lub fluorochromu, należy przeprowadzić pomiary kontroli barwionych pojedynczo w celu ustalenia wartości kompensacji barw (odejmowania interferujących emisji fluorescencji). Podczas pracy z żywymi komórkami stosuje się barwnik żywotności, taki jak 7-AAD (7-aminoaktynomycyna D – wzbudzenie 488/emisja 655), i wykreśla się drugi obszar w celu wykluczenia martwych komórek (Rycina 4b). Oba te obszary są stosowane w każdej dalszej analizie próbek.

5. Test samoodnowienia

Kluczowym testem, który jest znacznie ułatwiony przez klonalny wzrost sfer, jest test zdolności do samoodnowy in vitro, czyli test rozcieńczeń ograniczających (limiting dilution assay). Tumorsfery są dysocjowane i rozdzielane w rozcieńczeniach aż do poziomu jednej komórki na dołek, a następnie oblicza się częstość tworzenia sfer w ciągu 7 dni hodowli. W 7. dniu oblicza się procent dołków, w których nie powstały sfery, dla każdego zagęszczenia wysiewu komórek (F0), a następnie nanosi się te wartości na wykres w zależności od liczby komórek na dołek (x). Liczbę komórek niezbędną do utworzenia co najmniej jednej tumorsfery w każdym dołku określa się w punkcie, w którym linia przecina poziom 0,37 (F0 = e -x). W rozkładzie Poissona dla komórek wartość F0 = 0,37 odpowiada rozcieńczeniu jednej komórki na dołek, zatem to obliczenie (punkt przecięcia 37%) odzwierciedla częstość występowania klonogennych komórek macierzystych w całej populacji komórek (Rycina 5).

6. RT-PCR pojedynczej komórki

Pojedyncze komórki z różnych populacji są sortowane za pomocą urządzenia Beckman Coulter MoFlo XDP do miejsc reakcyjnych na płytce AmpliGrid (Beckman Coulter kat#AG480F). Jednokomórkowa RT-PCR jest przeprowadzana z użyciem systemu AmpliGrid Single One Step RT-PCR (Beckman Coulter kat#OAX04515) zgodnie ze specyfikacją producenta. W skrócie, pojedyncza komórka jest deponowana w każdym miejscu reakcyjnym płytki AmpliGrid; obecność pojedynczej komórki w każdym miejscu reakcyjnym jest potwierdzana mikroskopowo. Transkrypcja odwrotna (RT) jest przeprowadzana natychmiast po sortowaniu, aby zapobiec degradacji próbki. Master mix do RT jest przygotowywany na świeżo, zgodnie z instrukcją zestawu (Tabela 4). W każdej reakcji zastosowano 0,03 μl randomowych starterów 25 μM (Promega); 1 μl master mixu jest dodawany do centrum każdego miejsca reakcyjnego. Jest on natychmiast pokrywany 5 μl roztworu uszczelniającego (Beckman Coulter kat#OAX04503). Przy użyciu cyklera do płytek AmpliSpeed (Beckman Coulter; kat#OAX04101), płytki są inkubowane w temperaturze 25 °C przez 10 min, 42 °C przez 10 min oraz 55 °C przez 45 min. Po transkrypcji odwrotnej do każdego miejsca reakcyjnego dodaje się 3 μl wody wolnej od DNazy/RNazy, a całą mieszaninę przenosi się do probówki do PCR (1 probówka/miejsce). W płytce do PCR do ilościowej PCR stosowana jest objętość reakcyjna 10 μl: 8 μl qPCR master mix (5 μl Sybr Green (Quanta), 1 μl wody, 1 μl mieszaniny starterów forward i reverse 10 μM) oraz 2 μl mieszaniny RT. Do kwantyfikacji w czasie rzeczywistym próbki są analizowane w cyklerze BioRad zgodnie z następującym programem: 95 °C przez 10 min, 45 cykli: 95 °C przez 30 sec, 60 °C przez 60 sec, 72 °C przez 60 sec, a następnie 10 min w 72 °C i analiza krzywej topnienia. Wartości Ct określono za pomocą Opticon Monitor 3 (BioRad). W każdej komórce można ocenić trzy geny, w tym GAPDH jako gen referencyjny. Ekspresja genów jest normalizowana do ekspresji GAPDH zgodnie z metodą 2-ΔCt. Co najmniej tuzin pojedynczych komórek z tej samej populacji z tego samego sortowania może służyć jako powtórzenia biologiczne w celu zrekompensowania braku powtórzeń technicznych.

7. Reprezentatywne wyniki

Rysunek 1 przedstawia obraz z rezonansu magnetycznego (MRI) reprezentatywnego pacjenta z GBM. Próbki guza mózgu są pobierane od pacjentów, którzy wyrazili na to zgodę, bezpośrednio po operacji, zgodnie z zatwierdzeniem przez Komisję Etyki Badań Hamilton Health Sciences/McMaster Health Sciences. Część każdego preparatu przekazuje się neuropatologowi w celu rutynowej diagnozy klinicznej. Pozostałą część próbki przetwarza się zgodnie z opisem na Rysunku 2. Komórki nowotworowe, po wysianiu w pełnej pożywce dla neuralnych komórek macierzystych z dodatkiem czynników wzrostu, tworzą tumorsfery, co pokazano na Rysunku 3.

Komórki nowotworowe znakowano markerami powierzchniowymi neuralnych komórek macierzystych CD133 i CD15, a następnie poddano analizie metodą cytometrii przepływowej, co przedstawiono na Rysunku 4.

Pojedyncze komórki z różnych populacji, np. CD15+/CD133+, CD15+/CD133-, CD15-/CD133+, CD15-/CD133-, są następnie sortowane do płytek 96-dołkowych (Rycina 5a) lub na szkiełka AmpliGrid (Rycina 6a).

W płytce 96-dołkowej pojedyncze komórki posiadające zdolność do samoodnawiania (np. komórki CD133+), (Rycyna 5b), mogą tworzyć tumorsfery (Rycyna 5c) po inkubacji. Wykres samoodnawiania można wykreślić (Rycyna 5d), licząc liczbę sfer powstałych w każdym dołku. Pojedyncze komórki są sortowane do miejsca reakcji na szkiełku Ampligrid (Rycyna 6a). RNA wyekstrahowane z pojedynczych komórek może zostać poddane odwrotnej transkrypcji przy użyciu zestawu Advalytix AmpliSpeed (Rycyna 6b). Uzyskane cDNA służy do przeprowadzenia Real time RT-PCR (Rycyna 6c).

Skan MRI mózgu; widok osiowy wykazujący nieprawidłową masę. Obrazowanie diagnostyczne; narzędzie oceny neurologicznej.
Rycina 1. Obraz rezonansu magnetycznego (MRI) pacjentki z GBM. Skan MRI mózgu 16-letniej dziewczyny z miesięczną historią bólów głowy oraz tygodniową historią wymiotów, letargu i niewyraźnego widzenia. Sekwencja FLAIR w płaszczyźnie osiowej wykazuje duży dwupółkulowy („motyli”) GBM.

Dysocjacja tkanki w szalce Petriego (a), zestaw do inkubacji komórek z próbkami (b), eksperyment laboratoryjny.
Rycina 2. Przetwarzanie guza mózgu. Próbki guza mózgu pobierane są od pacjentów, którzy wyrazili zgodę, bezpośrednio po operacji. Są one dysocjowane mechanicznie, jak pokazano na zdjęciu (a), a następnie dysocjowane enzymatycznie w aCSF z dodatkiem Liberazy poprzez inkubację w inkubatorze kołyszącym przy 30 rpm w temperaturze 37 °C przez 15 min (b).

Kultury komórek macierzystych, obraz mikroskopowy, przedstawiający agregację komórkową w warunkach statycznych do celów badawczych.
Rycina 3. Populacje BTIC tworzą tumorsfery w hodowli. Rozdzielone komórki guza mózgu wysiane w pełnej pożywce dla neuralnych komórek macierzystych z czynnikami wzrostu tworzą tumorsfery.

Analiza cytometryczna; wykresy rozrzutu; bramkowanie komórek; schemat; fluorescencja; sprzęt laboratoryjny.
Rycina 4. Analiza cytometryczna populacji BTIC. (a) Właściwości rozproszenia światła w przód (FSC) oraz prostopadle (SSC) dają obraz wszystkich komórek, w tym debris. (b) Komórki barwiące się barwnikiem żywotności 7-AAD są wykluczane z analizy. (c) Położenie kwadrantów statystycznych jest wyznaczane przy użyciu odpowiednich kontroli izotypowych. (d) Komórki nowotworowe zabarwione markerami powierzchniowymi CD15-PE i CD133-APC. (d) Sorter komórek Moflo XDP. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną rycinę.

analiza na płytce 96-dołkowej, tworzenie neurosfer, obrazy mikroskopowe, analiza wykresu gęstości komórek
Rycina 5. Analiza rozcieńczeń ograniczających BTIC wykazuje ich zdolność do samoodnowy. (a) Komórki o różnych rozcieńczeniach są sortowane do 96 dołków zawierających 200 μl NSC do (b) jednej komórki na dołek. (c) Po 7-dniowym okresie inkubacji powstaje sfera nowotworowa. Morfologia wtórnych sfer nowotworowych jest identyczna z morfologią sfer pierwotnych. (d) Średnie wartości punktu przecięcia z osią x mogą zostać obliczone z analizy rozcieńczeń ograniczających dla każdego podtypu nowotworu, aby określić liczbę komórek niezbędną do utworzenia co najmniej jednej sfery nowotworowej w dołku.

Stanowisko PCR z systemami AmpliGrid i AmpliSpeed, przedstawiające wykres analizy cykli fluorescencji.
Rycina 6. Analiza ekspresji genów pojedynczej komórki BTIC jest możliwa dzięki technologii RT-PCR dla pojedynczych komórek. (a) Pojedyncze komórki z populacji BTIC mogą być sortowane na szkiełka AmpliGrid. (b) Synteza cDNA pojedynczych komórek na szkiełkach AmpliGrid jest przeprowadzana przy użyciu systemu Advalytix AmpliSpeed. (c) Ilościowa reakcja PCR w czasie rzeczywistym (qPCR) jest przeprowadzana na cDNA zsyntetyzowanym z pojedynczych komórek BTIC.

2M NaCl62 ml
1M KCl5 ml
1M MgCl23.2 ml
155 mM NaHCO3169 ml
1M Glukoza10 ml
108 mM CaCl20.9256 ml
Purelab Ultra H20749.84 ml

Tabela 1. Sztuczny płyn mózgowo-rdzeniowy (aCSF) - 1 000 ml.

Podstawowe medium stokowe500 ml
DMEM:F12 1:1480 ml
Suplement N25 ml
1M HEPES5 ml
Glukoza3.0 g
N-acetylocysteina (60 μg/ml)1 ml
Neural survival factor-1 (NSF-1)10 ml

Tabela 2. Pożywki dla neuralnych komórek macierzystych.

Pożywka kompletna NSC (przygotowana bezpośrednio przed użyciem):
podłożowe pożywka NSC + 20 ng/ml EGF (epidermalny czynnik wzrostu) + 20 ng/ml bFGF (podstawowy czynnik wzrostu fibroblastów) + 10 ng/ml LIF (białko hamujące białaczkę)* + 10 μl/ml antybiotyk-antymykotyk

*Czynnik hamujący białaczkę (LIF): Odczynnik ten firmy Millipore zawiera cytokinę z klasy interleukiny 6, białko, które hamuje spontaniczną różnicowanie się komórek macierzystych, sprzyjając dłutszemu utrzymaniu kultur komórek macierzystych.

PrzeciwciałaDostawca/nr KATμl/test (w 100 μl)
CD133/2 APC (293C3)Miltenyi Biotec/130-090-8545
IgG2b APC (Kontrola izotypowa)Miltenyi Biotec/130-092-2175
CD15PEBeckman Coulter/IM1954U5
IgG2a PE (Kontrola izotypowa)Beckman Coulter/A091415
7AADBeckman Coulter/A0770410

Tabela 3. Przeciwciała do cytometrii przepływowej.

SkładnikObjętość (1 reakcja)Objętość (48 reakcji)
2x bufor do reakcji RT pojedynczych komórek0.50 μl30.0 μl
Inhibitor RNazy (10 U/μl)0.02 μl1.2 μl
5X wzmacniacz RT do pojedynczych komórek0.15 μl9.00 μl
Mieszanina enzymów RT do pojedynczych komórek0.04 μl2.4 μl
Advablue (OAX04227)0.1 μl6.00 μl
Woda wolna od nukleazdopełnić do 1 μldopełnić do 60 μl

Tabela 4. Skład mieszaniny RT master mix do Single Cell RTPCR (kat# OAX04515).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Hipoteza komórek macierzystych nowotworu10, oparta na badaniach nad białaczką21, rakiem piersi11 oraz rakiem mózgu 4,5, sugeruje, że tylko stosunkowo niewielka frakcja komórek w guzie, określana jako komórki macierzyste nowotworu, posiada zdolność do intensywnej proliferacji i samoodnowy. Większość komórek nowotworowych traci zdolność do proliferacji i samoodnowy w miarę różnicowania się w komórki, które stanowią sygnaturę fenotypową guza. Zidentyfikowanie kluczowych komórek w ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Nie zgłoszono konfliktów interesów.

Podziękowania

Niniejsza praca została sfinansowana przez Ontario Institute of Cancer Research (OICR), Terry Fox Foundation oraz American Association of Neurological Surgeons.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
1:1 DMEM:F12Invitrogen11320-082
suplement N2Invitrogen17502-048
1M HEPESWisent Inc.330-050-EL
GlukozaInvitrogen15023-021
N-acetylocysteinaSigma-AldrichA9165-25g
czynnik przeżycia neuronów -1 (NSF-1)Lonza CloneticsCC-4323
epidermalny czynnik wzrostu (EGF)Sigma-AldrichE9644
podstawowy czynnik wzrostu fibroblastów (bFGF)InvitrogenPHG0261
leukemiczny czynnik hamujący (LIF)EMD MilliporeLIF1010
antybiotyk/antymykotykWisent Inc.450-115-EL
Liberase TMRoche Group05 401 119 001
roztwór chlorku amonuStem Cell Technologies07850

Bibliografia

  1. Ohgaki, H., Kleihues, P. Epidemiology and etiology of gliomas. Acta Neuropathol. 109, 93(2005).
  2. Huse, J. T., Holland, E. C. Targeting brain cancer: advances in the molecular pathology of malignant glioma. 10, 319(2010).
  3. Wechsler-Reya, R., Scott, M. P. The developmental biology of brain tumors. Annu. Rev. Neurosci. 24, 385(2001).
  4. Singh, S. K. Identification of a cancer stem cell in human brain tumors. Cancer Res. 63, 5821(2003).
  5. Singh, S. K. Identification of human brain tumour initiating cells. Nature. 432, 396(2004).
  6. Reynolds, B. A., Weiss, S. Clonal and population analyses demonstrate that an EGF-responsive mammalian embryonic CNS precursor is a stem cell. Dev. Biol. 175, 1(1996).
  7. Tropepe, V. Distinct neural stem cells proliferate in response to EGF and FGF in the developing mouse telencephalon. Dev. Biol. 208, 166(1999).
  8. Yin, A. H. AC133, a novel marker for human hematopoietic stem and progenitor cells. Blood. 90, 5002(1997).
  9. Yu, Y., Flint, A., Dvorin, E. L., Bischoff, J. AC133-2, a novel isoform of human AC133 stem cell antigen. J. Biol. Chem. 277, 20711(2002).
  10. Reya, T., Morrison, S. J., Clarke, M. F., Weissman, I. L. Stem cells, cancer, and cancer stem cells. Nature. 414, 105(2001).
  11. Al-Hajj, M. Prospective identification of tumorigenic breast cancer cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 100, 3983(2003).
  12. Bonnet, D., Dick, J. E. Human acute myeloid leukemia is organized as a hierarchy that originates from a primitive hematopoietic cell. Nat. Med. 3, 730(1997).
  13. Matsui, W. Characterization of clonogenic multiple myeloma cells. Blood. 103, 2332(2004).
  14. Bao, S. Targeting cancer stem cells through L1CAM suppresses glioma growth. Cancer Res. 68, 6043(2008).
  15. Bao, S. Glioma stem cells promote radioresistance by preferential activation of the DNA damage response. Nature. 444, 756(2006).
  16. Bao, S. Stem cell-like glioma cells promote tumor angiogenesis through vascular endothelial growth factor. Cancer Res. 66, 7843(2006).
  17. Beier, D. Temozolomide preferentially depletes cancer stem cells in glioblastoma. Cancer Res. 68, 5706(2008).
  18. Piccirillo, S. G. Distinct pools of cancer stem-like cells coexist within human glioblastomas and display different tumorigenicity and independent genomic evolution. Oncogene. 28, 1807(2009).
  19. Piccirillo, S. G. morphogenetic proteins inhibit the tumorigenic potential of human brain tumour-initiating cells. Nature. 444, 761(2006).
  20. Rich, J. N., Bao, S. Chemotherapy and cancer stem cells. Cell Stem Cell. 1, 353(2007).
  21. Lapidot, T. A cell initiating human acute myeloid leukaemia after transplantation into SCID mice. Nature. 367, 645(1994).
  22. Reya, T., Morrison, S. J., Clarke, M. F., Weissman, I. L. Stem cells, cancer, and cancer stem cells. Nature. 414, 105(2001).
  23. Fuchs, E., Segre, J. A. Stem cells: a new lease on life. Cell. 100, 143(2000).
  24. Weissman, I. L. Stem cells: units of development, units of regeneration, and units in evolution. Cell. 100, 157(2000).
  25. Reynolds, B. A., Weiss, S. Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system. Science. 255, 1707(1992).
  26. Reynolds, B. A., Tetzlaff, W., Weiss, S. A multipotent EGF-responsive striatal embryonic progenitor cell produces neurons and astrocytes. J. Neurosci. 12, 4565(1992).
  27. Hulett, H. R., Bonner, W. A., Barrett, J., Herzenberg, L. A. Cell sorting: automated separation of mammalian cells as a function of intracellular fluorescence. Science. 166, 747(1969).
  28. Kohler, G., Milstein, C. Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity. Nature. 256, 495(1975).
  29. Barrett, L. E. Self-renewal does not predict tumor growth potential in mouse models of high-grade glioma. Cancer Cell. 21, 11(2012).
  30. Venugopal, C. Bmi1 marks intermediate precursors during differentiation of human brain tumor initiating cells. Stem Cell Res. 8, 141(2012).
  31. Gerlinger, M. Intratumor heterogeneity and branched evolution revealed by multiregion sequencing. N. Engl. J. Med. 366, 883(2012).
  32. Gilbertson, R. J. Medulloblastoma: signalling a change in treatment. Lancet. Oncol. 5, 209(2004).
  33. Zhu, Y., Parada, L. F. The molecular and genetic basis of neurological tumours. Nat. Rev. Cancer. 2, 616(2002).
  34. Maher, E. A. Malignant glioma: genetics and biology of a grave matter. Genes Dev. 15, 1311(2001).
  35. Blake, W. J., KAErn, M., Cantor, C. R., Collins, J. J. Noise in eukaryotic gene expression. Nature. 422, 633(2003).
  36. Elowitz, M. B., Levine, A. J., Siggia, E. D., Swain, P. S. Stochastic gene expression in a single cell. Science. 297, 1183(2002).
  37. Maheshri, N., O'Shea, E. K. Living with noisy genes: how cells function reliably with inherent variability in gene expression. Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 36, 413(2007).
  38. Raj, A. Stochastic mRNA synthesis in mammalian cells. PLoS Biol. 4, e309(2006).
  39. Ross, I. L., Browne, C. M., Hume, D. A. Transcription of individual genes in eukaryotic cells occurs randomly and infrequently. Immunol. Cell Biol. 72, 177(1994).
  40. Kubista, M. The real-time polymerase chain reaction. Mol. Aspects Med. 27, 95(2006).
  41. Nolan, T., Hands, R. E., Bustin, S. A. Quantification of mRNA using real-time RT-PCR. Nat. Protoc. 1, 1559(2006).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Kom rki inicjuj ce guz m zgutworzenie sfer nowotworowychRT PCR pojedynczych kom rekanaliza cytometrii przep ywowejanaliza rozcie cze ograniczaj cychmedium bezsurowiczemarkery powierzchniowe kom rek

Powiązane artykuły