Method Article

Przetwarzanie pierwotnej tkanki guza mózgu do oznaczania komórek macierzystych i sortowania przepływowego

DOI:

10.3791/4111

⸱

September 25th, 2012

 ,  ,  ,  , 
1Stem Cell and Cancer Research Institute, McMaster University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Identyfikacja komórek inicjujących guz mózgu (BTIC), rzadkich komórek w heterogenicznym guzie posiadających właściwości komórek macierzystych, dostarcza nowych informacji na temat patogenezy guza mózgu u człowieka. Udoskonaliliśmy specyficzne warunki hodowli, aby wzbogacić je o BTIC, i rutynowo stosujemy cytometrię przepływową, aby jeszcze bardziej wzbogacić te populacje. Testy samoodnawiania i analiza transkryptu za pomocą RT-PCR pojedynczej komórki mogą być następnie przeprowadzone na tych izolowanych komórkach.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Guzy mózgu zazwyczaj składają się z morfologicznie zróżnicowanych komórek, które wyrażają różne markery linii nerwowej. Tylko stosunkowo niewielka część komórek w guzie o właściwościach komórek macierzystych, nazywanych komórkami inicjującymi guz mózgu (BTIC), posiada zdolność różnicowania się wzdłuż wielu linii, samoodnawiania się i inicjowania nowotworów in vivo. Zastosowaliśmy warunki hodowli pierwotnie stosowane dla normalnych nerwowych komórek macierzystych (NSC) do różnych ludzkich guzów mózgu i stwierdziliśmy, że ta metoda hodowli specyficznie selekcjonuje populacje podobne do łodyg. Pożywka bezsurowicowa (NSC) pozwala na utrzymanie niezróżnicowanego stanu komórek macierzystych, a dodatek bFGF i EGF pozwala na proliferację multipotencjalnych, samoodnawiających się i rozszerzających się guzów.

Aby dokładniej scharakteryzować populację BTIC każdego guza, oceniamy markery powierzchni komórek za pomocą cytometrii przepływowej. Możemy również sortować interesujące nas populacje w celu bardziej szczegółowej charakterystyki. Testy samoodnawiania przeprowadza się na pojedynczych BTIC posortowanych na 96-dołkowe płytki; tworzenie się guzów po inkubacji w temperaturze 37 °C wskazuje na obecność komórki macierzystej lub progenitorowej. Wiele numerów komórek w danej populacji można również sortować w różnych studzienkach w celu analizy rozcieńczenia ograniczającego, w celu analizy zdolności do samoodnawiania się. Możemy również badać różnicową ekspresję genów w określonej populacji komórek za pomocą RT-PCR pojedynczej komórki.

Poniższe protokoły opisują nasze procedury dysocjacji i hodowli pierwotnych próbek ludzkich w celu wzbogacenia populacji BTIC, a także dysocjacji guzów. Uwzględniono również protokoły barwienia do analizy lub sortowania metodą cytometrii przepływowej, testy samoodnawiania i RT-PCR z pojedynczymi komórkami.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Guzy mózgu należą do najbardziej agresywnych i niejednorodnych nowotworów znanych u ludzi. Chociaż ich wcześniejsze wykrycie i diagnoza zostały ułatwione dzięki nowoczesnej technologii neuroobrazowania, nadal brakuje nam terapii leczniczych dla wielu guzów mózgu, szczególnie dla guzów rozlanych, inwazyjnych lub tych zlokalizowanych głęboko w mózgu.

Guzy mózgu stanowią główną przyczynę śmiertelności z powodu nowotworów u dzieci ze względu na ich wysoce agresywny i często nieuleczalny charakter. Glejak wielopostaciowy (GBM), najczęstszy pierwotny guz mózgu u dorosłych, jest jednym z najbardziej agresywnych nowotworów u ludzi, budzącym obawy ze względu na jednolicie śmiertelne rokowanie1. Ten wysoce złośliwy nowotwór astrocytarny (stopień 4 WHO) zwykle występuje w półkulach mózgowych dorosłych, a także może wystąpić u małych dzieci i niemowląt. Jego wzrost jest szybki i naciekający, a diagnostyczne cechy patologiczne obejmują pleomorfizm jądrowy, proliferację mikronaczyń krwionośnych i martwicę2,3. U dorosłych z nowo rozpoznanym GBM mediana przeżycia rzadko przekracza 12miesięcy1, przy ogólnie słabej odpowiedzi na wszystkie metody terapeutyczne. Zauważyliśmy, że istnieje wiele funkcjonalnych i genetycznych podobieństw wspólnych dla somatycznych komórek macierzystych i komórek rakowych, oraz że szlaki molekularne, które regulują normalny rozwój mózgu, są często rozregulowane w raku. Stosując paradygmaty biologii komórek macierzystych do badania guzów mózgu, byliśmy pierwszymi badaczami, którzy prospektywnie zidentyfikowali i oczyścili subpopulację komórek z ludzkich GBM, które wykazywały właściwości komórek macierzystych proliferacji, samoodnawiania i różnicowania in vitro4 i in vivo5. Zastosowaliśmy warunki hodowli i testy pierwotnie używane do charakteryzowania normalnych nerwowych komórek macierzystych (NSC) in vitro 6,7 do wielu guzów mózgu u dzieci i dorosłych, i wzbogaciliśmy je o te komórki macierzyste przez sortowanie komórek pod kątem markera powierzchni nerwowych komórek progenitorowych CD1338,9. Frakcja guza mózgu CD133 + zawierała komórki, które miały znacznie wyższą częstotliwość inicjacji guza niż frakcja CD133- w mózgach myszy NOD-SCID5,10. To formalnie ustaliło, że tylko rzadki podzbiór komórek guza mózgu o właściwościach komórek macierzystych inicjuje nowotwór, dzięki czemu zyskały nazwę "komórki inicjujące guz mózgu" lub "BTIC". Nowatorska identyfikacja BTIC dostarcza nowych informacji na temat nowotworzenia ludzkiego mózgu, dając silne wsparcie dla hipotezy rakowych komórek macierzystych10-13 jako podstawy wielu guzów litych i ustanawia nowy cel komórkowy dla skuteczniejszych terapii przeciwnowotworowych14-20. Terapie, które koncentrują się na zabiciu większości guza, mogą pomijać rzadką frakcję przypominającą łodygę, co pozwala guzowi na dalszy wzrost. Terapie, które koncentrują się na zabijaniu nowotworowych komórek macierzystych, mogą zapewnić lepsze leczenie i rokowanie dla pacjentów z guzami mózgu.

Aby zbadać populacje BTIC, udoskonaliliśmy nasze protokoły hodowli, aby specjalnie wybrać populacje komórek w ludzkich guzach mózgu, które mają właściwości komórek macierzystych. Pozbawiona surowicy pożywka dla nerwowych komórek macierzystych (NSC) pozwala na utrzymanie niezróżnicowanego stanu komórek macierzystych, a dodanie podstawowego czynnika wzrostu fibroblastów (bFGF), naskórkowego czynnika wzrostu (EGF) i czynnika hamującego białaczkę (LIF) pozwala na proliferację wielu silnych, samoodnawiających się i rozszerzających się ludzkich guzów. W tym miejscu opisujemy metody związane z przetwarzaniem pierwotnych guzów mózgu i hodowlą ich w pożywce NSC w celu wzbogacenia populacji BTIC. Nazwaliśmy nasz eksperymentalny system modelowy "izolatami pacjentów BTIC", aby podkreślić fakt, że komórki te są tylko minimalnie hodowane w warunkach komórek macierzystych w celu selekcji populacji komórek macierzystych. Opisano również późniejsze znakowanie immunologiczne populacji BTIC pod kątem kluczowych markerów komórek macierzystych, takich jak CD133 i CD15, oraz analizę cytometrii przepływowej. Następnie omawiamy analizę rozcieńczenia granicznego, która pomaga w badaniu potencjału BTIC do samoodnawiania się. Na koniec badamy analizę ekspresji genów tych rzadkich komórek, sortując pojedyncze komórki na szkiełkach AmpliGrid i wykonując RT-PCR pojedynczej komórki. Techniki te mają również zastosowanie do innych nowotworów mózgu, takich jak rdzeniak zarodkowy, wyściółczak i glejaki dziecięcy.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Hodowla tkanki guza mózgu

  1. Dodać 200 μl rozmrożonej liberazy (Roche Applied Science) do 15 ml sztucznego płynu mózgowo-rdzeniowego (aCSF - patrz tabela 1) i umieścić w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C. Liberase TM jest mieszanką enzymów proteolitycznych stosowanych do dysocjacji pierwotnych próbek tkanek, a także hodowanych guzów. W przeciwieństwie do trypsyny-EDTA, metoda Liberazy zachowuje antygen powierzchniowy CD133. Do próbki tkanki o wielkości około 0,5cm3 używamy 200 μl Liberazy. Jeśli tkanka jest mniejsza, używamy 100 ul.
  2. Doprowadzić roztwór chlorku amonu (technologie komórek macierzystych) do temperatury pokojowej. Roztwór chlorku amonu delikatnie lizuje czerwone krwinki przy minimalnym wpływie na inne komórki. Nie zawiera utrwalacza.
  3. W sterylnej komorze bezpieczeństwa biologicznego dodać 5 ml CSF do pojemnika na próbkę, zawirować, aby spłukać tkankę, a następnie odpipetować. Ten krok pomaga usunąć czerwone krwinki (RBC).
  4. Przenieś tkankę guza mózgu na sterylną 100-milimetrową szalkę Petriego.
  5. Za pomocą cienkich nożyczek lub skalpeli i kleszczy zdezagreguj tkankę do konsystencji zawiesiny.
  6. Pobrać próbkę za pomocą zwykłej pipety lub kleszczyków o pojemności 10 ml i przenieść jej fragmenty do probówki zawierającej wstępnie podgrzany płyn CSF z Liberazą.
  7. Umieścić na inkubatorze-wytrząsarce (30 obr./min) i ustawić na 37 °C na 15 min.
  8. Przefiltrować lizat tkankowy przez sitko komórkowe o wielkości 70 μm do probówki Falcon o pojemności 50 ml.
  9. Wirować filtrat w temperaturze 280 x g przez 5 minut.
  10. Ostrożnie usunąć supernatant i ocenić wielkość i kolor otrzymanej osadu komórkowego: różowe lub czerwone osadki wskazują na rosnącą liczbę czerwonych krwinek.
  11. Zawiesić osad w 1 ml PBS.
  12. Dodać odpowiednią ilość roztworu chlorku amonu (4-12 ml) w zależności od wielkości osadu i zanieczyszczenia krwinkami czerwonymi (roztwór chlorku amonu jest bardzo delikatny, a zwiększone ilości nie są szkodliwe dla komórek innych niż krwinki czerwone).
  13. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 minut.
  14. Wiruj komórki w dół przy 280 x g przez 5 minut.
  15. Przemyć raz 10 ml sterylnego PBS.
  16. Zawiesić ponownie w 5 ml kompletnej pożywki NSC (Tabela 2) i przenieść na płytkę do hodowli tkankowej o bardzo niskim poziomie wiązania 60 mm (Corning). Używamy płytek hodowlanych o bardzo niskim poziomie wiązania z kowalencyjnie związanymi powierzchniami hydrożelowymi, które są hydrofilowe i naładowane neutralnie, aby zminimalizować różnicowanie za pośrednictwem przyczepu komórek.

Przez pierwsze dni w hodowli nie zmieniaj pożywki: w razie potrzeby uzupełnij tylko 1-2 ml pożywki, a następnie kontynuuj obserwację kultury i zmień pożywkę, gdy kolor pożywki stanie się lekko żółty.

2. Dysocjacja guza w cytometrii przepływowej

  1. Oceń guzy pod mikroskopem: jeśli rozmiar kuli wynosi >100 μm, zalecana jest dysocjacja, ponieważ większe kule mogą stać się martwicze w środku.
  2. Przenieść kulturę do stożkowej probówki o pojemności 15 ml.
  3. Dodać 2-3 ml sterylnego PBS do dokładnego wypłukania płytki i dodać do stożkowej probówki.
  4. Wirować przy 280 x g przez 5 min.
  5. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić w 1-2 ml sterylnego PBS.
  6. Dodać 10 μl leku Liberase.
  7. Inkubować w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C przez 3 minuty. Usuń i oceń wzrokowo zawiesinę, jeśli widocznych jest wiele grudek, delikatnie rozetrzyj za pomocą końcówki do pipety o pojemności 1 000 μl.
  8. Jeśli zbrylanie się będzie się utrzymywać, kontynuuj inkubację przez dodatkowe 1-2 minuty.
  9. Przemyć komórki, dodając 5 ml sterylnego PBS i odwirowując przy 280 x g przez 5 minut.
  10. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić w 500-1 000 μl sterylnego PBS+2 mM EDTA.
  11. Oceń liczbę komórek i żywotność za pomocą błękitu trypanowego.
  12. Dostosuj liczbę komórek do 1 miliona/ml w PBS+2 mM EDTA.

3. Barwienie powierzchni

  1. Przenieść 100 μl zawiesiny komórek 1x106/ml na test do probówek przepływowych o wymiarach 12x75 mm.
  2. Dodaj odpowiednią ilość przeciwciał. Dla każdego przeciwciała należy stosować dopasowane kontrole izotypu (patrz Tabela 3).
  3. Inkubować przez 30 minut na lodzie.
  4. Dodać 2 ml PBS+2 mM EDTA do każdej probówki przepływowej.
  5. Wirować przy 200 x g przez 4 minuty, zdekantować i osuszyć.
  6. Zawiesić osad w 300 μl PBS+2 mM EDTA.
  7. Do każdej probówki dodać 10 μl barwnika żywotności 7AAD i inkubować przez co najmniej 15 minut na lodzie.
  8. Analiza za pomocą cytometrii przepływowej.

4. Akwizycja i analiza cytometrii przepływowej

Specyfika pozyskiwania i analizy danych o przepływie jest zależna od urządzenia. Przeprowadza się reprezentatywne próbki ujemne i ustala ustawienia przyrządów dla rozproszenia do przodu (rozmiar) i z boku (ziarnistość). Ten wzór rozproszenia umożliwia użytkownikowi końcowemu wyświetlenie wszystkich komórek w próbce, w tym zanieczyszczeń. Region jest zwykle rysowany wokół interesujących komórek. (Rysunek 4a) Następnie ustalane są ustawienia dla wszystkich detektorów fluorescencji wymaganych do umiejscowienia komórek ujemnych w ciągu pierwszej dekady wykresu intensywności fluorescencji. Gdy stosuje się więcej niż jeden barwnik lub fluorochrom, należy uruchomić pojedyncze barwione kontrole w celu ustalenia wartości kompensacji koloru (odejmowanie zakłócających emisji fluorescencji). Podczas uruchamiania żywych komórek stosuje się barwnik żywotności, taki jak 7-AAD (7-amino-aktynomycyna D - wzbudzenie 488 / emisja 655) i drugi region rysowany w celu wykluczenia martwych komórek (ryc. 4b). Oba te obszary stosuje się do wszelkich dalszych analiz próbek.

5. Test samoodnawiania

Kluczowym testem, który jest znacznie ułatwiony przez wzrost sfery klonalnej, jest test in vitro zdolności do samoodnawiania, test ograniczającego rozcieńczenia. Guzy są dysocjowane i rozprowadzane w rozcieńczeniach do jednej komórki na studzienkę, a następnie oblicza się szybkość tworzenia się kulek w ciągu 7 dni w hodowli. W dniu 7 oblicza się procent studzienek niezawierających kulek dla każdej gęstości posiewu komórek (F0) i wykreśla się go w stosunku do liczby komórek na studzienkę (x). Liczbę komórek potrzebnych do utworzenia co najmniej jednej kuli nowotworowej w każdym studzience określa się od punktu, w którym linia przecina poziom 0,37 (F0 = e -x). W rozkładzie Poissona komórek F0 = 0,37 odpowiada rozcieńczeniu jednej komórki na studzienkę, tak że to obliczenie (przecięcie 37%) odzwierciedla częstość występowania klonogennych komórek macierzystych w całej populacji komórek (ryc. 5).

6. Jednokomórkowy RT-PCR

Pojedyncze komórki z różnych populacji są sortowane za pomocą Beckman Coulter MoFlo XDP w miejscach reakcji na szkiełku AmpliGrid (Beckman Coulter cat#AG480F). Jednokomórkowy RT-PCR wykonywany jest przy użyciu systemu AmpliGrid Single One Step RT-PCR (Beckman Coulter cat#OAX04515) zgodnie ze specyfikacją producenta. Krótko mówiąc, pojedyncza komórka jest umieszczana w każdym miejscu reakcji szkiełka AmpliGrid; obecność pojedynczej komórki w każdym miejscu reakcji potwierdzona pod mikroskopem. Odwrotna transkrypcja (RT) jest wykonywana natychmiast po sortowaniu, aby zapobiec naruszeniu próbki. Mieszankę główną RT przygotowuje się na świeżo, zgodnie z instrukcją zestawu (tabela 4). Użyliśmy 0,03 μl 25 μM losowych starterów (Promega) na reakcję; Do środka każdego miejsca reakcji dodaje się 1 μl mieszanki wzorcowej. Jest on natychmiast pokryty 5 μl roztworu uszczelniającego (Beckman Coulter cat#OAX04503). Za pomocą cyklera do szkiełek AmpliSpeed (Beckman Coulter; kat#OAX04101), szkiełka są inkubowane w temperaturze 25 °C przez 10 minut, 42 °C przez 10 minut i 55 °C przez 45 minut. Po odwrotnej transkrypcji do każdego miejsca reakcji dodaje się 3 μl wody wolnej od DNazy/RNaz, a całą mieszaninę przenosi się do probówki PCR (1 probówka/miejsce). Na płytce PCR do ilościowego PCR stosuje się objętość reakcyjną 10 μl: 8 μl qPCR master mix (5 μl Sybr Green (Quanta), 1 μl wody, 1 μl 10 μM mieszanki startera do przodu i do tyłu) plus 2 μl mieszaniny RT. W celu ilościowego określenia w czasie rzeczywistym próbki są uruchamiane na cyklerze BioRad przy użyciu następującego programu: 95 °C przez 10 minut, 45 cykli po 95 °C przez 30 sekund, 60 °C przez 60 sekund, 72 °C przez 60 sekund, a następnie 10 minut w temperaturze 72 °C i analiza krzywej topnienia. Wartości Ct oznaczono za pomocą Opticon Monitor 3 (BioRad). W każdej komórce można ocenić trzy geny, w tym GAPDH jako gen porządkowy. Ekspresja genów jest znormalizowana do ekspresji GAPDH, zgodnie z 2-ΔCt. Co najmniej tuzin pojedynczych komórek tej samej populacji z tego samego rodzaju może być użytych jako kontrpróby biologiczne w celu zrekompensowania braku kontrprób technicznych.

7. Reprezentatywne wyniki

Rycina 1 przedstawia skan rezonansu magnetycznego (MRI) reprezentatywnego pacjenta z GBM. Próbki guza mózgu są pobierane od pacjentów, którzy wyrazili na to zgodę natychmiast po operacji, zgodnie z aprobatą Rady ds. Etyki Badań Naukowych Hamilton Health Sciences/McMaster Health Sciences. Część każdej próbki jest przekazywana neuropatologowi w celu rutynowej diagnozy klinicznej. Pozostałą próbkę przetwarza się w sposób pokazany na rysunku 2. Komórki nowotworowe, po posianiu w kompletnym pożywce nerwowych komórek macierzystych z czynnikami wzrostu, tworzą guzy, jak pokazano na rycinie 3.

Komórki nowotworowe są znakowane markerami komórek macierzystych powierzchni nerwowej CD133 i CD15 i analizowane za pomocą cytometrii przepływowej, jak pokazano na rycinie 4.

Pojedyncze komórki z różnych populacji, np . CD15+/CD133+, CD15+/CD133-, CD15-/CD133+, CD15-/CD133- są następnie sortowane na płytki 96-dołkowe (Figura 5a) lub na szkiełka AmpliGrid (Figura 6a).

Na 96-dołkowej płytce pojedyncze komórki, które mają zdolność do samoodnawiania się (np. Komórki CD133+) (Figura 5b), mogą tworzyć guzy (Figura 5c) po inkubacji. Wykres samoodnawiania się można wykreślić (rysunek 5d), zliczając liczbę kulek utworzonych w każdym dołku. Pojedyncze komórki posortowane w miejscu reakcji szkiełka Ampligrid (ryc. 6a). RNA wyekstrahowane z pojedynczych komórek można poddać odwrotnej transkrypcji za pomocą Advalytix AmpliSpeed (Figura 6b). Uzyskane cDNA służy do przeprowadzania RT-PCR w czasie rzeczywistym (Figura 6c).

figure-protocol-1
Rysunek 1. Obraz rezonansu magnetycznego (MRI) pacjenta z GBM. Rezonans magnetyczny mózgu 16-letniej dziewczyny z miesięczną historią bólu głowy i tygodniową historią wymiotów, letargu i niewyraźnego widzenia. Osiowa sekwencja FLAIR pokazuje duży bi-półkulowy ("motyl") GBM.

figure-protocol-2
Rysunek 2. Przetwarzanie guza mózgu. Próbki guza mózgu są pobierane od pacjentów, którzy wyrazili na to zgodę natychmiast po operacji. Są one mechanicznie dysocjowane, jak pokazano (a), a następnie są enzymatycznie dysocjowane w aCSF z liberazą przez inkubację w inkubatorze kołyszącym o prędkości 30 obr./min w temperaturze 37 °C przez 15 minut (b).

figure-protocol-3
Rysunek 3. Populacje BTIC tworzą guzy w kulturze. Zdysocjowane komórki guza mózgu posiane w kompletnym pożywce nerwowych komórek macierzystych z czynnikami wzrostu tworzą guzy.

figure-protocol-4
Rysunek 4. Analiza cytometryczna przepływowa populacji BTIC. (a) Właściwości rozproszenia do przodu i bocznego zapewniają obraz wszystkich komórek, w tym szczątków (b) Komórki, które barwią się barwnikiem żywotności 7-AAD, są wyłączone z analizy. (c) Położenie kwadrantów statystycznych określa się za pomocą odpowiednich kontroli izotypu; (d) Komórki nowotworowe barwione markerami powierzchniowymi CD15-PE i CD133-APC. (d) Sortownik komórek Moflo XDP. Kliknij tutaj, aby powiększyć rysunek.

figure-protocol-5
Rysunek 5. Analiza ograniczonego rozcieńczenia BTIC ujawnia ich zdolność do samoodnawiania się. (a) Komórki o różnych rozcieńczeniach sortuje się do 96 studzienek zawierających 200 μl NSC do (b) pojedynczej komórki na studzienkę. (c) Po 7-dniowym okresie inkubacji tworzy się guz. Morfologia guzów wtórnych jest identyczna z morfologią guzów pierwotnych. (d) Średnie wartości punktu przecięcia z osią x można obliczyć na podstawie analizy rozcieńczenia granicznego dla każdego podtypu nowotworu, aby ujawnić liczbę komórek wymaganych do utworzenia co najmniej jednej kuli nowotworowej na studzienkę.

figure-protocol-6
Rysunek 6. Analiza ekspresji genów pojedynczej komórki BTIC jest możliwa przy użyciu technologii RT-PCR dla pojedynczej komórki. (a) Pojedyncze komórki z populacji BTIC można sortować na szkiełkach AmpliGrid. (b) syntezę cDNA przeprowadza się na pojedynczych komórkach na szkiełkach AmpliGrid przy użyciu Advalytix AmpliSpeed. (c) Ilościowy PCR w czasie rzeczywistym przeprowadza się na cDNA zsyntetyzowanym z pojedynczych komórek BTIC.

2M NaClPojemność 62 ml
1M KClPojemność 5 ml
1M MgCl23,2 ml
155 mM NaHCO3Pojemność 169 ml
1 mln glukozyPojemność 10 ml
108 mM CaCl2Pojemność 0,9256 ml
Purelab Ultra H20749,84 ml

Tabela 1. Sztuczny płyn mózgowo-rdzeniowy (aCSF) - 1 000 ml.

Standardowe podłoże podstawowePojemność 500 ml
1:1 DMEM:F12Pojemność 480 ml
Suplement N2Pojemność 5 ml
1M FILTRPojemność 5 ml
Glukoza3,0 gr
N-acetylocysteina (60 μg/ml)Pojemność 1 ml
Czynnik przeżycia neuronalnego-1 (NSF-1)Pojemność 10 ml

Tabela 2. Pożywka dla nerwowych komórek macierzystych.

Kompletne podłoża NSC (świeże przed użyciem):
Pożywka podstawowa NSC + 20 ng/ml EGF (naskórkowy czynnik wzrostu) + 20 ng/ml bFGF (zasadowy czynnik wzrostu fibroblastów) + 10 ng/ml LIF (czynnik hamujący białaczkę)* + 10 μl/ml antybiotyk-antybiotyk przeciwgrzybiczy

*Czynnik hamujący białaczkę (LIF): Ten odczynnik firmy Millipore zawiera cytokinę klasy interleukiny 6, białko, które hamuje spontaniczne różnicowanie komórek macierzystych, sprzyjając długotrwałemu utrzymaniu kultur komórek macierzystych.

PrzeciwciałaDostawca/CAT#μl/test (w 100 μl)
Transporter opancerzony CD133/2 (293C3)Miltenyi Biotec/130-090-8545
IgG2b APC (kontrola izotypu)Miltenyi Biotec/130-092-2175
Płyta CD15PEBeckman Coulter/IM1954U5
IgG2a PE (kontrola izotypu)Beckman Coulter/A091415
7AAD powiedział:Beckman Coulter/A0770410

Tabela 3. Przeciwciała przepływowe.

SkładnikObjętość (1 reakcja)Objętość ( 48 reakcji)
2x jednokomórkowy bufor reakcyjny RT0,50 μl30,0 μl
Inhibitor RNazy (10 U/μl)0,02 μl1,2 μl
5-krotny wzmacniacz jednokomórkowy RT0,15 μl9,00 μl
Jednokomórkowa mieszanka enzymów RT0,04 μl2,4 μl
Advablue (OAX04227)0,1 μl6,00 μl
Woda wolna od nukleazuzupełnić do 1 μluzupełnić do 60 μl

Tabela 4. Skład głównej mieszanki RT dla jednokomórkowego RTPCR (kat# OAX04515).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hipoteza rakowych komórek macierzystych10, oparta na pracach nad białaczką21, rakiem piersi11 i rakiem mózgu 4,5, sugeruje, że tylko stosunkowo niewielka frakcja komórek w guzie, zwana rakowymi komórkami macierzystymi, posiada zdolność do intensywnej proliferacji i samoodnawiania. Większość komórek nowotworowych traci zdolność do proliferacji i samoodnawiania się, gdy różnicują się w komórki, które stają się fenotypową sygnaturą guza. Znalezienie kluczowych komórek w populacji ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nie stwierdzono konfliktu interesów.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Praca ta została sfinansowana przez Ontario Institute of Cancer Research (OICR), Fundację Terry'ego Foxa i Amerykańskie Stowarzyszenie Chirurgów Neurologicznych.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
1:1 DMEM:F12Invitrogen11320-082
Suplement N2Invitrogen17502-048
1M FILTRŻubr Inc.330-050-EL
GlukozaInvitrogen15023-021
N-acetylocysteinaSigma-AldrichA9165-25G
Czynnik przeżycia neuronalnego -1 (NSF-1)Klonetycy LonzaCC-4323 powiedział:
Naskórkowy czynnik wzrostu (EGF)Sigma-AldrichNumer katalogowy E9644
Podstawowy czynnik wzrostu fibroblastów (bFGF)InvitrogenPHG0261
Czynnik hamujący białaczkę (LIF)EMD MiliporeLIF1010
Antybiotyk/grzybicaŻubr Inc.450-115-EL
Liberaza TMGrupa Roche05 401 119 001
Roztwór chlorku amonuTechnologie komórek macierzystych07850

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Ohgaki, H., Kleihues, P. Epidemiology and etiology of gliomas. Acta Neuropathol. 109, 93(2005).
  2. Huse, J. T., Holland, E. C. Targeting brain cancer: advances in the molecular pathology of malignant glioma. 10, 319(2010).
  3. Wechsler-Reya, R., Scott, M. P. The developmental biology of brain tumors. Annu. Rev. Neurosci. 24, 385(2001).
  4. Singh, S. K. Identification of a cancer stem cell in human brain tumors. Cancer Res. 63, 5821(2003).
  5. Singh, S. K. Identification of human brain tumour initiating cells. Nature. 432, 396(2004).
  6. Reynolds, B. A., Weiss, S. Clonal and population analyses demonstrate that an EGF-responsive mammalian embryonic CNS precursor is a stem cell. Dev. Biol. 175, 1(1996).
  7. Tropepe, V. Distinct neural stem cells proliferate in response to EGF and FGF in the developing mouse telencephalon. Dev. Biol. 208, 166(1999).
  8. Yin, A. H. AC133, a novel marker for human hematopoietic stem and progenitor cells. Blood. 90, 5002(1997).
  9. Yu, Y., Flint, A., Dvorin, E. L., Bischoff, J. AC133-2, a novel isoform of human AC133 stem cell antigen. J. Biol. Chem. 277, 20711(2002).
  10. Reya, T., Morrison, S. J., Clarke, M. F., Weissman, I. L. Stem cells, cancer, and cancer stem cells. Nature. 414, 105(2001).
  11. Al-Hajj, M. Prospective identification of tumorigenic breast cancer cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 100, 3983(2003).
  12. Bonnet, D., Dick, J. E. Human acute myeloid leukemia is organized as a hierarchy that originates from a primitive hematopoietic cell. Nat. Med. 3, 730(1997).
  13. Matsui, W. Characterization of clonogenic multiple myeloma cells. Blood. 103, 2332(2004).
  14. Bao, S. Targeting cancer stem cells through L1CAM suppresses glioma growth. Cancer Res. 68, 6043(2008).
  15. Bao, S. Glioma stem cells promote radioresistance by preferential activation of the DNA damage response. Nature. 444, 756(2006).
  16. Bao, S. Stem cell-like glioma cells promote tumor angiogenesis through vascular endothelial growth factor. Cancer Res. 66, 7843(2006).
  17. Beier, D. Temozolomide preferentially depletes cancer stem cells in glioblastoma. Cancer Res. 68, 5706(2008).
  18. Piccirillo, S. G. Distinct pools of cancer stem-like cells coexist within human glioblastomas and display different tumorigenicity and independent genomic evolution. Oncogene. 28, 1807(2009).
  19. Piccirillo, S. G. morphogenetic proteins inhibit the tumorigenic potential of human brain tumour-initiating cells. Nature. 444, 761(2006).
  20. Rich, J. N., Bao, S. Chemotherapy and cancer stem cells. Cell Stem Cell. 1, 353(2007).
  21. Lapidot, T. A cell initiating human acute myeloid leukaemia after transplantation into SCID mice. Nature. 367, 645(1994).
  22. Reya, T., Morrison, S. J., Clarke, M. F., Weissman, I. L. Stem cells, cancer, and cancer stem cells. Nature. 414, 105(2001).
  23. Fuchs, E., Segre, J. A. Stem cells: a new lease on life. Cell. 100, 143(2000).
  24. Weissman, I. L. Stem cells: units of development, units of regeneration, and units in evolution. Cell. 100, 157(2000).
  25. Reynolds, B. A., Weiss, S. Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system. Science. 255, 1707(1992).
  26. Reynolds, B. A., Tetzlaff, W., Weiss, S. A multipotent EGF-responsive striatal embryonic progenitor cell produces neurons and astrocytes. J. Neurosci. 12, 4565(1992).
  27. Hulett, H. R., Bonner, W. A., Barrett, J., Herzenberg, L. A. Cell sorting: automated separation of mammalian cells as a function of intracellular fluorescence. Science. 166, 747(1969).
  28. Kohler, G., Milstein, C. Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity. Nature. 256, 495(1975).
  29. Barrett, L. E. Self-renewal does not predict tumor growth potential in mouse models of high-grade glioma. Cancer Cell. 21, 11(2012).
  30. Venugopal, C. Bmi1 marks intermediate precursors during differentiation of human brain tumor initiating cells. Stem Cell Res. 8, 141(2012).
  31. Gerlinger, M. Intratumor heterogeneity and branched evolution revealed by multiregion sequencing. N. Engl. J. Med. 366, 883(2012).
  32. Gilbertson, R. J. Medulloblastoma: signalling a change in treatment. Lancet. Oncol. 5, 209(2004).
  33. Zhu, Y., Parada, L. F. The molecular and genetic basis of neurological tumours. Nat. Rev. Cancer. 2, 616(2002).
  34. Maher, E. A. Malignant glioma: genetics and biology of a grave matter. Genes Dev. 15, 1311(2001).
  35. Blake, W. J., KAErn, M., Cantor, C. R., Collins, J. J. Noise in eukaryotic gene expression. Nature. 422, 633(2003).
  36. Elowitz, M. B., Levine, A. J., Siggia, E. D., Swain, P. S. Stochastic gene expression in a single cell. Science. 297, 1183(2002).
  37. Maheshri, N., O'Shea, E. K. Living with noisy genes: how cells function reliably with inherent variability in gene expression. Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 36, 413(2007).
  38. Raj, A. Stochastic mRNA synthesis in mammalian cells. PLoS Biol. 4, e309(2006).
  39. Ross, I. L., Browne, C. M., Hume, D. A. Transcription of individual genes in eukaryotic cells occurs randomly and infrequently. Immunol. Cell Biol. 72, 177(1994).
  40. Kubista, M. The real-time polymerase chain reaction. Mol. Aspects Med. 27, 95(2006).
  41. Nolan, T., Hands, R. E., Bustin, S. A. Quantification of mRNA using real-time RT-PCR. Nat. Protoc. 1, 1559(2006).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Brain Tumor TissueStem Cell AssaysFlow SortingBrain Tumor Initiating CellsTumorsphere FormationSingle Cell RT PCRFlow Cytometry AnalysisLimiting Dilution AnalysisSerum Free MediumCell Surface Markers

Related Articles