Artykuł metodologiczny

Linie komórkowe ludzkich guzów neuroendokrynnych jako trójwymiarowy model do badania terapii ludzkich guzów neuroendokrynnych

31.2K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/4218

⸱

14 sierpnia 2012

 ,  ,  ,  , 
1Raymond and Beverly Sackler Foundation, 2The Cancer Institute of New Jersey, University of Medicine and Dentistry of New Jersey, 3School of Natural Sciences, Institute for Advanced Study, Princeton, New Jersey

W tym artykule

Podsumowanie

Przedstawiamy prostą platformę z nakładką z agarozy do hodowli trójwymiarowych wielokomórkowych sferoidów z wykorzystaniem linii komórkowych raka neuroendokrynnego. Metoda ta stanowi bardzo wygodny sposób badania wpływu leków terapeutycznych na komórki nowotworów neuroendokrynnych. Może ona również pomóc w tworzeniu ludzkich sferoidów nowotworów neuroendokrynnych do celów terapii antynowotworowej.

Streszczenie

Guzy neuroendokrynne (NETs) są rzadkimi nowotworami o zapadalności wynoszącej dwie przypadki na 100, 000 osób rocznie i stanowią 0,5% wszystkich ludzkich nowotworów złośliwych.1 Poza zabiegami chirurgicznymi w przypadku niewielkiej grupy pacjentów z chorobą ograniczoną miejscowo, terapia systemowa przynosi niewielkie lub żadne korzyści w zakresie przeżywalności. W związku z tym istnieje ogromna potrzeba lepszego zrozumienia biologii NETs, a w szczególności zdefiniowania nowych celów terapeutycznych dla pacjentów z nieoperacyjnymi lub przerzutowymi guzami neuroendokrynnymi. Trójwymiarowa (3D) hodowla komórkowa staje się popularną metodą przesiewania leków ze względu na jej przydatność w modelowaniu organizacji tkanki nowotworowej i mikrośrodowiska in vivo.2,3 Wielokomórkowe sferoidy 3D mogłyby dostarczyć cennych informacji w sposób szybszy i mniej kosztowny niż bezpośrednie przechodzenie z eksperymentów na dwuwymiarowych (2D) hodowlach komórkowych do modeli zwierzęcych (mysich).

Aby ułatwić odkrywanie nowych terapii dla pacjentów z NET, opracowaliśmy model trójwymiarowych (3D) sferoidów wielokomórkowych in vitro z wykorzystaniem ludzkich linii komórkowych NET. Komórki NET wysiewamy do nieprzylegającej płytki 24-dołkowej powlekonej agarozą i inkubujemy w warunkach fizjologicznych (5% CO2, 37 °C) przy bardzo powolnym mieszaniu przez 16-24 h po wysiewaniu. Komórki zaczynają tworzyć sferoidy wielokomórkowe w 3rd lub 4th dniu. Sferoidy przyjmują bardziej kulisty kształt do 6th dnia, w którym rozpoczyna się podawanie leków. Skuteczność terapii lekowych w sferoidach NET monitoruje się na podstawie morfologii, kształtu i rozmiaru sferoidów przy użyciu mikroskopu świetlnego w kontraście fazowym. Rozmiar sferoidów jest szacowany automatycznie za pomocą opracowanego specjalnie programu MATLAB opartego na algorytmie aktywnych konturów. Ponadto przedstawiamy prostą metodę zatapiania tych sferoidów 3D w HistoGel, co umożliwia zastosowanie standardowych technik histologicznych i immunohistochemicznych.

Jest to pierwszy raport dotyczący generowania sferoidów 3D z wykorzystaniem linii komórkowych NET w celu zbadania wpływu leków terapeutycznych. Przeprowadziliśmy również badania histologiczne tych sferoidów 3D i przedstawiliśmy przykład wpływu pojedynczego leku na wzrost oraz proliferację sferoidów NET. Nasze wyniki potwierdzają, że sferoidy NET są wartościowe dla dalszych badań nad biologią NET oraz opracowywaniem leków.

Protokół

1. Przygotowanie płytki 24-dołkowej powlekanej 1% agarozą

  1. Dodać 1 g agarozy (RPI, A20090-500) do 100 ml wody dejonizowanej w butelce o pojemności 250-500 ml i wysterylizować agarozę w autoklawie (121 °C, 15 psi, 15 min). Przenieść butelkę ze sterylną agarozą do kąpieli wodnej o temperaturze 70 °C. Agaroza jest gotowa do rozlewania po ostygnięciu do 70 °C, co zajmuje około jednej godziny. Należy przez cały czas dbać o sterylność agarozy.
  2. Przygotować 24-dołkowe płytki z płaskim dnem (Falcon, 353047); można użyć dowolnych 24-dołkowych płytek z płaskim dnem, o ile pozwalają one na obrazowanie pod mikroskopem fazokontrastowym.
  3. W komorze z laminarnym przepływem powietrza nalać 200 μl agarozy do każdego dołka za pomocą pipety wielokanałowej (repeater pipette) firmy Eppendorf, a następnie delikatnie wymieszać agarozę w dołku, aby równomiernie pokryła jego dno. Ilość 200 μl agarozy jest odpowiednia do utworzenia wklęsłej powierzchni, co pozwala sferoidom przyjąć jednolity kształt sferyczny. Zastosowanie mniej niż 200 μl agarozy może nie zapewnić pełnego pokrycia dołka, natomiast więcej niż 200 μl może uniemożliwić utworzenie wklęsłej powierzchni, w wyniku czego wyhodowane sferoidy mogą nie przyjąć kształtu sferycznego.
  4. Płytki 24-dołkowe pokryte agarozą są gotowe do użycia po około 10 min. (Opcjonalnie) Dodać 100 μl pożywki w celu wyrównania parametrów agarozy z pożywką hodowlaną przed wysianiem komórek.
  5. Alternatywnie, po całkowitym zestaleniu agarozy, dodać 100 μl pożywki wzrostowej do każdego dołka i uszczelnić płytki sterylną taśmą uszczelniającą (Nunc, 236366). Tak przygotowane płytki można przechowywać w temperaturze 4 °C przez maksymalnie jeden tydzień.

2. Przygotowanie zawiesin pojedynczych komórek

  1. Wszystkie eksperymenty są przeprowadzane z użyciem standardowych technik aseptycznych w komorze z laminarnym przepływem powietrza, a wszystkie hodowle są prowadzone w inkubatorze z nawilżaniem w temperaturze 37 °C z dodatkiem 5% CO2 w powietrzu, chyba że wskazano inaczej.
  2. Ludzkie komórki NET trzustki BON-1 utrzymuje się w pożywce DMEM/F12 (Invitrogen, 10565) z 10% płatkową surowicą bydlęcą (FBS, Invitrogen, 16000-044) w sterylnych naczyniach do hodowli tkankowej o wymiarach 100 mm x 20 mm (Corning, 430167).
  3. Gdy monowarstwa komórek BON-1 osiągnie 70-80% konfluencji, pożywkę usuwa się. Komórki płucze się dwukrotnie PBS, a następnie odrywa od dna naczynia poprzez dodanie 1 ml TrypLE (Invitrogen, 12604) i inkubację przez 5 min w 37 °C. TrypLE jest analogiczny do trypsyny, lecz pozostaje stabilny w temperaturze 15 - 30 °C, jak i w 4 °C. Należy sprawdzić pod mikroskopem, czy wszystkie komórki oddzieliły się od naczynia.
  4. Do trypsynizowanych komórek dodaje się 9 ml pożywki wzrostowej, a następnie za pomocą pipety wykonuje się kilka razy pipetowanie w górę i w dół, aby zapewnić jednorodną zawiesinę pojedynczych komórek.
  5. Do przefiltrowania komórek należy użyć sita komórkowego o oczkach 70-μm (Fisher, 22363548).
  6. Komórki należy zebrać i przeprowadzić ich zliczenie przy użyciu systemu Guava PCA-96 Base System (Millipore).
  7. Należy przygotować zawiesinę o stężeniu 5,000 komórek na ml w beztlenkowej pożywce DMEM/F12 z 10% FBS.

3. Hodowla sferoidów

  1. Nanieś 200 μl zawiesiny pojedynczych komórek na pokrytą agarozą płytkę 24-dołkową i szczelnie zamknij płytkę sterylną taśmą uszczelniającą, aby zapobiec parowaniu.

Uwaga: --Liczba komórek do wysiania powinna zostać określona empirycznie na podstawie wielkości sferoidów w 6. dniu; średnica sferoidów wynosząca 300-400 μm byłaby idealną wielkością do rozpoczęcia leczenia lekiem; wysiewa się 1 000 komórek BON-1 i H727.

-- Nie zalecamy rozpoczynania leczenia farmakologicznego po 6. dniu, ponieważ żywotność komórek 3D zaczyna spadać około 10. dnia (dane nieprzedstawione, rękopis w przygotowaniu).

  1. Umieść powyższe płytki 24-dołkowe pokryte agaroza z komórkami BON-1 na wytrząsarce orbitalnej przy bardzo wolnym mieszaniu poniżej 40 rpm przez noc w inkubatorze z wilgotnym powietrzem w temperaturze 37 °C i 5% CO2. Następnie przenieś płytki na stabilną platformę, aby umożliwić dalszy wzrost kultur.
  2. Dodawaj 200 μl pożywki wzrostowej do każdego dołka powyższych płytek co 3 dni. Nie zaburzaj sferoidów. Staraj się dodawać pożywkę wzdłuż ścianki każdego dołka, dotykając końcówką pipety boku dołka i pozwalając pożywce spłynąć do środka.
  3. Monitoruj formowanie się sferoidów w płytkach 24-dołkowych pod mikroskopem.

4. Leczenie lekami

  1. Gdy sferoidy osiągną średnicę około 300-400 μm w 6. dniu, sferoidy 3D są poddawane działaniu leków. Jest to oznaczone jako dzień 0 dla terapii lekowej.
  2. W 6. dniu każda studnia płytki zawiera około 400 μl medium. Aby zapewnić 1x stężenie końcowe leków w każdej studni, przygotowuje się 3x rozcieńczenia szeregowe każdej dawki leków z roztworu zapasowego w 5 ml medium wzrostowego w probówce stożkowej o pojemności 15 ml, co jest wystarczające dla 8 powtórzeń.
  3. Sferoidy w każdym rzędzie płytki 24-dołkowej są przypisane do grup: kontrolnej (vehicle) oraz dawek 1, 2, 3, 4 i 5. Na jednej płytce 24-dołkowej znajdują się 4 powtórzenia dla każdej dawki leków (patrz Tabela 1). Zazwyczaj sferoidy 3D traktujemy na co najmniej dwóch płytkach 24-dołkowych, co daje co najmniej 8 powtórzeń dla każdej dawki leków.
  4. Wirować płytkę 24-dołkową z prędkością 800 rpm przez 5 min w temperaturze 4 °C, aby upewnić się, że cała kondensacja z taśmy uszczelniającej przedostała się do studni. Ze względu na zdolność do unoszenia się sferoidów 3D, nie usuwa się medium z poszczególnych studni, aby uniknąć naruszenia sferoidów.
  5. Ostrożnie dodać 200 μl przygotowanych wcześniej roztworów dla każdej dawki do odpowiednich studni, wlewając płyn po ściance każdej studni.
  6. Uszczelnić płytki 24-dołkowe taśmą uszczelniającą i inkubować hodowle w inkubatorze nawilżanym w temperaturze 37 °C z 5% CO2 w powietrzu.
  7. W razie potrzeby powtórzyć traktowanie sferoidów w każdej studni odpowiednią dawką leków po 72-96 hr.

5. Monitorowanie 3D kultur sferoidów

  1. W każdym wybranym punkcie czasowym po podaniu leku (0, 24, 48, 72 h) sferoidy w każdym dołku płytki 24-dołkowej obrazuje się za pomocą mikroskopu fazokontrastowego Zeiss Axiovert 200/M z użyciem obiektywu 5x.

Uwaga: Obrazy można uzyskać przy użyciu dowolnego mikroskopu świetlnego z skalibrowaną relacją między μm a pikselem. Obiektyw 5x jest idealny, ponieważ sferoidy szybko przerastają pole widzenia przy zastosowaniu obiektywu 10x.

  1. Analizę sferoidów można przeprowadzić ręcznie, korzystając z oprogramowania Zeiss AxioVision 4.8.2 oraz surowych obrazów.
  2. Alternatywnie, do automatycznego lub półautomatycznego szacowania wielkości sferoidów stosowany jest autorski program w środowisku MATLAB. Program automatyczny implementuje algorytm aktywnego konturu4, aby precyzyjnie zlokalizować obrys sferoidu na danym obrazie i automatycznie zmierzyć jego oś główną (L) oraz oś mniejszą (W). Wersja półautomatyczna tego samego algorytmu umożliwia użytkownikowi pomoc w uruchomieniu programu w przypadku wystąpienia silnych artefaktów. Wszystkie surowe obrazy muszą zostać wyeksportowane do formatów plików TIFF lub JPEG, aby mogły zostać odczytane przez program. Objętość sferoidu szacowana jest według wzoru 0.5 x L x W2.

6. Osadzanie sferoidów NET 3D w HistoGelu

  1. Od 10 do 24 sferoid pobiera się z płytek 24-dołkowych, dwukrotnie płucze w PBS, utrwala w 10% formalinie przez 2 hr, a następnie dwukrotnie płucze odpowiednio w 50% i 70% etanolu przez 15 min; po tym procesie są one gotowe do zatopienia w HistoGel. Alternatywnie można je przechowywać w 70% etanolu w temperaturze 4 °C przez kilka miesięcy.
  2. Probówkę z zimnym HistoGel (Thermo Scientific, HG-4000-012) umieszcza się w zlewce wypełnionej wodą. Zlewkę podgrzewa się w mikrofalówce przez 1 min lub do momentu całkowitego upłynnienia żelu; probówka powinna przez cały czas pozostawać w tej samej zlewce z wodą.
  3. Sferoidy w 70% etanolu przenosi się za pomocą wykałaczką do kasetki do biopsji (Tissue-Tek, Sakura Finetek, 4565). Należy upewnić się, że wszystkie sferoidy zostały przeniesione. Pozostawia się sferoidy na minutę, aby opadły na dno kasetki. Nadmiar cieczy z kasetki usuwa się za pomocą chusteczek Kimwipes, a w międzyczasie bardzo delikatnie przesuwa się sferoidy na środek dna kasetki, używając jednorazowej plastikowej pipety Pasteura. Ten krok może być łatwiejszy do wykonania pod mikroskopem stereologicznym.
  4. Do kasetki dodaje się cienką warstwę podgrzanego HistoGel, aby ustabilizować sferoidy na dnie; w tym czasie za pomocą wykałaczki bardzo delikatnie utrzymuje się sferoidy na środku dna kasetki. Nie należy dodawać zbyt dużo HistoGel, a jedynie ilość wystarczającą do stabilizacji sferoidów na dnie kasetki.
  5. Pozostawia się sferoidy w HistoGel na 1-2 min w temperaturze pokojowej lub do momentu zestalenia się HistoGel. Następnie resztę kasetki wypełnia się podgrzanym HistoGel.
  6. Pozostawia się do zastygnięcia w temperaturze pokojowej przez około 10 min.
  7. Bezpośrednio przed wyjęciem bloku sferoidy/HistoGel z kasetki, pozostawia się go w temperaturze 4 °C przez 1 min, co ułatwia wyjęcie nienaruszonego bloku. Blok sferoidy/HistoGel owija się kawałkiem Bio-wraps (Surgipath, 01090) i umieszcza w kasecie do tkanek i biopsji (Fisher Scientific, 15-182-701D). Kasetę przechowuje się w pojemniku z 70% etanolem. Następnie stosuje się rutynowe procedury obróbki tkanek do zatapiania w parafinie.5
  8. Blok parafiny można ciąć na skrawki o grubości 3-μm. Skrawki można barwić hematoksyliną i eozyną w celu oceny zmian histologicznych, a także wykorzystać do barwienia immunohistochemicznego.

7. Reprezentatywne wyniki

Ludzkie linie komórkowe guza neuroendokrynnego trzustki BON-1 (udostępnione Verto Institute przez Kjell Oberga z Uniwersytetu w Uppsali w Szwecji), QGP-1 (Japanese Health Sciences Foundation, Osaka, Japonia) oraz ludzka linia komórkowa guza neuroendokrynnego płuc H727 (ATCC) były hodowane na 24-dołkowej płytce powlekanej agaroza. Jak widać na Rysunku 1, trzy linie komórkowe wykazują różną morfologię. Komórki BON-1 i H727 tworzyły sferoidy 3D. Pod mikroskopem komórki H727 tworzyły sferoidy bardziej zwarte i kompaktowe niż komórki BON-1. Przypuszczamy, że komórki H727 mają zwiększoną zdolność do adhezji międzykomórkowej i w konsekwencji tworzą ciaśniejsze połączenia. Komórki QGP-1 tworzą duże, porowate masy przypominające winogrona, których nie uznaje się za sferoidy. Ze względu na rosnące w ostatnich latach zainteresowanie badaniami nad guzami neuroendokrynnymi trzustki, w pozostałych częściach pracy wykorzystano komórki BON-1. Po wysianiu komórek BON-1 na powlekaną agarozą płytkę 24-dołkową, tworzenie wielokomórkowych sferoidów następuje zazwyczaj w 3rd lub 4th dniu, a sferoidy stają się bardziej okrągłe do 6th dnia. Ze względu na ograniczenie dostępu do składników odżywczych i tlenu, komórki w gęstym rdzeniu sferoidów zaczynają obumierać około 10. dnia, a do 17. dnia sferoidy zaczynają się rozpadać z powodu dużego rozmiaru lub w niektórych przypadkach wyrzucenia rdzenia nekrotycznego. Sferoidy mogą zazwyczaj osiągać średnicę do 1 000 μm. Rysunek 2 przedstawia przekroje ukazujące powstawanie, wzrost i dezintegrację sferoidów 3D BON-1.

Leczenie lekami rozpoczęto, gdy sferoidy osiągnęły rozmiar około 300-400 μm, a komórki zachowały wysoką żywotność (manuskrypt w przygotowaniu). Jako punkt początkowy dla terapii lekowej wybrano sferoidy 3D z 6. dnia. Doniesiono, że inhibitory deacetylazy histonowej wykazują działanie antyproliferacyjne i proapoptotyczne wobec komórek NET.6 Jako przykład do zilustrowania wpływu leków na sferoidy 3D NET wybrano inhibitor deacetylazy histonowej – Trichostatin A (TSA). Rysunek 3A przedstawia morfologię sferoidów 3D po zastosowaniu TSA. Rysunek 3B przedstawia objętość sferoidów 3D po zastosowaniu TSA (Sigma, T8552). Rozmiar każdego poszczególnego sferoidu szacowano automatycznie za pomocą autorskiego programu komputerowego w MATLAB.4 Dodano etap ręcznego obrysowywania, aby ułatwić wykrywanie sferoidów znajdujących się blisko krawędzi danego obrazu. W każdym punkcie czasowym zmierzono co najmniej 8 sferoidów dla każdej dawki TSA. Objętość każdego sferoidu 3D obliczono według wzoru 0,5 x Długość x Szerokość2. Jak widać na Rysunku 3A i 3B, w porównaniu z grupą kontrolną (nośnikiem), wszystkie przedstawione dawki TSA wykazały w pewnym stopniu hamowanie wzrostu sferoidów 3D BON-1. Wśród nich stężenia 125 nM i 250 nM TSA silnie hamowały wzrost sferoidów 3D i prowadziły do śmierci komórek w 96. godzinie.

W celu zbadania histologii sferoidów 3D NET wykonano barwienie H & E oraz barwienie immunohistochemiczne (IHC) sferoidów 3D hodowanych przez 17 dni. Rysunek 4A przedstawia metodę przygotowania sferoidów 3D do zatapiania w HistoGel, co jest kluczowym etapem zatapiania sferoidów 3D w parafinie. Rysunek 4B przedstawia barwienie H & E oraz barwienie immunohistochemiczne sferoidów 3D hodowanych przez 17 dni z użyciem przeciwciał przeciwko rozpadowej kaspazie-3 (markerowi komórek apoptotycznych) oraz Ki-67 (markerowi komórek proliferujących). Komórki w rdzeniu sferoidów 3D są w przeważającej mierze nekrotyczne/apoptotyczne, natomiast komórki warstwy zewnętrznej aktywnie proliferują.

Obrazy sferoidów komórek BON-1, H727, QGP-1 w hodowli 3D; analiza mikroskopowa wzorców wzrostu.
Rysunek 1. Morfologia sferoidów 3D NET. Sferoidy 3D z trzech ludzkich linii komórkowych guzów neuroendokrynnych są formowane na płytkach 24-dołkowych pokrytych agaroza. 1 000 komórek BON-1, H727 i QGP-1 wysiano na płytki 24-dołkowe pokryte agaroza i hodowano w normalnych warunkach fizjologicznych, zgodnie ze szczegółami opisanymi w protokole. Przedstawione obrazy ukazują sferoidy 3D dla BON-1 i H727 lub agregaty komórkowe dla QGP-1, które były hodowane przez 10 dni.

Tworzenie sferoidów w ciągu 20 dni; obrazy z mikroskopii pokazują postęp agregacji komórek w zależności od godzin/dni.
Rysunek 2. Monitorowanie wzrostu trójwymiarowych (3D) sferoidów BON-1. Monitorowanie wzrostu trójwymiarowych sferoidów BON-1: tworzenie, wzrost i dezintegracja sferoidów 3D. Zgodnie z opisem w protokole, 1 000 komórek BON-1 wysiano na pokrytą agarozą płytkę 24-dołkową. Komórki hodowano w standardowej pożywce DMEM/F12 z dodatkiem 10% FBS na wytrząsarku orbitalnym w warunkach fizjologicznych przez noc, a następnie przeniesiono na stabilną platformę i kontynuowano hodowlę w tych samych warunkach. Monitorowanie wzrostu komórek 3D polegało na obrazowaniu komórek co godzinę przez pierwsze 5 hr po wysianiu, a następnie co 1-3 dni przy użyciu mikroskopu fazokontrastowego Zeiss Axiovert 200/M z obiektywem 5x. Komórki najpierw agregują w masy, następnie tworzą agregaty wielokomórkowe, małe sferoidy, większe sferoidy, aż w końcu sferoidy ulegają dezintegracji.

Efekt traktowania TSA na sferoidy 3D; obrazy wzrostu i wykres objętości w czasie.
Rycina 3. Traktowanie sferoidów 3D BON-1 za pomocą TSA. (A) Obrazy sferoidów 3D po traktowaniu TSA. Grupy traktowania: V – nośnik (0,0025% DMSO); D1 – dawka 1 (15,625 nM TSA); D2 – dawka 2 (31,25 nM TSA); D3 – dawka 3 (62,5 nM TSA); D4 – dawka 4 (125 nM TSA); D5 – dawka 5 (250 nM TSA). Czas traktowania: 0 H – punkt czasowy rozpoczęcia traktowania sferoidów 3D w 6. dniu; 24 H, 48 H, 72 H i 96 H to punkty czasowe po rozpoczęciu traktowania. Sferoidy 3D obrazowano w każdym punkcie czasowym w sposób opisany wcześniej. (B) Wzrost sferoidów 3D po traktowaniu TSA. Oś główną (L) i oś pomocniczą (W) sferoidów 3D z części (A) szacowano automatycznie programem Matlab w każdym punkcie czasowym traktowania (0, 24, 48, 72 i 96 hr). Objętość sferoidów 3D obliczono jako 0,5 x L x W2. Objętość sferoidu na wykresie stanowi średnią z 8 powtórzeń, a słupki błędów obliczono na podstawie tych 8 powtórzeń.

Eksperyment leczenia nowotworu; wyniki testu sferoidów; tabela dawek i powtórzeń; analiza danych.
Tabela 1. Układ traktowania lekami na płytce 24-dołkowej.

Proces zatapiania w HistoGel dla 3D bloków komórkowych; kroki obejmują ogrzewanie, przeniesienie, zestalenie, zawijanie.
Rysunek 4A. Ilustracja metody przetwarzania sferoidów 3D do zatapiania w HistoGel. Metoda przetwarzania sferoidów 3D do zatapiania w HistoGel oraz barwienia immunohistochemicznego sferoidów 3D (A) Przegląd metody przetwarzania sferoidów 3D do zatapiania w HistoGel. Sferoidy 3D zostały zamknięte w HistoGel, aby znajdowały się na tym samym poziomie w kriosformie do biopsji, następnie blok HistoGel/sferoidy owinięto niebieskimi Bio-wraps i przeniesiono do żółtej kasetki do biopsji w celu zatapiania w parafinie.

Barwienie histologiczne w mikroskopii: H&E, Ki-67, rozszczepiona kaspaza-3, analiza proliferacji komórek.
Rysunek 4B. Barwienie H & E oraz barwienie immunohistochemiczne sferoidów 3D w 17. dniu.(B) Barwienie H & E oraz barwienie immunohistochemiczne Ki-67 i rozszczepionej kaspazy-3 sferoidów 3D po 17 dniach. Przekroje zatopione w parafinie odparafinizowano, a następnie przeprowadzono odsłanianie antygenów przy użyciu CCI (Cell Conditioning Solution, Verana Medical System, #711-065-152). Poliklonalne przeciwciało królicze anty-Ki-67 (Abcam, #Ab833) oraz przeciwciało anty-rozszczepiona kaspaza-3 (Cell Signaling Technology, #9661) zastosowano odpowiednio w rozcieńczeniach 1:75 i 1:200 przez 1 h w temperaturze pokojowej. Wtórne przeciwciało anty-królicze (Jackson Immunolab, #711-065-152) zastosowano w rozcieńczeniu 1:500 przez 1 h w temperaturze pokojowej, a następnie użyto chromogenicznego zestawu detekcyjnego DABMap (Ventana Medical Systems, #760-124). Preparaty dobarwiono hematoksyliną, odwodniono i przejrzystowano w ksylenie przed przykryciem szkiełkami.

Dyskusja

Przedstawiliśmy prostą, niezawodną i powtarzalną metodę tworzenia wielokomórkowych sferoidów 3D z ludzkich komórek guza neuroendokrynnego z wykorzystaniem 24-dołkowych płytek pokrytych agarozą. Sukces tej techniki polega na możliwości uzyskania pojedynczego sferoidu o jednorodnym rozmiarze i jednolitym kształcie do 6. dnia, zaczynając od stałej liczby komórek. Kluczowym krokiem jest powolne wytrząsanie płytki z komórkami NET przez pierwsze 16-24 h po wysianiu. Metoda ta może mieć zastosowanie również do powszechnych linii komórkowych: ludzkiej linii raka piersi MCF-7, ludzkiej linii gruczolakoraka jelita grubego HT-29, ludzkiej linii niedrobnokomórkowego raka płuca H1299 oraz ludzkiej linii komórek embrionalnej nerki HEK-293. Wszystkie one mogą tworzyć jednolite i zwarte sferoidy 3D do przesiewania leków terapeutycznych (dane niepoddane prezentacji). Chociaż opisano kilka metod generowania sferoidów 3D,7-10 metoda przedstawiona w niniejszej pracy nie wymaga specjalistycznych płytek ani odczynników, co czyni ją prostą i kosztowo efektywną. Nasze niepublikowane dane wykazują, że sferoidy 3D NET hodowane na agarozie naśladują geometrycznie i molekularnie ksenoprzeszczep guza NET in vivo w porównaniu z komórkami w monowarstwie 2D. Jest to zgodne z doniesieniami dotyczącymi sferoidów 3D tworzonych z innych ludzkich linii komórek rakowych.11,12 Ograniczeniem modelu 3D hodowli komórkowej jest fakt, że nie może on całkowicie zastąpić testowania skuteczności leków lub terapii in vivo, ponieważ sferoidy 3D przypominają guzy beznaczyniowe, co odróżnia je od guzów in vivo w tym aspekcie. Niemniej jednak metoda ta pomoże w niektórych aspektach wypełnić lukę i usprawnić ocenę leków terapeutycznych NET w przejściu z fazy in vitro do in vivo.

Barwienie immunofluorescencyjne wielokomórkowych sferoidów jest bardzo trudne do wykonania ze względu na duży rozmiar i geometrię pływających sferoidów 3D oraz ograniczenia mikroskopu konfokalnego. W niniejszej pracy przedstawiamy metodę przygotowania do zatopienia w parafinie poprzez zastosowanie HistoGel, co umożliwia barwienie immunohistochemiczne seryjnych przekrojów sferoidów 3D na szkiełkach. Ponadto nasz autorski program w środowisku MATLAB pozwala na dokładną i powtarzalną ocenę wielkości sferoidów oraz efektywne monitorowanie skuteczności leków, co może zostać włączone do przesiewowych badań wysokoprzepustowych przy opracowywaniu leków dla pacjentów z NET.

Oświadczenia

Nie zadeklarowano konfliktów interesów.

Podziękowania

Szczerze dziękujemy dr Wenjin Chen za pomoc w przygotowaniu programu MATLAB oraz pracownikom laboratorium histopatologii i pracowni mikroskopii Cancer Institute of New Jersey. Dziękujemy również recenzentom za ich uwagi i sugestie. Niniejsze badanie zostało sfinansowane przez Raymond and Beverly Sackler Research Foundation.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Pożywka DMEM/F12Gibco10565-018
TrypLEGibco12604
Płytki 24-dołkoweFalcon353047
Sito do komórek 70 µmFisher Scientific22363548
Sterylna taśma uszczelniającaNunc236366
Trichostatyna ASigmaT8552
Wstrząsarka orbitalnaFisher Scientific11-402-12

Bibliografia

  1. Taal, B. G., Visser, O. Epidemiology of neuroendocrine tumours. Neuroendocrinology. 80, 3-7 (2004).
  2. Lee, G. Y., Kenny, P. A., Lee, E. H., Bissell, M. J. Three-dimensional culture models of normal and malignant breast epithelial cells. Nat. Methods. 4, 359-365 (2007).
  3. Friedrich, J., Seidel, C., Ebner, R., Kunz-Schughart, L. A. Spheroid-based drug screen: considerations and practical approach. Nat. Protocol. 4, 309-324 (2009).
  4. Chan, T. F., Vese, L. A. Active contours without edges. IEEE Trans Image Process. 10, 266-277 (2001).
  5. Olert, J., Wiedorn, K. H., Goldmann, T., Kühl, H., Mehraein, Y., Scherthan, H., Niketeghad, F., Vollmer, E., Müller, A. M., Müller-Navia, J. HOPE Fixation: A Novel Fixing Method and Paraffin-embedding Technique for Human Soft Tissues. Pathology-Research and Practice. 197, 823-826 (2001).
  6. Baradari, V., Huether, A., Höpfner, M., Schuppan, D., Scherübl, H. Antiproliferative and proapoptotic effects of histone deacetylase inhibitors on gastrointestinal neuroendocrine tumor cells. Endocr. Relat. Cancer. 13, 1237-1250 (2006).
  7. Foty, R. A Simple Hanging Drop Cell Culture Protocol for Generation of 3D Spheroids. J. Vis. Exp. (51), e2720(2011).
  8. Shaw, K. R., Wrobel, C. N., Brugge, J. S. Use of three-dimensional basement membrane cultures to model oncogene-induced changes in mammary epithelial morphogenesis. J. Mammary Gland Biol. Neoplasia. 9, 297-310 (2004).
  9. Ivascu, A., Kubbies, M. Rapid generation of single-tumor spheroids for high-throughput cell function and toxicity analysis. J. Biomol. Screen. 11, 922-932 (2006).
  10. Napolitano, A. P., Chai, P., Dean, D. M., Morgan, J. R. Dynamics of the Self-Assembly of Complex Cellular Aggregates on Micromolded Nonadhesive Hydrogels. Tissue Engineering. 13, 2087-2094 (2007).
  11. do Amaral, J. B., Rezende-Teixeira, P., Freitas, V. M., Machado-Santelli, G. M. MCF-7 cells as a three-dimensional model for the study of human breast cancer. Tissue Eng. Part C Methods. 17, 1097-1107 (2011).
  12. Hirschhaeuser, F., Menne, H., Dittfeld, C., West, J., Mueller-Klieser, W., Kunz-Schughart, L. A. Multicellular tumor spheroids: An underestimated tool is catching up again. Journal of Biotechnology. 148, 3-15 (2010).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Sferoidy 3Dhodowla kom rkowamikroskopia kontrastowazatapianie w HistoGeltraktowanie lekiemanaliza w programie MATLABbarwienie immunohistochemicznetest prze ywalno ci kom rekwytrz sarka orbitalna

Powiązane artykuły