Monitorowanie autonomicznych rytmów zegara okołodobowego ekspresji genów za pomocą reporterów bioluminescencji lucyferazy

Summary

Zegary okołodobowe funkcjonują w pojedynczych komórkach, tzn. są autonomiczne dla komórek. W tym miejscu opisujemy metody generowania autonomicznych modeli zegarów komórkowych przy użyciu nieinwazyjnej, opartej na lucyferazie technologii bioluminescencji w czasie rzeczywistym. Komórki reporterowe zapewniają elastyczne, funkcjonalne systemy modelowe do badania biologii okołodobowej.

Abstract

U ssaków wiele aspektów zachowania i fizjologii, takich jak cykle snu i czuwania oraz metabolizm wątroby, jest regulowanych przez endogenne zegary okołodobowe (przegląd^1,2). Okołodobowy system pomiaru czasu jest hierarchiczną siecią z wieloma oscylatorami, w której centralny zegar umieszczony w jądrze nadskrzyżowaniowym (SCN) synchronizuje i koordynuje zegary poza-SCN i peryferyjne w innych miejscach^1,2. Poszczególne komórki są jednostkami funkcjonalnymi odpowiedzialnymi za wytwarzanie i utrzymywanie rytmów okołodobowych^3,4, a te oscylatory różnych typów tkanek w organizmie mają niezwykle podobny biochemiczny mechanizm ujemnego sprzężenia zwrotnego. Jednak ze względu na interakcje na poziomie sieci neuronalnej w SCN oraz poprzez rytmiczne, systemowe sygnały na poziomie organizmu, rytmy okołodobowe na poziomie organizmu niekoniecznie są autonomiczne dla komórek^5-7. W porównaniu z tradycyjnymi badaniami aktywności lokomotorycznej in vivo i eksplantatów SCN ex vivo, testy in vitro oparte na komórkach pozwalają na wykrycie autonomicznych przez komórkę wad okołodobowych^5,8. Ze strategicznego punktu widzenia, modele oparte na komórkach są bardziej eksperymentalnie wykonalne do charakterystyki fenotypowej i szybkiego odkrywania podstawowych mechanizmów zegara^5,8-13.

Ponieważ rytmy okołodobowe są dynamiczne, do oceny funkcji zegara potrzebne są pomiary podłużne o wysokiej rozdzielczości czasowej. W ostatnich latach rejestracja bioluminescencji w czasie rzeczywistym z wykorzystaniem lucyferazy świetlików jako reportera stała się powszechną techniką badania rytmów okołodobowych u ssaków^14,15, ponieważ pozwala na badanie trwałości i dynamiki rytmów molekularnych. Aby monitorować autonomiczne rytmy okołodobowe ekspresji genów, reportery lucyferazy można wprowadzić do komórek poprzez transfekcję^{przejściową 13,16,17} lub stabilną transdukcję^5,10,18,19. W tym miejscu opisujemy stabilny protokół transdukcji wykorzystujący dostarczanie genów za pośrednictwem lentiwirusa. System wektorów lentiwirusowych jest lepszy od tradycyjnych metod, takich jak transfekcja przejściowa i transmisja w linii zarodkowej, ze względu na swoją skuteczność i wszechstronność: umożliwia skuteczne dostarczanie i stabilną integrację z genomem gospodarza zarówno komórek dzielących się, jak i niedzielących^się20. Po ustaleniu linii komórek reporterowych można badać dynamikę funkcji zegara poprzez rejestrację bioluminescencyjną. Najpierw opisujemy generację linii reporterowych P(Per2)-dLuca, a następnie prezentujemy dane z tej i innych reporterów okołodobowych. W tych testach mysie fibroblasty 3T3 i ludzkie komórki kostniakomięsaka U2OS są używane jako modele komórkowe. Omawiamy również różne sposoby wykorzystania tych modeli zegarów w badaniach okołodobowych. Opisane tutaj metody mogą być stosowane do wielu różnych typów komórek w celu zbadania komórkowych i molekularnych podstaw zegarów okołodobowych i mogą okazać się przydatne w rozwiązywaniu problemów w innych systemach biologicznych.

Protocol

1. Budowa reporterów lucyferazy lentiwirusowej

Konstrukt reportera okołodobowego ssaków zazwyczaj zawiera kasetę ekspresji, w której promotor okołodobowy jest połączony z genem lucyferazy. Zarówno strategie oparte na ligacji, jak i rekombinacji są powszechnie stosowane do klonowania DNA. Jako przykład opisujemy tutaj opartą na rekombinacji metodę klonowania Gateway do generowania reportera lentiwirusowego P(Per2)-dLuc, w którym zdestabilizowana lucyferazy (dLuc) jest pod kontrolą mysiego promotora Per2.

1. Klonowanie promotora Per2. Użyj PCR do amplifikacji fragmentu DNA promotora Per2 o długości 526 pz, przed miejscem rozpoczęcia transkrypcji z mysiego klonu BAC Per2 ^9-13, używając startera do przodu (5'-CTCGAGCGGATTACCGAGGGGGGTCACG TC-3') i startera odwrotnego (5'-CTCGAGTCCCTTGCTCGGCCCCGTCAC TTGG-3') i sklonuj do wektora pENTR5'-TOPO (Invitrogen) w celu wygenerowania pENTR5'-P(Per2).
2. Klonowanie dLuca. dLuc zawiera gen lucyferazy świetlika i C-końcową sekwencję PEST do szybkiej degradacji białek, jak opisano wcześniej²¹. Użyj PCR do amplifikacji fragmentu DNA dLuc i sklonuj do wektora pENTR/D-TOPO (Invitrogen), aby wygenerować pENTR/D-dLuc.
3. Budowa wektora reporterowego. Wymieszaj dwa plazmidy pENTR, pENTR5'-P (Per2) i pENTR / D-dLuc, z lentiwirusowym wektorem docelowym pLV7-Bsd (Bsd, gen oporności na blasticydynę) i przeprowadź reakcję rekombinacji za pomocą klonazy w celu wygenerowania reporterapLV7-Bsd-P(Per2)-d Luc (Figura 1). pLV7-Bsd jest zmodyfikowaną wersją (wyprodukowaną w naszym laboratorium) pLenti6/R4R2/V5-DEST (Invitrogen), w której sekwencje potranskrypcyjnego elementu regulatorowego (WPRE) wirusa świstaka (WPRE)²² zostały wprowadzone bezpośrednio za kasetą ekspresyjną w celu zwiększenia ekspresji genów.

2. Produkcja cząsteczek lentiwirusowych

1. Komórki Seed 293T (dzień 1)

1. Hoduj ludzkie komórki 293T embrionalnej nerki (HEK) do 90-100% zbiegu w zwykłym DMEM uzupełnionym 10% FBS i 1x Penicylina-Streptomycyna-Glutamina (PSG) na 10 cm szalkach hodowlanych. (Szybko rosnące komórki o niskiej liczbie pasażów mają kluczowe znaczenie dla wydajnej transfekcji).
2. Przed wysiewem komórek do transfekcji pokryć 6-dołkowe płytki hodowlane, dodając 1 ml 0,001% poli-L-lizyny w PBS do każdej studzienki i inkubować w temperaturze pokojowej przez 20 minut. Odessać roztwór i spłukać raz 1x PBS przed użyciem.
3. Zdysocjuj komórki 293T za pomocą trypsyny i zasiewu 0,75 x 10⁶ komórek na każdym dołku wstępnie pokrytych płytek za pomocą 2 ml zwykłego DMEM. Dokładnie zakręć płytki, aby uzyskać równomierny rozkład komórek w każdym dołku. Hodować komórki w inkubatorze w temperaturze 37 °C przez noc.

2. Transfekcja przejściowa przez wytrącanie CaPO₄/DNA (dzień 2)

1. Obserwuj wysiane komórki od 1 dnia. Komórka powinna osiągnąć zbieżność 80-90%.
2. Przygotować mieszaninę do transfekcji plazmidu w probówce do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml, dodając 2 μg plazmidowego DNA reporterowego lentiwirusa (np. pLV7-P(Per2)-dLuc; Liu lab) i 3 wektory pakowania (1,3 μg Gag/Pol, 0,5 μg Rev i 0,7 μg VSVG; Invitrogen). Jako kontrolę zarówno transfekcji, jak i późniejszej infekcji, zwykle włączamy dodatkową studzienkę do transfekcji dla lentiwirusowego wektora ekspresyjnego GFP, pLV156-CMV-EGFP (Figura 1A), zawierającego wzmocnione białko zielonej fluorescencji (EGFP) pod kontrolą promotora CMV, jak opisano wcześniej²⁰.
3. Dodać 100 μl 0,25 M CaCl₂ (rozcieńczonego ddH₂O bez DNazy/RNaz z 2,5 M zapasu) do mieszaniny plazmidowej w kroku 2 i dokładnie wymieszać. Następnie dodać 100 μl 2x roztworu BBS (50 mM BES, 280 mM NaCl, 1,5 mM Na₂HPO₄, pH 6,95) i delikatnie, ale dokładnie wymieszać. Inkubować mieszaninę DNA w temperaturze pokojowej przez 15 minut.
4. Czekając, odessać pożywkę z komórek 293T i zmienić na 2 ml świeżej pożywki. Umieścić płytkę z powrotem w inkubatorze na co najmniej 10 minut w celu zrównoważenia pH pożywki przed transfekcją.
5. Dodaj mieszankę transfekcyjną z kroku 3 do komórek 293T kropla po kropli. Delikatnie obracaj płytką i obserwuj tworzenie się cząstek pod mikroskopem. Inkubować w temperaturze 5% CO_{2 w} temperaturze 37 °C przez noc. (Tworzenie drobnych cząstek osadu CaPO₄ / DNA ma kluczowe znaczenie dla wydajnej transfekcji).

3. Zbieranie cząsteczek wirusa (dni 3-4)

1. Około 16 godzin po transfekcji (dzień 3), do którego to czasu komórki powinny osiągnąć 100% konfluencji, odessać pożywkę z komórek i zastąpić 2 ml świeżego zwykłego DMEM. Inkubować w temperaturze 37 °C przez noc.
2. W dniu 4 oceń skuteczność transfekcji, obserwując ekspresję EGFP w komórkach kontrolnych transfekcji (skuteczność transfekcji 90-100% z wysoką ekspresją EGFP jest wiarygodnym predyktorem dobrego przygotowania wirusa).
3. Zebrać pożywkę zawierającą wydzielane, zakaźne cząsteczki wirusa. Wirować przy >2,000 x g przez 5 minut w celu usunięcia pozostałych komórek 293T i zebrania supernatantu zawierającego wirusa. Alternatywnie podłoże można oczyścić za pomocą filtra membranowego 0,45 μm. Cząsteczki wirusa są gotowe do użycia w infekcji.

3. Zakażenie komórek 3T3

1. Nasiona komórek 3T3 (dzień 3)

Podziel i zasiej odpowiednią liczbę (~12 000) komórek 3T3 na 12-dołkowej płytce, aby uzyskać 20-30% konfluencji do następnego dnia. Inkubować w temperaturze 37 °C przez noc.

2. Zakażenie komórek 3T3 (dzień 4)

1. Obserwuj wysiane komórki. W przypadku infekcji pożądana jest konfluencja 20-30% (mniej niż 50%).
2. Do pobranej pożywki zawierającej cząstki wirusa dodać polibren do końcowego stężenia 5 μg/ml. Dobrze wymieszać przez pipetowanie.
3. Odessać pożywkę z komórek 3T3 i dodać 1 ml powyższej mieszaniny wirusowej do dołka. Inkubować w temperaturze 37 °C przez noc. (Polybrene jest stosowany w celu zwiększenia skuteczności infekcji, ale nie jest absolutnie wymagany. Ponieważ może być toksyczny dla niektórych komórek, zaleca się wcześniejsze badania.)

3. Wybierz zainfekowane komórki (dzień 5 i później)

1. Dwadzieścia cztery godziny po zakażeniu, odessać pożywkę zawierającą wirusa i polibren z zakażonych komórek, przemyć raz 1x PBS i zmienić na świeże podłoże. Inkubować w temperaturze 37 °C przez noc w celu regeneracji i wzrostu.
2. W przypadku zlewania się (zwykle 1-2 dni później) podziel komórki i inkubuj w temperaturze 37 °C przez noc.
3. Następnego dnia odessać pożywkę z komórek (pożądana jest konfluencja <50%) i zastąpić świeżą pożywką zawierającą 10 μg/ml blastycydyny, aby wybrać stabilnie transdukowane komórki. (Krzywa zabijania blasticydyny musi być empirycznie wyznaczona dla konkretnej linii komórkowej.)
4. Zmieniaj pożywkę na świeżą zawierającą blastycydynę co 2-3 dni w celu ciągłej selekcji komórek opornych na antybiotyki wykazujących ekspresję reporterów zegarowych (zwykle łącznie 4-6 dni).

4. Zapis bioluminescencji komórek reporterowych

1. Komórki reporterowe nasion

Rozmnażaj odporne na blasticydynę komórki reporterowe i rozdzielaj je na 35-milimetrowe szalki hodowlane. Inkubować w temperaturze 37 °C aż do zlewu. Zwykle przygotowujemy ≥3 potrawy dla każdej linii komórek reporterowych w każdych warunkach do fenotypowania okołodobowego.

2. Synchronizacja i zmiana na nośnik zapisu

1. Odessać pożywkę z konfluentnych komórek reporterowych, przemyć raz PBS i zastąpić DMEM zawierającym 10 μM forskoliny (lub 200 nM deksametazonu). Inkubować w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę w celu zsynchronizowania komórek. (Alternatywnie, komórki mogą być synchronizowane przez cykle temperatury²³ lub wstrząs surowicy²⁴.)
2. Czekając, przygotuj pożywkę zapisową dla komórek 3T3 w następujący sposób: 1x DMEM (HyClone) zawierający 10% FBS, 1x Pen/Strep/Gln, 1 μM forskoliny, 1 mM lucyferyny, 25 mM HEPES, pH 7,4. Stężenie forskoliny w surowicy i forskolinie można określić empirycznie. W przypadku bardzo ciemnych komórek można użyć pożywki wolnej od czerwieni fenolowej.
3. Pod koniec leczenia forskoliną odessać pożywkę i zastąpić ją świeżo przygotowanym nośnikiem do nagrywania.

3. Zapis bioluminescencji komórek reporterowych

1. Po zmianie pożywki przykryj szalki hodowlane sterylnymi szkiełkami nakrywkowymi o średnicy 40 mm i uszczelnij smarem próżniowym, aby zapobiec parowaniu.
2. Załaduj naczynia do luminometru LumiCycle, który jest przechowywany w inkubatorze ustawionym na 36 °C bez_H2Olub_CO2.
3. Rozpocznij rejestrację bioluminescencji w czasie rzeczywistym. Zazwyczaj nagrywamy rytmy przez 1 tydzień, po czym następuje zmiana medium i ciągłe nagrywanie przez drugi tydzień (szczegóły w Savelyev i wsp.)²⁵. (Do nagrywania płytek 96-dołkowych, jako urządzenie rejestrujące użyto Synergy SL2; szczegóły w Dyskusji 1.1.)

5. Analiza i prezentacja danych

Komórki reporterowe ułatwiają ilościowy zapis luminescencji o wysokiej rozdzielczości, co ma kluczowe znaczenie dla określenia fenotypowych efektów na funkcjonowanie zegara okołodobowego. Aby uzyskać parametry okołodobowe, w tym fazę, długość okresu, amplitudę rytmu i szybkość tłumienia, używamy programu LumiCycle Analysis (Actimetrics) do analizy danych bioluminescencyjnych^5,14. Krótko mówiąc, surowe dane są najpierw dopasowywane do linii bazowej, a dane odejmowane od linii bazowej są dopasowywane do fali sinusoidalnej, na podstawie której określane są parametry. W przypadku próbek, które wykazują trwałe rytmy, zwykle osiąga się dobroć dopasowania na poziomie >90%. Ze względu na wysoką przejściową bioluminescencję przy zmianie pożywki, zwykle wykluczamy pierwszy cykl danych z analizy.

Do prezentacji danych, zazwyczaj wykreślamy surowe dane (bioluminescencja, liczby/s) w stosunku do czasu (dni). W razie potrzeby można wykreślić dane odjęte od linii bazowej w celu porównania amplitudy i fazy.

6. Reprezentatywne wyniki

1. Reporterzy okołodobowi specyficzni dla danej fazy

Zegar okołodobowy opiera się na biochemicznym mechanizmie ujemnego sprzężenia^{zwrotnego 1}. Podstawowa pętla sprzężenia zwrotnego składa się z aktywatorów transkrypcyjnych BMAL1 i CLOCK oraz represorów PER i CRY, które działają na okołodobowe elementy wzmacniające E/E'-box, aby wytworzyć rytmiczną ekspresję genów (z fazą poranną, np. Rev-erbα). Pętla rdzenia reguluje i integruje co najmniej dwa inne okołodobowe elementy cis, element wiążący DBP/E4BP4 (D-box; dla fazy dziennej, np. Per3) i element wiążący ROR/REV-ERB (RRE; dla fazy nocnej, np. Bmal1)¹⁷. Kombinatoryczna regulacja za pomocą wielu elementów okołodobowych może prowadzić do powstania nowych faz pośrednich. Na przykład w transkrypcji Cry1 pośredniczą wszystkie trzy elementy okołodobowe (tj. elementy E/E'-box i D-box w promotorze oraz RRE w pierwszym intronie genu Cry1), dając początek odrębnej fazie¹³ Cry1 wieczorem.

Na podstawie tych mechanizmów regulacji genów, wygenerowaliśmy cztery różne konstrukty reporterowe: P(Per2)-dLuc i P(Cry1)-dLuc zawierające zarówno elementy E/E'-box, jak i D-box w regionie regulatorowym^17,26,27; P(Cry1)-Intron-d Luc reprezentujący kombinatoryczną regulację przez wszystkie trzy elementy (tj. E/E'-box, D-box i RRE)^13,17; oraz P(Bmal1)-dLuc regulowany wyłącznie przez RRE^9,17,19,21. Wprowadziliśmy te reportery do komórek 3T3, aby wytworzyć przewidywane odrębne fazy ekspresji reporterowej (Figura 2).

2. Knockdown genu poprzez RNAi i farmakologicznie aktywne związki

Gdy wydajność transfekcji jest wysoka, syntetyczne siRNA może być przejściowo transfekowane do komórek, aby obniżyć ekspresję genów. Gdy transfekcja jest technicznie trudna, wektor ekspresji shRNA może być stabilnie transdukowany do komórek poprzez infekcję lentiwirusową, tak że shRNA wytwarzane przez komórkę jest przetwarzane na siRNA w celu knockdownu genu (KD). Tutaj przedstawiamy efekty KD genów Cry1 i Cry2 przy użyciu siRNA w komórkach U2OS (Figura 3A) i shRNA w komórkach 3T3 przy użyciu wektora ekspresji pLL3.7 Gateway⁹ (Figura 3B). Oprócz komórek 3T3, model U2OS stał się kolejnym wybitnym modelem zegara komórkowego, głównie dlatego, że spełnia kluczowe wymagania dotyczące wysokoprzepustowych badań przesiewowych dostępnych na rynku ludzkich bibliotek siRNA (np. pochodzenia ludzkiego, zdolnych do generowania solidnych rytmów okołodobowych, zwalidowanej funkcji wszystkich znanych genów zegarowych i podatnych na wysoce wydajną transfekcję i ilościowy zapis luminescencji). W obu typach komórek, KD za pośrednictwem RNAi skutkowało fenotypami zegara zgodnymi z poprzednimi badaniami nokautu myszy (KO) i komórkowym KD^5,10,11,28. Na przykład Cry1 KD skraca długość okresu i zmniejsza trwałość rytmu, podczas gdy Cry2 KD wydłuża miesiączkę. Ponadto wybrane małe cząsteczki mogą być wykorzystywane do farmakologicznego celowania i zaburzania funkcji białek (ryc. 3C).

Rysunek 1. System dostarczania genów, w którym pośredniczy lentiwirus. (A) Schemat ideowy dwóch lentiwirusowych wektorów reporterowych P(Per2)-dLuc i konstruktu CMV-EGFP. Pokazany jest tylko region do integracji z genomem komórki gospodarza. W obu konstruktach reporterowych transkrypcja dLuc jest pod bezpośrednią kontrolą promotora Per2. W wektorzeLuc pLV7-Bsd-P(Per2)-d (klonowanie oparte na rekombinacji) koekspresyjny gen oporności na blastycydynę (Bsd) ułatwia selekcję zakażonych komórek. W wektorzeLuc pLV156-P(Per2)-d (klonowanie oparte na ligacji) translacja EGFP odbywa się za pośrednictwem wewnętrznego miejsca wejścia rybosomu (IRES) za dLuc, co pozwala na obserwację wzrokową i sortowanie FACS zakażonych komórek. Ponadto jako izolator używany jest promotor/terminator SV40 (P/T) (patrz dyskusja 1.3). W wektorze kontrolnym CMV-EGFP ekspresja EGFP jest pod kontrolą silnego promotora CMV. (B) Obrazy fluorescencyjne transfekowanych i zakażonych komórek wykazujących ekspresję GFP. Zazwyczaj osiągamy wysoką skuteczność zarówno w przejściowej transfekcji komórek 293T, jak i w zakażeniu lentiwirusowym interesujących nas linii komórkowych, na co wskazuje ekspresja GFP w tych komórkach. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą postać.

Rysunek 2. Specyficzna dla fazy ekspresja reporterów bioluminescencyjnych w komórkach 3T3. Wektory reporterowe lentiwirusowe użyte w tym eksperymencie to pLV7-Bsd-P(Per2)-dLuc, P(Cry1)-dLuc, P(Cry1)-Intron-d Luc i P(Bmal1)-dLuc. Każdy reporter wykazuje odrębną fazę oscylacji, jak wskazują strzałki. Podczas gdy promotory Per2 i Cry1 napędzają szczytową bioluminescencję w fazach poranno-dziennych, a promotor Bmal1 w fazie nocnej, kombinatoryczna regulacja przez P(Cry1)-Intron zawierający elementy E-box, D-box i RRE nadaje wieczorną fazę szczytowej bioluminescencji. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą postać.

Rysunek 3. Genetyczne i farmakologiczne zaburzenia okołodobowych rytmów bioluminescencyjnych w komórkach reporterowych. (A) Wpływ knockdownu Cry1 i Cry2 przez siRNA na rytmy komórkowe komórek reporterowych U2OS. Luminometr LumiCycle został wykorzystany do rejestracji bioluminescencji komórek w szalkach o średnicy 35 mm. Rysunek został zaadaptowany z Odnośnika #10, za zgodą Elsevier (2009). (B) Wpływ knockdownu Cry2 przez shRNA na rytmy komórkowe komórek reporterowych 3T3. Wektor pLL3.7 Gateway zawierający kasetę U6-shRNA został wykorzystany do knockdownu genu Cry2. shRNA2 ma lepszą skuteczność knockdown niż shRNA1, jak określono za pomocą analizy Western blot (dane nie pokazane). Luminometr Synergy został wykorzystany do rejestracji bioluminescencji komórek na 96-dołkowej płytce. Ustawienia nagrywania są następujące: temperatura inkubatora, 33 °C; czas integracji, 15 sek.; czas interwału, 30 min. (C) Wpływ inhibitorów drobnocząsteczkowych na rytmy komórkowe komórek reporterowych U2OS. Chir99021 i Roscovitine są inhibitorami skierowanymi odpowiednio przeciwko GSK-3 i CDK. Do zapisów bioluminescencji komórek na płytkach 384-dołkowych wykorzystano system ViewLux (test Chir99021) oraz luminometr Tecan (test Roscovitine). Rysunek został zaczerpnięty z Reference #19 (Copyright 2008 National Academy of Sciences, USA). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą postać.

Discussion

1. Zmiany w obowiązującym protokole

1.1 Urządzenia rejestrujące i zagadnienia dotyczące przepustowości

Ze względu na swoją dostępność komercyjną, LumiCycle (Actimetrics) stał się najczęściej używanym automatycznym urządzeniem luminometrycznym do rejestracji w czasie rzeczywistym^{4,5,9,19,29-31}. LumiCycle wykorzystuje fotopowielacze (PMT) jako detektory światła, które zapewniają wyjątkowo wysoką czułość i niski poziom szumów¹⁴, a zatem są szczególnie ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM	HyClone	SH30243FS	Do regularnego wzrostu komórek
DMEM	Invitrogen	12100-046	Do luminometrii
FBS	HyClone	SH3091003
Pen/Strep/Gln(100x)	HyClone	SV3008201
B-27	Invitrogen	17504-044
D-Luciferin	Biosynth	L-8220
Poly-L-lizyna	Sigma	P4707
Polybrene	Millipore	TR-1003-G
Forskolin	Sigma	F6886
Wszystkie inne chemikalia	Sigma
Sprzęt
Inkubator			5% CO2 przy 37 stopniach; C
		do hodowli tkankowych
			Opcjonalny kontrast fazowy
LumiCycle	Actimetrics