Artykuł metodologiczny

Monitorowanie komórkowych autonomicznych rytmów okołodobowych ekspresji genów z wykorzystaniem reporterów bioluminescencyjnych lucyferazy

DOI:

10.3791/4234

⸱

27 września 2012

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biological Sciences, The University of Memphis

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zegary okołodobowe funkcjonują w obrębie poszczególnych komórek, tzn. są autonomiczne komórkowo. W niniejszej pracy opisujemy metody tworzenia autonomicznych komórkowo modeli zegara z wykorzystaniem nieinwazyjnej technologii bioluminescencji w czasie rzeczywistym opartej na lucyferazie. Komórki reporterowe stanowią praktyczne, funkcjonalne systemy modelowe do badania biologii okołodobowej.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

U ssaków wiele aspektów zachowania i fizjologii, takich jak cykle czuwania i snu oraz metabolizm wątroby, jest regulowanych przez endogenne zegary okołodobowe (przegląd1,2). System pomiaru czasu okołodobowego jest hierarchiczną siecią wielooscylatorową, w której zegar centralny zlokalizowany w jądrze nadskrzyżowaniowym (SCN) synchronizuje i koordynuje zegary poza-SCN oraz zegary obwodowe w innych częściach organizmu1,2. Pojedyncze komórki stanowią jednostki funkcjonalne odpowiedzialne za generowanie i utrzymywanie rytmów okołodobowych3,4, a oscylatory w różnych typach tkanek organizmu wykorzystują uderzająco podobny biochemiczny mechanizm ujemnego sprzężenia zwrotnego. Jednak ze względu na interakcje na poziomie sieci neuronalnej w SCN oraz rytmiczne sygnały systemowe na poziomie całego organizmu, rytmy okołodobowe w skali organizmu niekoniecznie są autonomiczne komórkowo5-7. W porównaniu do tradycyjnych badań aktywności lokomotorycznej in vivo oraz eksplantów SCN ex vivo, testy komórkowe in vitro umożliwiają wykrycie autonomicznych komórkowo defektów rytmów okołodobowych5,8. Pod względem strategicznym modele komórkowe są łatwiejsze do manipulacji eksperymentalnej w celu charakterystyki fenotypowej oraz szybkiego odkrywania podstawowych mechanizmów działania zegara5,8-13.

Ponieważ rytmy okołodobowe są dynamiczne, do oceny funkcji zegara biologicznego niezbędne są pomiary podłużne o wysokiej rozdzielczości czasowej. W ostatnich latach rejestracja bioluminescencji w czasie rzeczywistym z wykorzystaniem lucyferazy świetlika jako reportera stała się powszechną techniką badania rytmów okołodobowych u ssaków14,15, ponieważ pozwala ona na badanie trwałości i dynamiki rytmów molekularnych. Aby monitorować autonomiczne komórkowo rytmy okołodobowe ekspresji genów, reportery lucyferazy można wprowadzić do komórek poprzez transfekcję przejściową13,16,17 lub stabilną transdukcję5,10,18,19. W niniejszym opracowaniu opisujemy protokół stabilnej transdukcji z wykorzystaniem dostarczania genów za pomocą lentiwirusa. System wektora lentiwirusowego jest lepszy od metod tradycyjnych, takich jak transfekcja przejściowa i transmisja w linii zarodkowej, ze względu na swoją wydajność i wszechstronność: umożliwia on efektywne dostarczanie i stabilną integrację z genomem gospodarza zarówno w komórkach dzielących się, jak i niedzielących się20. Po utworzeniu linii komórkowej reporterowej dynamikę funkcji zegara można badać za pomocą rejestracji bioluminescencji. Najpierw opisujemy generowanie linii reporterowych P(Per2)-dLuc, a następnie prezentujemy dane z tego oraz innych reporterów okołodobowych. W tych analizach jako modele komórkowe wykorzystano fibroblasty mysie 3T3 oraz ludzkie komórki osteosarkoma U2OS. Omawiamy również różne sposoby wykorzystania tych modeli zegara w badaniach okołodobowych. Metody opisane w niniejszym opracowaniu mogą być stosowane w szerokiej gamie typów komórek do badania komórkowych i molekularnych podstaw zegarów okołodobowych oraz mogą okazać się przydatne w rozwiązywaniu problemów w innych systemach biologicznych.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Konstrukcja lentiwirusewych reporterów lucyferazy

Konstrukt reporterowy rytmu okołodobowego ssaków zazwyczaj zawiera kasetę ekspresyjną, w której promotor okołodobowy jest połączony z genem lucyferazy. Do klonowania DNA powszechnie stosuje się strategie oparte zarówno na ligacji, jak i rekombinacji. Jako przykład opisujemy tutaj metodę klonowania Gateway opartą na rekombinacji w celu wytworzenia lentiwirusem reportera P(Per2)-dLuc, w którym destabilizowana lucyferaza (dLuc) znajduje się pod kontrolą mysiego promotora Per2.

  1. Klonowanie promotora Per2. Wykorzystaj PCR do amplifikacji fragmentu DNA promotora Per2 o długości 526 bp, znajdującego się powyżej miejsca startu transkrypcji, z klonu BAC Per2 myszy9-13, używając prawego primeru (5'-CTCGAGCGGATTACCGAGGCTGGTCACG TC-3') oraz lewego primeru (5'-CTCGAGTCCCTTGCTCGGCCCGTCAC TTGG-3'), a następnie sklonuj go do wektora pENTR5'-TOPO (Invitrogen), aby otrzymać pENTR5'-P(Per2).
  2. Klonowanie dLuc. Konstrukt dLuc zawiera gen lucyferazy świetlika oraz sekwencję PEST na C-końcu w celu szybkiej degradacji białka, zgodnie z wcześniejszym opisem21. Wykorzystaj PCR do amplifikacji fragmentu DNA dLuc i sklonuj go do wektora pENTR/D-TOPO (Invitrogen), aby otrzymać pENTR/D-dLuc.
  3. Konstrukcja wektora reporterowego. Wymieszaj dwa plazmidy pENTR, pENTR5'-P(Per2) oraz pENTR/D-dLuc, z lentiwirusem wektorem docelowym pLV7-Bsd (Bsd, gen oporności na blastycydynę) i przeprowadź reakcję rekombinacji z użyciem enzymu Clonase, aby otrzymać reporter pLV7-Bsd-P(Per2)-dLuc (Rysunek 1). pLV7-Bsd jest zmodyfikowaną wersją (stworzoną w naszym laboratorium) wektora pLenti6/R4R2/V5-DEST (Invitrogen), w której sekwencje elementu regulacyjnego potranskrypcyjnego wirusa zapalenia wątroby świstaka (WPRE)22 zostały wstawione bezpośrednio za kasetą ekspresyjną w celu zwiększenia ekspresji genu.

2. Produkcja cząstek lentiwirusowych

1. Wysiew komórek 293T (dzień 1)

  1. Hodować ludzkie komórki embrionalnej nerki (HEK) 293T do osiągnięcia 90-100% konfluencji w standardowym medium DMEM uzupełnionym o 10% FBS i 1x Penicillin-Streptomycin-Glutamine (PSG) na szalkach hodowlanych 10 cm. (Szybko rosnące komórki o niskim numerze pasażu są kluczowe dla efektywnej transfekcji.)
  2. Przed wysianiem komórek do transfekcji, pokryć płytki hodowlane 6-dołkowe, dodając 1 ml 0,001% poli-L-lizyny w PBS do każdego dołka i inkubując w temperaturze pokojowej przez 20 min. Odessać roztwór i raz wypłukać 1x PBS przed użyciem.
  3. Dysocjować komórki 293T za pomocą trypsyny i wysiać 0,75 x 106 komórek do każdego dołka uprzednio pokrytych płytek w 2 ml standardowego DMEM. Dokładnie zamieszać płytki okrężnymi ruchami, aby uzyskać równomierny rozkład komórek w każdym dołku. Hodować komórki w inkubatorze w temperaturze 37 °C przez noc.

2. Transfekcja przejściowa poprzez wytrącanie CaPO4/DNA (dzień 2)

  1. Obserwować zasiane komórki od 1. dnia. Komórki powinny osiągnąć konfluencję na poziomie 80-90%.
  2. Przygotować mieszaninę do transfekcji plazmidowej w probówce do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 ml, dodając 2 μg DNA plazmidowego reporterowego lentiwirusowego (np. pLV7-P(Per2)-dLuc; Liu lab) oraz 3 wektory opakowujące (1,3 μg Gag/Pol, 0,5 μg Rev i 0,7 μg VSVG; Invitrogen). Jako kontrolę zarówno dla transfekcji, jak i późniejszej infekcji, zazwyczaj do transfekcji dołączamy dodatkową studzienkę dla lentiwirusowego wektora ekspresji GFP, pLV156-CMV-EGFP (Rycyna 1A), zawierającego ulepszone zielone białko fluorescencyjne (EGFP) pod kontrolą promotora CMV, zgodnie z wcześniejszym opisem20.
  3. Do mieszaniny plazmidów z kroku 2 dodać 100 μl 0,25 M CaCl2 (rozcieńczonego wodą ddH2O wolną od DNazy/RNazy z roztworu stokowego 2,5 M) i dokładnie wymieszać. Następnie dodać 100 μl roztworu 2x BBS (50 mM BES, 280 mM NaCl, 1,5 mM Na2HPO4, pH 6,95) i wymieszać delikatnie, ale dokładnie. Inkubować mieszaninę DNA w temperaturze pokojowej przez 15 min.
  4. W czasie oczekiwania odessać medium z komórek 293T i wymienić je na 2 ml świeżego medium. Włożyć płytkę z powrotem do inkubatora na co najmniej 10 min, aby ustabilizować pH medium przed transfekcją.
  5. Mieszaninę do transfekcji z kroku 3 dodawać do komórek 293T kropla po kropli. Delikatnie zakręcić płytką i obserwować tworzenie się cząstek pod mikroskopem. Inkubować w 5% CO2, w 37 °C przez noc. (Tworzenie się drobnych cząstek osadu CaPO4/DNA jest kluczowe dla wydajnej transfekcji).

3. Zbiór cząsteczek wirusowych (dni 3-4)

  1. Około 16 godzin po transfekcji (dzień 3), kiedy komórki powinny osiągnąć 100% konfluencji, odessać pożywkę z komórek i zastąpić ją 2 ml świeżego standardowego DMEM. Inkubować przez noc w temperaturze 37 °C.
  2. W dniu 4 ocenić wydajność transfekcji, obserwując ekspresję EGFP w komórkach kontrolnych (wydajność transfekcji na poziomie 90-100% przy wysokiej ekspresji EGFP jest wiarygodnym wskaźnikiem dobrej jakości preparatu wirusowego).
  3. Zebrać pożywkę zawierającą wydzielone, zakaźne cząstki wirusowe. Wirować przy >2,000 x g przez 5 min w celu usunięcia pozostałych komórek 293T, a następnie zebrać nadosad zawierający wirusy. Alternatywnie pożywkę można oczyścić za pomocą filtra membranowego o porach 0.45 μm. Cząstki wirusowe są gotowe do użycia w infekcji.

3. Infekowanie komórek 3T3

1. Wysiewanie komórek 3T3 (dzień 3)

Rozdziel i wysiej odpowiednią liczbę (~12 000) komórek 3T3 na płytkę 12-dołkową, aby uzyskać 20-30% konfluencji do następnego dnia. Inkubuj w temperaturze 37 °C przez noc.

2. Zainfekuj komórki 3T3 (dzień 4)

  1. Obserwuj wysiane komórki. Do infekcji pożądana jest konfluencja na poziomie 20-30% (poniżej 50%).
  2. Do zebranego medium zawierającego cząsteczki wirusa dodaj polybrene do stężenia końcowego 5 μg/ml. Wymieszaj dokładnie za pomocą pipety.
  3. Odsącz medium z komórek 3T3 i dodaj 1 ml powyższej mieszaniny wirusowej do każdego dołka. Inkubuj przez noc w temperaturze 37 °C. (Polybrene stosuje się w celu zwiększenia wydajności infekcji, ale nie jest on absolutnie wymagany. Ponieważ może być toksyczny dla niektórych komórek, zaleca się wcześniejsze przeprowadzenie testów).

3. Selekcja zakażonych komórek (dzień 5 i kolejne)

  1. Dwadzieścia cztery godziny po infekcji odessać pożywkę zawierającą wirusa i polybrene z zainfekowanych komórek, przemyć raz 1x PBS i wymienić na świeżą pożywkę. Inkubować w 37 °C przez noc w celu rekuperacji i wzrostu.
  2. Po osiągnięciu konfluencji (zazwyczaj 1-2 dni później) przesiać komórki i inkubować w 37 °C przez noc.
  3. Następnego dnia odessać pożywkę z komórek (pożądana konfluencja <50%) i zastąpić ją świeżą pożywką zawierającą 10 μg/ml Blasticidyny w celu selekcji stabilnie transdukowanych komórek. (Krzywa przeżywalności dla Blasticidyny musi zostać wyznaczona empirycznie dla danej linii komórkowej).
  4. Wymieniać na świeżą pożywkę z Blasticidyną co 2-3 dni w celu ciągłej selekcji komórek opornych na antybiotyk wykazujących ekspresję reporterów zegara (zazwyczaj łącznie 4-6 dni).

4. Rejestracja bioluminescencji komórek reporterowych

1. Wysianie komórek reporterowych

Namnażaj komórki reporterowe oporne na blasticydynę i rozdziel je na 35-milimetrowe szalki hodowlane. Inkubuj w temperaturze 37 °C do uzyskania konfluencji. Do fenotypowania rytmów okołodobowych zazwyczaj przygotowujemy ≥3 szalki dla każdej linii komórek reporterowych w każdym z zastosowanych warunków.

2. Synchronizacja i zmiana na podłoże do rejestracji

  1. Odssać pożywkę z konfluentnych komórek reporterowych, przemyć raz PBS i zastąpić pożywką DMEM zawierającą 10 μM forskoliny (lub 200 nM deksametazonu). Inkubować w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę w celu synchronizacji komórek. (Alternatywnie, synchronizację komórek można przeprowadzić za pomocą cykli temperaturowych23 lub szoku surowiczego24.)
  2. W czasie oczekiwania przygotować pożywkę do pomiarów dla komórek 3T3 w następujący sposób: 1x DMEM (HyClone) zawierający 10% FBS, 1x Pen/Strep/Gln, 1 μM forskoliny, 1 mM lucyferyny, 25 mM HEPES, pH 7.4. Stężenie surowicy i forskoliny można określić empirycznie. W przypadku komórek o bardzo słabej luminescencji można zastosować pożywkę bez czerwieni fenolowej.
  3. Po zakończeniu traktowania forskoliną odessać pożywkę i zastąpić ją świeżo przygotowaną pożywką do pomiarów.

3. Pomiar bioluminescencji komórek reporterowych

  1. Po wymianie pożywki przykryć szalki hodowlane sterylnymi szkiełkami okrywnymi o średnicy 40 mm i uszczelnić je smarem próżniowym, aby zapobiec odparowywaniu.
  2. Umieścić szalki w luminometrze LumiCycle, który znajduje się w inkubatorze ustawionym na 36 °C bez dostępu H2O lub CO2.
  3. Rozpocząć rejestrację bioluminescencji w czasie rzeczywistym. Zazwyczaj rejestrujemy rytmy przez 1 tydzień, po czym następuje wymiana pożywki i ciągła rejestracja przez drugi tydzień (szczegóły u Savelyev et al.)25. (Do rejestracji z płytek 96-dołkowych jako urządzenie pomiarowe wykorzystano Synergy SL2; szczegóły w sekcji Dyskusja 1.1.)

5. Analiza i prezentacja danych

Komórki reporterowe umożliwiają wysokorozdzielczą ilościową rejestrację luminescencji, co jest kluczowe dla określenia efektów fenotypowych w funkcji zegara biologicznego. W celu uzyskania parametrów okołodobowych, w tym fazy, długości okresu, amplitudy rytmu oraz tempa tłumienia, wykorzystujemy program LumiCycle Analysis (Actimetrics) do analizy danych bioluminescencyjnych5,14. W skrócie, w pierwszej kolejności dopasowywana jest linia bazowa do surowych danych, a następnie dane po odjęciu linii bazowej są dopasowywane do fali sinusoidalnej, na podstawie której wyznacza się parametry. W przypadku próbek wykazujących trwałe rytmy, zazwyczaj osiąga się dobroć dopasowania >90%. Ze względu na wysoką przejściową bioluminescencję po zmianie pożywki, zazwyczaj wykluczamy z analizy dane z pierwszego cyklu.

W celu prezentacji danych zazwyczaj przedstawiamy surowe dane (bioluminescencję, zliczenia/s) w funkcji czasu (dni). W razie potrzeby można przedstawić dane po odjęciu wartości bazowej, aby porównać amplitudę i fazę.

6. Reprezentatywne wyniki

1. Raporty okołodobowe specyficzne dla fazy

Zegar okołodobowy opiera się na biochemicznym mechanizmie ujemnego sprzężenia zwrotnego1Rdzenna pętla sprzężenia zwrotnego składa się z aktywatorów transkrypcji BMAL1 i CLOCK oraz represorów PER i CRY, które oddziałują na okołodobowe elementy wzmacniające E/E'-box, wywołując rytmiczną ekspresję genów (z fazą poranną, np., Rev-erbα). Pętla rdzeniowa reguluje i integruje co najmniej dwa inne cis-elementy okołodobowe: element wiążący DBP/E4BP4 (D-box; dla fazy dnia, np., Per3) oraz element wiążący ROR/REV-ERB (RRE; dla fazy nocnej, np., Bmal1)17Regulacja kombinatoryczna przez wiele elementów okołodobowych może generować nowe fazy pośrednie. Na przykład, Cry1 transkrypcja jest pośredniczona przez wszystkie trzy elementy okołodobowe (t. j., elementy E/E'-box i D-box w promotorze oraz RRE w pierwszym intronie Cry1 gen), co prowadzi do powstania odrębnych Cry1 faza wieczorna13.

W oparciu o te mechanizmy regulacji genów opracowaliśmy cztery różne konstrukty reporterowe: P(Per2)-dLuc oraz P(Cry1)-dLuc reportery zawierające zarówno elementy E/E'-box, jak i D-box w regionie regulatorowym17,26,27; P(Cry1)-Intron-dLuc reprezentujące regulację kombinatoryczną przez wszystkie trzy elementy (t. j., sekwencja E/E'-box, sekwencja D-box i RRE)13,17; i P(Bmal1)-dLuc regulowane wyłącznie przez RRE9,17,19,21Wprowadziliśmy te reportery do komórek 3T3, aby uzyskać przewidywane, odrębne fazy ekspresji reportera (Rysunek 2).

2. Wyciszanie genów za pomocą RNAi i związków farmakologicznie czynnych

Przy wysokiej wydajności transfekcji, syntetyczne siRNA mogą być przejściowo transfekowane do komórek w celu wyciszenia ekspresji genów. W przypadku trudności technicznych z transfekcją, wektor ekspresyjny shRNA może zostać stabilnie transdukowany do komórek za pomocą infekcji lentiwirusowej, tak aby produkowane przez komórkę shRNA było przetwarzane do siRNA w celu wyciszenia genów (KD). Przedstawiamy tutaj efekty KD genów Cry1 i Cry2 z użyciem siRNA w komórkach U2OS (Rycina 3A) oraz shRNA w komórkach 3T3 z wykorzystaniem wektora ekspresyjnego pLL3.7 Gateway9 (Rycina 3B). Oprócz komórek 3T3, model U2OS stał się innym czołowym komórkowym modelem zegara, głównie dlatego, że spełnia kluczowe wymagania dla wysokoprzepustowego przesiewania komercyjnie dostępnych ludzkich bibliotek siRNA (np. ludzkie pochodzenie, zdolność do generowania stabilnych rytmów okołodobowych, zwalidowana funkcja wszystkich znanych genów zegara oraz podatność na wysoce wydajną transfekcję i ilościowy pomiar luminescencji). W obu typach komórek KD zapśredniczone przez RNAi doprowadziło do wystąpienia fenotypów zegara zgodnych z poprzednimi badaniami nad nokautem (KO) u myszy oraz badaniami KD na komórkach5,10,11,28. Na przykład, KD Cry1 skraca długość okresu i zmniejsza trwałość rytmu, podczas gdy KD Cry2 wydłuża okres. Dodatkowo, wybrane małe cząsteczki mogą być wykorzystane do farmakologicznego celowania i zaburzania funkcji białek (Rycina 3C).

Schemat wektorów do edycji genów i wyniki transfekcji; obejmuje konstrukty pLV7-Bsd i pLV156-EGFP.
Rycina 1. System dostarczania genów za pośrednictwem lentiwirusów. (A) Schemat dwóch lentiwirusowych wektorów reporterowych P(Per2)-dLuc oraz konstruktu CMV-EGFP. Przedstawiono wyłącznie region przeznaczony do integracji z genomem komórki gospodarza. W obu konstruktach reporterowych transkrypcja dLuc znajduje się pod bezpośrednią kontrolą promotora Per2. W wektorze pLV7-Bsd-P(Per2)-dLuc (klonowanie oparte na rekombinacji) koeksprymowany gen oporności na blastycydynę (Bsd) ułatwia selekcję zainfekowanych komórek. W wektorze pLV156-P(Per2)-dLuc (klonowanie oparte na ligacji) translacja EGFP jest mediowana przez wewnętrzną sekwencję wejścia rybosomu (IRES) znajdującą się poniżej dLuc, co umożliwia wizualną obserwację i sortowanie zainfekowanych komórek za pomocą FACS. Dodatkowo, promotor/terminator SV40 (P/T) jest wykorzystywany jako izolator (patrz sekcja 1.3). W wektorze kontrolnym CMV-EGFP ekspresja EGFP znajduje się pod kontrolą silnego promotora CMV. (B) Obrazy fluorescencyjne transfekowanych i zainfekowanych komórek eksprymujących GFP. Zazwyczaj osiągamy wysoką wydajność zarówno w transfekcji przejściowej komórek 293T, jak i w infekcji lentiwirusowej linii komórkowych będących przedmiotem naszych zainteresowań, co potwierdza ekspresja GFP w tych komórkach. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną rycinę.

Wykres aktywności bioluminescencji; P(Per2), P(Cry1), P(Cry1-Intron), P(Bmal1) w funkcji czasu w dniach.
Rycina 2. Ekspresja reporterów bioluminescencji specyficzna dla fazy w komórkach 3T3. Lentiwirusowe wektory reporterowe użyte w tym eksperymencie to pLV7-Bsd-P(Per2)-dLuc, P(Cry1)-dLuc, P(Cry1)-Intron-dLuc oraz P(Bmal1)-dLuc. Każdy reporter wykazuje odmienną fazę oscylacji, co wskazują strzałki. Podczas gdy promotory Per2 i Cry1 powodują szczyt bioluminescencji w fazach porannych i dziennych, a promotor Bmal1 w fazie nocnej, regulacja kombinatoryczna przez P(Cry1)-Intron zawierający elementy E-box, D-box i RRE nadaje szczytowi bioluminescencji fazę wieczorną. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą rycinę.

Wykresy z testu bioluminescencyjnego pokazujące wpływ RNAi i inhibitorów na ekspresję genów w komórkach U2OS.
Rycina 3. Genetyczna i farmakologiczna perturbacja okołodobowych rytmów bioluminescencji w komórkach reporterowych. (A) Wpływ wyciszenia genów Cry1 i Cry2 za pomocą siRNA na rytmy komórkowe reporterowych komórek U2OS. Do pomiaru bioluminescencji komórek w szalkach 35 mm użyto luminometru LumiCycle. Rycina została opracowana na podstawie źródła nr 10, za zgodą Elsevier (2009). (B) Wpływ wyciszenia Cry2 za pomocą shRNA na rytmy komórkowe reporterowych komórek 3T3. Do wyciszenia genu Cry2 użyto wektora pLL3.7 Gateway zawierającego kasetę U6-shRNA. shRNA2 wykazuje lepszą wydajność wyciszenia niż shRNA1, co określono za pomocą analizy Western blot (dane nie zostały przedstawione). Do pomiaru bioluminescencji komórek na płytce 96-dołkowej użyto luminometru Synergy. Parametry pomiaru były następujące: temperatura inkubatora, 33 °C; czas całkowania, 15 sec; odstęp czasu, 30 min. (C) Wpływ inhibitorów małocząsteczkowych na rytmy komórkowe reporterowych komórek U2OS. Chir99021 i Roscovitine są inhibitorami skierowanymi odpowiednio przeciwko GSK-3 i CDK. Do pomiarów bioluminescencji komórek na płytkach 384-dołkowych użyto systemu ViewLux (test Chir99021) oraz luminometru Tecan (test Roscovitine). Rycina została opracowana na podstawie źródła nr 19 (Copyright 2008 National Academy of Sciences, U.S.A.). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną rycinę.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Modyfikacje obecnego protokołu

1.1 Urządzenia rejestrujące i kwestie przepustowości

Ze względu na dostępność komercyjną, LumiCycle (Actimetrics) stał się najczęściej używanym zautomatyzowanym luminometrem do rejestracji w czasie rzeczywistym4,5,9,19,29-31. LumiCycle wykorzystuje lampy fotopowielaczowe (PMT) jako detektory światła, które zapewniają niezwykle wysoką czułość i niski poziom szumów14, przez co urządzenie to jest szczególnie odpowiedni...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nie zgłoszono żadnych konfliktów interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Praca ta była częściowo wspierana przez National Science Foundation (IOS-0920417) (ACL).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
DMEMHyCloneSH30243FSDo rutynowej hodowli komórek
DMEMInvitrogen12100-046Do luminometrii
FBS (płodowa surowica bydlęca)HyCloneSH3091003
Pen/Strep/Gln(100x)HyCloneSV3008201
B-27Invitrogen17504-044
D-lucyferynaBiosynthL-8220
Poli-L-lizynaSigmaP4707
PolybreneMilliporeTR-1003-G
ForskolinaSigmaF6886
Wszystkie pozostałe odczynniki chemiczneSigma
Sprzęt
Inkubator do hodowli tkankowych5% CO2 w temperaturze 37°C °C
Dygestorium do hodowli tkankowychz certyfikatem BSL-2
Światło &mikroskop fluorescencyjnyOpcjonalnie kontrast fazowy
LumiCycleActimetrics

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Reppert, S. M., Weaver, D. R. Coordination of circadian timing in mammals. Nature. 418, 935-941 (2002).
  2. Hastings, M. H., Reddy, A. B., Maywood, E. S. A clockwork web: circadian timing in brain and periphery, in health and disease. Nat. Rev. Neurosci. 4, 649-661 (2003).
  3. Nagoshi, E. Circadian gene expression in individual fibroblasts: cell-autonomous and self-sustained oscillators pass time to daughter cells. Cell. 119, 693-705 (2004).
  4. Welsh, D. K. Bioluminescence imaging of individual fibroblasts reveals persistent, independently phased circadian rhythms of clock gene expression. Curr. Biol. 14, 2289-2295 (2004).
  5. Liu, A. C. Intercellular coupling confers robustness against mutations in the SCN circadian clock network. Cell. 129, 605-616 (2007).
  6. Kornmann, B. System-driven and oscillator-dependent circadian transcription in mice with a conditionally active liver clock. PLoS Biol. 5, e34(2007).
  7. Hogenesch, J. B., Herzog, E. D. Intracellular and intercellular processes determine robustness of the circadian clock. FEBS Lett. 585, 1427-1434 (2011).
  8. DeBruyne, J. P., Weaver, D. R., Reppert, S. M. Peripheral circadian oscillators require CLOCK. Curr. Biol. 17, 538-539 (2007).
  9. Liu, A. C. Redundant function of REV-ERBalpha and beta and non-essential role for Bmal1 cycling in transcriptional regulation of intracellular circadian rhythms. PLoS Genet. 4, e1000023(2008).
  10. Zhang, E. E. A genome-wide RNAi screen for modifiers of the circadian clock in human cells. Cell. 139, 199-210 (2009).
  11. Baggs, J. E. Network features of the mammalian circadian clock. PLoS Biol. 7, e52(2009).
  12. Hirota, T. High-throughput chemical screen identifies a novel potent modulator of cellular circadian rhythms and reveals CKIalpha as a clock regulatory kinase. PLoS Biol. 8, e1000559(2010).
  13. Ukai-Tadenuma, M. Delay in feedback repression by cryptochrome 1 is required for circadian clock function. Cell. 144, 268-281 (2011).
  14. Yamazaki, S., Takahashi, J. S. Real-time luminescence reporting of circadian gene expression in mammals. Methods Enzymol. 393, 288-301 (2005).
  15. Welsh, D. K., Imaizumi, T., Kay, S. A. Real-time reporting of circadian-regulated gene expression by luciferase imaging in plants and mammalian cells. Methods Enzymol. 393, 269-288 (2005).
  16. Sato, T. K. Feedback repression is required for mammalian circadian clock function. Nat. Genet. 38, 312-319 (2006).
  17. Ueda, H. R. System-level identification of transcriptional circuits underlying mammalian circadian clocks. Nat. Genet. 37, 187-192 (2005).
  18. Brown, S. A. The period length of fibroblast circadian gene expression varies widely among human individuals. PLoS Biol. 3, e338(2005).
  19. Hirota, T. A chemical biology approach reveals period shortening of the mammalian circadian clock by specific inhibition of GSK-3beta. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 20746-20751 (2008).
  20. Tiscornia, G., Singer, O., Verma, I. M. Production and purification of lentiviral vectors. Nat. Protoc. 1, 241-245 (2006).
  21. Ueda, H. R. A transcription factor response element for gene expression during circadian night. Nature. 418, 534-539 (2002).
  22. Zufferey, R., Donello, J. E., Trono, D., Hope, T. J. Woodchuck hepatitis virus posttranscriptional regulatory element enhances expression of transgenes delivered by retroviral vectors. J. Virol. 73, 2886-2892 (1999).
  23. Buhr, E. D., Yoo, S. H., Takahashi, J. S. Temperature as a universal resetting cue for mammalian circadian oscillators. Science. 330, 379-385 (2010).
  24. Balsalobre, A., Damiola, F., Schibler, U.A serum shock induces circadian gene expression in mammalian tissue culture cells. Cell. 93, 929-937 (1998).
  25. Savelyev, S. A., Larsson, K. C., Johansson, A., Lundkvist, G. B. S. Slice Preparation, Organotypic Tissue Culturing and Luciferase Recording of Clock Gene Activity in the Suprachiasmatic Nucleus. J. Vis. Exp. (48), e2439(2011).
  26. Akashi, M., Ichise, T., Mamine, T., Takumi, T. Molecular mechanism of cell-autonomous circadian gene expression of Period2, a crucial regulator of the mammalian circadian clock. Mol. Biol. Cell. 17, 555-565 (2006).
  27. Ohno, T., Onishi, Y., Ishida, N. A novel E4BP4 element drives circadian expression of mPeriod2. Nucleic Acids Res. 35, 648-655 (2007).
  28. Maier, B. A large-scale functional RNAi screen reveals a role for CK2 in the mammalian circadian clock. Genes Dev. 23, 708-718 (2009).
  29. Yoo, S. H. PERIOD2::LUCIFERASE real-time reporting of circadian dynamics reveals persistent circadian oscillations in mouse peripheral tissues. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 5339-5346 (2004).
  30. Liu, A. C., Lewis, W. G., Kay, S. A. Mammalian circadian signaling networks and therapeutic targets. Nat. Chem. Biol. 3, 630-639 (2007).
  31. Ko, C. H. Emergence of noise-induced oscillations in the central circadian pacemaker. PLoS Biol. 8, e1000513(2010).
  32. Izumo, M., Johnson, C. H., Yamazaki, S. Circadian gene expression in mammalian fibroblasts revealed by real-time luminescence reporting: temperature compensation and damping. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 16089-16094 (2003).
  33. Izumo, M., Sato, T. R., Straume, M., Johnson, C. H. Quantitative analyses of circadian gene expression in mammalian cell cultures. PLoS Comput. Biol. 2, e136(2006).
  34. Chen, Z. Identification of diverse modulators of central and peripheral circadian clocks by high-throughput chemical screening. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 101-106 (2011).
  35. Yamaguchi, S. Synchronization of cellular clocks in the suprachiasmatic nucleus. Science. 302, 1408-1412 (2003).
  36. Akashi, M., Hayasaka, N., Yamazaki, S., Node, K. Mitogen-activated protein kinase is a functional component of the autonomous circadian system in the suprachiasmatic nucleus. J. Neurosci. 28, 4619-4623 (2008).
  37. Hoshino, H., Nakajima, Y., Ohmiya, Y. Luciferase-YFP fusion tag with enhanced emission for single-cell luminescence imaging. Nat. Methods. 4, 637-639 (2007).
  38. Asai, M. Visualization of mPer1 transcription in vitro: NMDA induces a rapid phase shift of mPer1 gene in cultured SCN. Curr. Biol. 11, 1524-1527 (2001).
  39. Wilsbacher, L. D. Photic and circadian expression of luciferase in mPeriod1-luc transgenic mice in vivo. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 489-494 (2002).
  40. Yamazaki, S. Resetting central and peripheral circadian oscillators in transgenic rats. Science. 288, 682-685 (2000).
  41. Welsh, D. K., Noguchi, T. Cellular bioluminescence imaging. Imaging: A Laboratory Manual. Yuste, R. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. 369-385 (2011).
  42. Nakajima, Y. Enhanced beetle luciferase for high-resolution bioluminescence imaging. PLoS One. 5, e10011(2010).
  43. Guilding, C. A riot of rhythms: neuronal and glial circadian oscillators in the mediobasal hypothalamus. Mol. Brain. 2, 28(2009).
  44. O'Neill, J. S. cAMP-dependent signaling as a core component of the mammalian circadian pacemaker. Science. 320, 949-953 (2008).
  45. Fuller, P. M., Lu, J., Saper, C. B. Differential rescue of light- and food-entrainable circadian rhythms. Science. 320, 1074-1077 (2008).
  46. Mukherjee, S. Knockdown of Clock in the ventral tegmental area through RNA interference results in a mixed state of mania and depression-like behavior. Biol. Psychiatry. 68, 503-511 (2010).
  47. Saijo, K. A Nurr1/CoREST pathway in microglia and astrocytes protects dopaminergic neurons from inflammation-induced death. Cell. 137, 47-59 (2009).
  48. Elias, G. M. Synapse-specific and developmentally regulated targeting of AMPA receptors by a family of MAGUK scaffolding proteins. Neuron. 52, 307-320 (2006).
  49. Isojima, Y. CKIepsilon/delta-dependent phosphorylation is a temperature-insensitive, period-determining process in the mammalian circadian clock. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 15744-15749 (2009).
  50. Bucan, M., Abel, T. The mouse: genetics meets behaviour. Nat. Rev. Genet. 3, 114-123 (2002).
  51. Hughes, M. E. Harmonics of circadian gene transcription in mammals. PLoS Genet. 5, e1000442(2009).
  52. Atwood, A. Cell-autonomous circadian clock of hepatocytes drives rhythms in transcription and polyamine synthesis. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 18560-18565 (2011).
  53. Panda, S. Coordinated transcription of key pathways in the mouse by the circadian clock. Cell. 109, 307-320 (2002).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

lentiwirusowy reporterrejestracja bioluminescencjikom rki z reporterem rytmu oko odobowegoreporter Per2 dLucprotok stabilnej transdukcjibioluminescencja w czasie rzeczywistymoko odobowa ekspresja gen w

Powiązane artykuły