Artykuł metodologiczny

Podsiatkówkowe wstrzykiwanie wektorów terapii genowej i komórek macierzystych do oka myszy w okresie okołodniowym

DOI:

10.3791/4286

⸱

25 listopada 2012

 ,  ,  ,  , 
1Bernard and Shirlee Brown Glaucoma Laboratory, Department of Ophthalmology, Columbia University , 2Institute of Human Nutrition, College of Physicians & Surgeons, Columbia University , 3Omics Laboratory, University of Iowa , 4Department of Ophthalmology and Visual Sciences, University of Iowa

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Niniejsza technika chirurgiczna przedstawia wstrzykiwanie wektorów terapii genowej oraz komórek macierzystych do przestrzeni podsiatkówkowej oka myszy.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Utrata wzroku dotyka około 3,4 miliona osób w Stanach Zjednoczonych i przewiduje się, że liczba ta wzrośnie w nadchodzących latach.1 W ostatnim czasie terapia genowa i przeszczepy komórek macierzystych stały się kluczowymi narzędziami terapeutycznymi w leczeniu ślepoty wynikającej z chorób degeneracyjnych siatkówki. Kilka form transplantacji autologicznej w przebiegu związanej z wiekiem degeneracji plamki żółtej (AMD), takich jak przeszczep komórek nabłonka pigmentowego tęczówki, przyniosło obiecujące wyniki, a rozpoczęły się badania kliniczne u ludzi nad innymi formami terapii genowych i komórkami macierzystymi.2 Obejmują one terapię zastępczą genu RPE65 u pacjentów z wrodzoną amaurozą Lebera oraz przeszczep komórek RPE z wykorzystaniem ludzkich embrionalnych komórek macierzystych (ES) w chorobie Stargardta.3-4 Obecnie, gdy dostępne są wektory terapii genowej i komórki macierzyste do leczenia pacjentów z chorobami siatkówki, istotne jest zweryfikowanie tych potencjalnych terapii na modelach zwierzęcych przed ich zastosowaniem w badaniach na ludziach. Mysz stała się ważnym modelem naukowym do testowania skuteczności terapeutycznej wektorów terapii genowej i transplantacji komórek macierzystych w oku.5-8 W niniejszym artykule wideo przedstawiamy technikę wstrzykiwania wektorów terapii genowej lub komórek macierzystych do przestrzeni podsiatkówkowej oka myszy przy jednoczesnym zminimalizowaniu uszkodzeń otaczających tkanek.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Przygotowanie urządzeń do iniekcji podsiatkówkowej

  1. Należy zakupić lub wykonać igłę o średnicy 100 μm z szklanej rurki kapilarnej. Można to zrobić ręcznie, używając wyciągacza pipet Sutter P-97 lub innego podobnego urządzenia. Koniec rurki kapilarnej jest podgrzewany i wyciągany, aż osiągnie pożądaną średnicę (100 μm). W przypadku wektorów do terapii genowej można zastosować igłę o mniejszej średnicy; jednakże jest to zalecana średnica dla iniekcji komórek, aby uniknąć ich uszkodzenia oraz uszkodzenia oka. W porównaniu z igłami stalowymi, szklana igła kapilarna ma bardzo cienką, ale tępą końcówkę, co umożliwia wizualizację płynu wstrzykiwanego i dostęp do przestrzeni podsiatkówkowej bez powodowania przerwania siatkówki. W razie potrzeby należy oczyścić wyciągnięte igły 70% etanolem i przechowywać w sterylnym pojemniku. Jednym ze sposobów utrzymania igłowych urządzeń do iniekcji w sterylnym środowisku i pod przykryciem jest użycie sterylnej szalki hodowli tkankowej o średnicy 15 cm z taśmą mocującą igły w miejscu. Na tym etapie należy dokończyć konfigurację w sali operacyjnej, w której będzie przeprowadzana procedura. Najłatwiej jest stale przechowywać cały sprzęt w sali operacyjnej, aby zachować jego sterylność, szczególnie jeśli procedura odbywa się w obiekcie z barierami biologicznymi.
  2. Należy zassać silikon do igły iniekcyjnej, a następnie go wypchnąć, aby pozostawić powłokę wzdłuż wewnętrznych ścianek igły. Powłoka silikonowa maksymalizuje przepływ komórek i wirusów przez światło igły, które w przeciwnym razie przylegałyby do wewnętrznych ścianek szklanej kapilary.
  3. Należy przygotować fragment sterylnej plastikowej rurki o długości około 8 cm, odcinając zestaw do pobierania krwi o rozmiarze 25 ¾-gauge z łącznikiem luer-lock w punkcie bezpośrednio za igłą (usuwając igłę z rurki).
  4. Należy napełnić strzykawkę Sub-Q 1 ml 26 5/8-gauge z końcówką slip-tip sterylnym roztworem soli fizjologicznej, a następnie zdjąć igłę ze strzykawki.
  5. Należy przyłączyć igłę iniekcyjną do odciętego końca plastikowej rurki, a strzykawkę do łącznika luer-lock po drugiej stronie.
  6. Należy zassać sterylną sól fizjologiczną, aby wypełnić przestrzeń martwą w rurce i igle kapilarnej, wypychając niewielką ilość soli przez igłę, aby upewnić się, że jest ona prawidłowo przyłączona i nie ma wycieków. Następnie do końcówki igły iniekcyjnej należy zassać niewielką ilość powietrza, około 1 μl. Oddzieli to sól fizjologiczną od płynu do iniekcji i zapewni wizualny sygnał wskazujący koniec płynu wstrzykiwanego podczas procedury chirurgicznej. Aparatura do iniekcji powinna być podczas zabiegu trzymana na czystej powierzchni przetartej 70% etanolem. Ponadto cały sprzęt używany podczas procedury chirurgicznej powinien być czyszczony przed i po zabiegu 70% etanolem, z wyjątkiem igieł iniekcyjnych, które powinny być uprzednio przechowywane w warunkach sterylnych i być gotowe do użycia. Igły te należy wyrzucić po operacji i nie używać ich ponownie.
  7. Na koniec należy zassać roztwór do iniekcji zawierający pożądany zapakowany wektor wirusowy do terapii genowej lub komórki macierzyste. Można to zrobić, pobierając roztwór do sterylnego końcówki pipety, a następnie niszcząc roztwór na powierzchnię sterylnej szalki do hodowli komórek. Roztwór można teraz łatwo zassać do igły iniekcyjnej za pomocą strzykawki. Potrzebna ilość będzie zależeć od wieku myszy. W naszych celach używamy myszy w 5. dobie po urodzeniu, którym można wstrzyknąć 0,5-0,8 μl płynu. W przypadku młodszych myszy można stosować mniejsze ilości, 0,5 μl lub mniej, a w przypadku dorosłych myszy większe ilości, np. 1 μl. Miano wirusa lub liczba komórek muszą zostać określone na podstawie wstrzykiwanego wirusa/komórek oraz pożądanego tkanki docelowej, ponieważ zbyt wiele cząsteczek wirusa lub komórek w małej objętości może prowadzić do toksyczności dla komórek siatkówki. W filmie, w celach wizualizacyjnych, zastosowaliśmy 1,5 μl, czyli większą ilość barwnika niż jest to konieczne do iniekcji do oka.

2. Dostęp do przestrzeni podsiatkowej

  1. W sterylnej sali operacyjnej unieruchom lub znieczul mysz zgodnie z lokalnym, zatwierdzonym protokołem postępowania ze zwierzętami, który różni się w zależności od wieku myszy. Typowa anestezja myszy dorosłych obejmuje zastosowanie gazu izofluranowego lub wstrzyknięcie do jamy brzusznej 0,1 ml/10 g masy ciała ketaminy (100 mg/ml) i ksylazyny (20 mg/ml) w sterylnym roztworze soli fizjologicznej. W przypadku myszy perinatalnych typowe techniki znieczulania obejmują zastosowanie gazu izofluranowego lub krioanestezję (hipotermię). Wszystkie techniki znieczulenia muszą zostać zatwierdzone przez lokalny komitet IACUC przed zastosowaniem. Zazwyczaj używamy myszy w 5. dobie po urodzeniu (P5), choć podobne techniki można zastosować u myszy w wieku P0 lub u myszy dorosłych. Procedurę chirurgiczną można rozpocząć dopiero po ustaniu ruchów kończyn u myszy i braku reakcji na uciśnięcie palca u stopy. W przypadku myszy perinatalnych kolor ciała stanie się wyraźnie jaśniejszy, ponieważ przepływ krwi spowolnieje, co jest kolejnym kluczowym wskaźnikiem pełnego znieczulenia.
  2. U myszy perinatalnych należy użyć prostych nożyczek Vannasa, aby wykonać nacięcie o długości około 1,5 mm wzdłuż zamkniętej szczeliny powiekowej. Należy uważać, aby naciąć w zagłębieniu, w którym oko naturalnie otworzy się w przyszłości. Zapewnia to prawidłowe zagojenie i otwarcie powiek podczas rozwoju myszy. Do tego celu można użyć skalpela, choć preferujemy nożyczki Vannasa, ponieważ zmniejszają one ryzyko przebicia oka podczas tej procedury. Na filmie nożyczki zostały użyte do bezpośredniego przebicia i nacięcia wzdłuż brzegu powieki. Podczas nauki tej techniki należy użyć pęsety do uniesienia powieki przed nacięciem, aby zmniejszyć ryzyko uszkodzenia oka.
  3. Rozsunąć powieki za pomocą zakrzywionej pęsety opatrunkowej, aby doprowadzić do proptozy (wysunięcia) oka, a następnie lekko ucisnąć powieki poniżej oka, aby utrzymać je w tej pozycji do wstrzyknięcia. Jeśli nacięcie powieki wykonane w kroku drugim będzie zbyt duże, oko cofnie się pod powieki, co uniemożliwi odpowiednią ekspozycję podczas procedury iniekcji. W przypadku myszy dorosłych zastosowanie lekkiego nacisku wokół oka za pomocą pęsety opatrunkowej może utrzymać oko w proptozie do wstrzyknięcia.
  4. Wykonaj niewielkie nacięcie twardówki na wysokości równika gałki ocznej lub za nim, wydrapując powierzchnię skalpelem mikrochirurgicznym o kącie 15 stopni. Nacięcie powinno być na tyle duże, aby umożliwić przejście końcówki igły iniekcyjnej, ale nie większe. Jeśli preferowane jest inne rozwiązanie, zamiast skalpela mikrochirurgicznego do wykonania tego nacięcia w przestrzeni podsiatkowej można użyć małej, ostrej igły, np. igły do akupunktury. U zwierząt o ciemnej pigmentacji w miejscu nacięcia widoczna będzie ciemnobrązowa tkanka (nabłonek pigmentowy siatkówki i naczyniówka). U myszy o jaśniejszej pigmentacji lub myszy albinosów można nanieść chirurgiczny marker na końcówkę skalpela mikrochirurgicznego, aby pozostawić kropkę z atramentu wskazującą miejsce nacięcia. Jeśli z miejsca nacięcia cofnie się przezroczysty płyn (ciało szkliste), oznacza to, że skalpel został wprowadzony zbyt głęboko, wnikając do jamy ciała szklistego, co może spowodować przedostanie się terapeutycznego wirusa lub komórek do przestrzeni witrealej podczas iniekcji. W celach wizualizacji na filmie wykonaliśmy nacięcie do tego punktu. W takim przypadku nadal można przeprowadzić iniekcję podsiatkową, jednak odwarstwienie siatkówki spowodowane obecnością płynu iniekcyjnego może nie zagoić się całkowicie u tej myszy. Dlatego należy uważać, aby naciąć tylko zewnętrzną powierzchnię oka, a nie przebić się przez siatkówkę przed iniekcją.
  5. Ostrożnie wprowadź igłę iniekcyjną w miejsce nacięcia i przesuń ją równolegle do zewnętrznej ściany oka, aby wejść w przestrzeń podsiatkową. Wprowadzenie igły zbyt blisko zewnętrznej ściany lub zbyt głęboko do wnętrza oka skieruje iniekcję w niewłaściwe miejsce. Najlepszą metodą zrozumienia, czy igła znajduje się w prawidłowym miejscu, jest ćwiczenie tej techniki. Praktyka na myszach o jasnej pigmentacji lub albinosach może pomóc w wykonywaniu precyzyjnych i dokładnych iniekcji do przestrzeni podsiatkowej, ponieważ igła i płyn iniekcyjny są w tych oczach widoczne.
  6. Wywarć lekki nacisk na tłok strzykawki i rozpocząć wstrzykiwanie pożądanego płynu. Jeśli igła jest prawidłowo umieszczona w przestrzeni podsiatkowej, odczuwalny będzie umiarkowany opór wsteczny. Jeśli igła znajduje się w ciele szklistym, opór wsteczny będzie znacznie mniejszy i podczas iniekcji może wystąpić cofanie się płynu. W przypadku znacznego oporu wstecznego należy utrzymać igłę w miejscu przez co najmniej dodatkowe 15 sekund przed jej powolnym wyjęciem. Pozwoli to na wyrównanie wysokiego ciśnienia wewnątrzgałkowego zamiast cofania się wstrzykniętego wirusa lub komórek przez miejsce nacięcia. Ze względu na zwiększone ciśnienie wymagane podczas procedury iniekcji, do przestrzeni podsiatkowej może zostać wstrzyknięta część powietrza i soli fizjologicznej. Należy uważać, aby nie wstrzyknąć zbyt dużo powietrza lub soli fizjologicznej, ponieważ może to wypłukać wstrzykniętego wirusa lub komórki z oka. Istnieje również ryzyko spowodowania trwałego odwarstwienia siatkówki z powodu wstrzyknięcia zbyt dużej ilości płynu do przestrzeni podsiatkowej. W celach wizualizacji na filmie do przestrzeni podsiatkowej wstrzyknięto nadmiar barwnika i powietrza. Można wyraźnie zobaczyć, jak część barwnika zostaje wypłukana z przestrzeni podsiatkowej w przypadku wstrzyknięcia zbyt dużej ilości, ale także jak pęcherzyk powietrza pozostaje w przestrzeni podsiatkowej i nie znika w ciele szklistym. Zastosowano to, aby podkreślić, że wszystkie te iniekcje odbyły się w prawidłowym miejscu w oku, dzięki czemu można zwizualizować sposób wprowadzania igły w miejsce nacięcia. Wszystkie iniekcje do przestrzeni podsiatkowej powodują tymczasowe odwarstwienie siatkówki z powodu obecności płynu iniekcyjnego. Jeśli procedura iniekcji zostanie przeprowadzona prawidłowo, to tymczasowe odwarstwienie siatkówki zagoi się w ciągu 24 h i myszy będą mogły być wykorzystane we wszystkich dalszych eksperymentach. Oko może pozostać miękkie przez około tydzień z powodu zabiegu chirurgicznego, dlatego w tym okresie należy unikać drugiej iniekcji.
  7. U myszy noworodkowych należy użyć zakrzywionej pęsety opatrunkowej, aby delikatnie odepchnąć oko z powrotem za powieki i do oczodołu. Warto odczekać minutę, aby wirus osiadł w przestrzeni podsiatkowej i nie został wypłukany z miejsca nacięcia podczas delikatnego odpychania oka do oczodołu. Po zabiegu w miejscu iniekcji można podać jedną kroplę 0,5% bupiwakainy (markainy) rozcieńczonej do 0,25% w sterylnym roztworze soli fizjologicznej za pomocą igły 25G. Myszy nie wykazują jawnych oznak stresu po operacji podsiatkowej, a stosowanie bupiwakainy jako długo działającego miejscowego środka przeciwbólowego było wystarczające przez ostatnie trzy lata. Po zabiegu chirurgicznym należy zawsze monitorować myszy pod kątem wszelkich oznak stresu, takich jak infekcja, obrzęk lub spadek typowej dziennej aktywności myszy. Jeśli takie objawy wystąpią, należy powiadomić lekarza weterynarii; można wówczas podać dodatkowe leki przeciwbólowe, np. buprenorfinę (0,05 mg/kg) w formie iniekcji doprzewnowej.
  8. Wybudzić mysz z narkozy zgodnie z lokalnym, zatwierdzonym protokołem postępowania ze zwierzętami. Podczas wybudzania mysz powinna znajdować się na poduszce grzewczej w celu utrzymania normalnej temperatury ciała. Procedura chirurgiczna powinna zająć mniej niż pięć minut, nie licząc czasu znieczulania myszy. Dlatego poduszka grzewcza nie jest konieczna podczas samego zabiegu, ale może być potrzebna podczas nauki techniki, gdyż procedura może trwać dłużej. Myszy nie należy przenosić z powrotem do czystej klatki, dopóki nie zacznie samodzielnie się poruszać. W przypadku noworodków delikatne uciskanie palców u stóp pomoże im w pełni dojść do siebie po znieczuleniu; powinny one odzyskać różowy kolor i zdolność poruszania się przed powrotem do matki. Myszy należy monitorować w czasie pod kątem wszelkich oznak stresu wymienionych wcześniej.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przedstawiono rysunek oka myszy z zaznaczonymi głównymi strukturami w celu odniesienia, gdzie strzałki wskazują miejsca przeprowadzania zabiegów chirurgicznych w postaci iniekcji witrealnej oraz podsiatkówkowej (groty strzałek, Rysunek 1). W tych miejscach można wstrzykiwać wektory terapii genowej, takie jak lentiwektor lacZ (Rysunek 2). Ponadto w tych obszarach oka myszy można przeszczepiać komórki macierzyste, np. embrionalne komórki macierzyste myszy (Rysunek 3

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Niniejsza technika wideo przedstawia instrukcje dotyczące prawidłowego przeprowadzenia zabiegu chirurgicznego polegającego na iniekcji podsiatkówkowej, zapewniając umieszczenie wektora terapii genowej lub komórek macierzystych w miejscu niezbędnym do efektywnego leczenia choroby okulistycznej. Technika ta umożliwia celowanie w komórki siatkówki, takie jak RPE lub fotoreceptory, ponieważ wprowadza wektory terapii genowej lub tkanki pochodzące z komórek macierzystych w bezpośrednie sąsiedztwo tych komórek. Wcześniejsze met...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nie zgłoszono konfliktów interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Research to Prevent Blindness; Pomoc eksperymentalna od Takayuki Nagasaki; Niniejsze badanie jest zgodne z oświadczeniem ARVO dotyczącym wykorzystania zwierząt w badaniach okulistycznych i wizualnych. KJW jest wspierany przez granty NIH 5T32EY013933 oraz 5T32DK007647-20. VBM jest wspierany przez grant NIH K08EY020530.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Kapilara szklana 0,8-1,10 x 100 mmKimble Glass, Inc.34502 99
Wytwornica mikropipet (puller) Flaming/BrownSutter InstrumentP-97Można zastosować mikrokuźnię Narishige. Katalog nr MF-900
SigmacoteSigma AldrichSL2-25MLSilikon
Fosforanowy bufor solny Dubecco z chlorkiem wapnia i chlorkiem magnezuGibco-Invitrogen14040-133
Zestaw do pobierania krwi Safety-Lok 25 3/4G x 12"B-D Vacutainer367298
Strzykawka podskórna 1 ml 26 5/8G z końcówką typu slip-tipBecton-Dickinson309597
Pipeta o regulowanym zakresie 0,5-10 μl Finnpipette IIFisherbrand21-377-815
Naturalne końcówki ścięte 1-200 μlUSA Scientific, Inc.1111-1700
Stereomikroskop Discovery.V8ZeissMC1500
Przetraktowana polistyrenowa płytka do hodowli komórkowych 60 mm x 15 mmCorning Incorporated430166
Nożyce proste VannasaStorz OphthalmicsE3383 S
Zakrzywione pęsety opatrunkowe z delikatnym karbowaniemStorz OphthalmicsE1408
Nóż mikrochirurgiczny 15 stopniWilson Ophthalmic Corp.091204
KetaminaKetaset IIINADA #45-290
KsylazynaLloyd LaboratoriesNADA #139-236
Bupiwakaina (Marcaine)AstraZenecaN/A
BuprenorfinaSigma AldrichB9275

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Prevalence of Blindness Data Tables [NEI Statistics and Data]. , National Eye Insitute. Available from: http://www.nei.nih.gov/eyedata/pbd_tables.asp (2011).
  2. Abe, T. Regeneration of the retina using pigment epithelial cell transplantation. Nihon Ganka Gakkai Zasshi. 106, 778-803 (2002).
  3. Jacobson, S. G., Cideciyan, A. V., Ratnakaram, R., Heon, E., Schwartz, S. B., Roman, A. J., Peden, M. C., Aleman, T. S., Boye, S. L., Sumaroka, A., et al. Gene therapy for Leber congenital amaurosis caused by RPE65 mutations: safety and efficacy in 15 children and adults followed up to 3 years. Arch. Ophthalmol. 130, 9-24 (2011).
  4. Schwartz, S. D., Hubschman, J. P., Heilwell, G., Franco-Cardenas, V., Pan, C. K., Ostrick, R. M., Mickunas, E., Gay, R., Klimanskaya, I., Lanza, R. Embryonic stem cell trials for macular degeneration: a preliminary report. Lancet. 379, 713-720 (2012).
  5. Wang, N. K., Tosi, J., Kasanuki, J. M., Chou, C. L., Kong, J., Parmalee, N., Wert, K. J., Allikmets, R. Transplantation of reprogrammed embryonic stem cells improves visual function in a mouse model for retinitis pigmentosa. Transplantation. 89, 911-919 (2010).
  6. Song, B. J., Tsang, S. H., Lin, C. -S. Genetic models of retinal degeneration and targets for gene therapy. Gene Ther. Mol. Biol. 11, 229-262 (2007).
  7. Tosi, J., Sancho-Pelluz, J., Davis, R. J., Hsu, C. W., Wolpert, K. V., Sengillo, J. D., Lin, C. S., Tsang, S. H. Lentivirus-mediated expression of cDNA and shRNA slows degeneration in retinitis pigmentosa. Exp. Biol. Med. 236, 1211-1217 (2011).
  8. Tucker, B. A., Park, I. H., Qi, S. D., Klassen, H. J., Jiang, C., Yao, J., Redenti, S., Daley, G. Q., Young, M. J. Transplantation of adult mouse iPS cell-derived photoreceptor precursors restores retinal structure and function in degenerative mice. PLoS One. 6, e189992(2011).
  9. Mahajan, V. B., Mondino, B. J., Tsang, S. H. A high-throughput Mouse Eye Phenomics System. , Cold Spring Harbor Laboratories. (2010).
  10. Chang, B., Hawes, N. L., Hurd, R. E., Davisson, M. T., Nusinowitz, S., Heckenlively, J. R. Retinal degeneration mutants in the mouse. Vision Res. 42, 517-525 (2002).
  11. Hawes, N. L., Smith, R. S., Chang, B., Davisson, M., Heckenlively, J. R., John, S. W. Mouse fundus photography and angiography: a catalogue of normal and mutant phenotypes. Mol. Vis. 5, 22(1999).
  12. Won, J., Shi, L. Y., Hicks, W., Wang, J., Hurd, R., Naggert, J. K., Chang, B., Nishina, P. M. Mouse model resources for vision research. J. Ophthalmol. 2011, 391384(2011).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Technika sklerotomiiig a z kapilary szklanejwstrzykiwanie p ynuci nienie wsteczneprzestrze podsiatk wkowanab onek pigmentowy siatk wki

Powiązane artykuły