Artykuł metodologiczny

Analiza fuzji błon zapośredniczonej przez białka SNARE z wykorzystaniem enzymatycznego testu fuzji komórek

DOI:

10.3791/4378

⸱

19 października 2012

 ,  ,  , 
1Department of Biochemistry and Molecular Biology, University of Louisville School of Medicine

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opracowaliśmy test fuzji komórek, który pozwala na ilościowe określenie zdarzeń fuzji błon zapośredniczonej przez białka SNARE poprzez aktywowaną ekspresję β-galaktozydazy.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Oddziaływania białek SNARE (soluble N-ethylmaleimide-sensitive factor attachment protein receptor) na pęcherzykach (v-SNARE) i na błonach docelowych (t-SNARE) katalizują wewnątrzkomórkową fuzję pęcherzyków1-4. Testy rekonstytucji są niezbędne do analizy mechanizmu i regulacji fuzji błon zapośredniczonej przez białka SNARE5. W teście fuzji komórek6,7 białka SNARE są ekspresjonowane ektopowo na powierzchni komórki. Te „odwrócone” białka SNARE indukują fuzję komórka-komórka, co dowodzi, że białka SNARE są wystarczające do fuzji błon komórkowych. Ponieważ test fuzji komórek opiera się na analizie mikroskopowej, jest on mniej wydajny w ilościowej analizie wielu oddziaływań między v- oraz t-SNARE.

Opisujemy tutaj nową metodę analityczną8, która ilościowo określa liczbę zdarzeń fuzji komórek pośredniczonej przez białka SNARE poprzez aktywowaną ekspresję β-galaktozydazy. Jako układ odczytu wykorzystano dwa komponenty systemu ekspresji genów Tet-Off9: tetracyklinowy transaktywator (tTA) oraz plazmid reporterowy kodujący gen LacZ pod kontrolą elementu odpowiedzi na tetracyklinę (TRE-LacZ). tTA transfekujemy do komórek COS-7, które wykazują ekspresję odwróconych białek v-SNARE na powierzchni komórki (komórki v), natomiast TRE-LacZ transfekujemy do komórek COS-7, które wykazują ekspresję odwróconych białek t-SNARE na powierzchni komórki (komórki t). Zależna od SNARE fuzja komórek v i t prowadzi do wiązania tTA z TRE, aktywacji transkrypcyjnej LacZ i ekspresji β-galaktozydazy. Aktywność β-galaktozydazy jest określana ilościowo metodą kolorymetryczną poprzez pomiar absorbancji przy 420 nm.

Białka błonowe związane z pęcherzykami (VAMPs) są v-SNAREs, które znajdują się w różnych pęcherzykowych przedziałach post-Golgi10-15. Poprzez ekspresję VAMPs 1, 3, 4, 5, 7 i 8 na tym samym poziomie, porównujemy ich aktywność fuzji błon za pomocą enzymatycznego testu fuzji komórek. W oparciu o pomiar spektrometryczny, test ten oferuje ilościowe podejście do analizy fuzji błon pośredniczonej przez SNARE oraz do badań wysokoprzepustowych.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Hodowla komórek i transfekcja

  1. Komórki COS-7 hoduje się w medium DMEM (Dulbecco Modified Eagle's Medium) uzupełnionym o 4,5 g/l glukozy oraz 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS).
  2. Transfekcję plazmidową przeprowadza się za pomocą Lipofectamine zgodnie z instrukcjami producenta (Invitrogen).

2. Analiza mikroskopowa fluorescencyjna ekspresji białek SNARE na powierzchni komórek

  1. Dzień przed transfekcją 3×104 komórek COS-7 wysiewa się na sterylne szklane laminki o średnicy 12 mm (Fisher Scientific) umieszczone w płytkach 24-dołkowych.
  2. W przypadku komórek v w każdym dołku 0,25 μg plazmidu kodującego tTA (pTet-Off, CLONTECH) współtransfekuje się z 0,25 μg plazmidów eksprymujących odwrócone VAMPy.
  3. W przypadku komórek t w każdym dołku 0,25 μg plazmidu kodującego TRE-LacZ (pBI-G, CLONTECH) współtransfekuje się z 0,25 μg każdego z plazmidów eksprymujących odwrócone SNAP-25 oraz syntaksyny 1 lub 4.
  4. 24 h po transfekcji komórki utrwala się 4% paraformaldehydem w PBS++ (PBS uzupełniony o 0,1 g/l CaCl2 i 0,1 g/l MgCl2) przez 10 min, a następnie blokuje w 10% FBS w PBS++ przez 30 min.
  5. Komórki inkubuje się przez 1,5 h z przeciwciałem monoklonalnym anty-Myc 9E10 (czysty nadsącz z hodowli hybridoma).
  6. Po czterokrotnym przemyciu PBS++, komórki inkubuje się przez 1 h z przeciwciałami wtórnymi sprzężonymi z FITC (Jackson Immunoresearch Laboratories) w rozcieńczeniu 1:500.
  7. Po czterokrotnym przemyciu PBS++, znakowane komórki zamyka się w odczynniku antyblaknącym Prolong Gold (Invitrogen).
  8. Obrazy konfokalne pozyskuje się za pomocą laserowego skaningowego mikroskopu konfokalnego Olympus. Obrazy przetwarza się w programie Adobe Photoshop.

3. Analiza FACS ekspresji białek SNARE na powierzchni komórek

  1. Dzień przed transfekcją w każdej studzience płytek 6-dołkowych wysiewa się 2×105 komórek COS-7.
  2. 24 h po transfekcji plazmidami flipped SNARE, pTet-Off i pBI-G, komórki utrwala się 1% paraformaldehydem w PBS++ przez 15 min, a następnie blokuje w 10% FBS w PBS++ przez 15 min.
  3. Komórki inkubuje się z przeciwciałem monoklonalnym anty-Myc 9E10 przez 60 min.
  4. Po trzykrotnym przemyciu PBS++, komórki znakuje się przeciwciałami wtórnymi sprzężonymi z FITC (rozcieńczenie 1:200) przez 45 min.
  5. Po trzykrotnym przemyciu PBS++, komórki zdejmuje się z płytek za pomocą skrobaka do komórek.
  6. 15 000 komórek analizuje się za pomocą cytometru przepływowego FACSCalibur (BD Biosciences). Średnią intensywność fluorescencji dla każdej próbki wyznacza się przy użyciu oprogramowania CellQuest Pro.

4. Enzymatyczny test fuzji komórek

  1. Dzień przed transfekcją do każdej 100-milimetrowej szalki hodowlanej wysiewa się 1,2×106 komórek COS-7, a do każdego dołka płytek 6-dołkowych wysiewa się 2×105 komórek COS-7.
  2. W przypadku komórek v, do komórek w każdej 100-milimetrowej szalce hodowlanej kotransfekuje się po 0,5 - 5 μg plazmidu flipped VAMP wraz z 5 μg pTet-Off. Komórki kontrolne są kotransfekowane pustym wektorem pcDNA3.1(+) oraz pTet-Off. Aby zapobiec N-glikozylacji VAMP 1, 4, 5, 7 i 8, do pożywki hodowlanej podczas transfekcji dodaje się tunicamycynę (10 μg/ml).
  3. W przypadku komórek t w każdym dołku płytek 6-dołkowych, 1 μg plazmidu flipped SNAP-25 oraz pBI-G są kotransfekowane z 0,5 μg plazmidu flipped syntaxin1 lub 0,05 μg plazmidu flipped syntaxin4.
  4. 24 h po transfekcji komórki v są odrywane od szalek hodowlanych za pomocą bezenzymatycznego buforu do dysocjacji komórek Enzyme-free Cell Dissociation Buffer (Invitrogen). Odrywane komórki są liczone za pomocą hemocytometru i resuspendowane w DMEM buforowanym HEPES, uzupełnionym o 10% FBS, 6,7 μg/ml tunicamycyny oraz 0,67 mM DTT.
  5. Do każdego dołka zawierającego już komórki t dodaje się 4,8×105 resuspendowanych komórek v.
  6. Po 6, 12 lub 24 h inkubacji w 37 °C w 5% CO2, ekspresję β-galaktozydazy mierzy się za pomocą zestawu β-Galactosidase Enzyme Assay System z użyciem Reporter Lysis Buffer zgodnie z instrukcjami producenta (Promega). W skrócie: komórki przemywa się dwukrotnie PBS, a następnie lizuje w Reporter Lysis Buffer. Lizaty komórkowe miesza się z równą objętością Assay 2× Buffer. Jako kontrolę ślepą Reporter Lysis Buffer miesza się z Assay 2× Buffer.
  7. Po 90 min reakcję kolorymetryczną zatrzymuje się poprzez dodanie 1 M węglanu sodu.
  8. Absorbancję przy 420 nm mierzy się za pomocą spektrofotometru HITACHI 100-40.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aby opracować ilościowy test fuzji komórek, wykorzystujemy silną aktywację transkrypcyjną wywołaną wiązaniem tTA do TRE. Wobec braku tTA transkrypcja genu LacZ w TRE-LacZ jest wyciszona. W obecności tTA białko to wiąże się z TRE i aktywuje transkrypcję LacZ. Rycina 1 przedstawia schemat blokowy enzymatycznego testu fuzji komórek. tTA jest transfekcjowane do komórek v, które wykazują ekspresję białek v-SNARE na powierzchni komórki, natomiast TRE-LacZ jest transfekcjonow...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Oryginalny test fuzji komórek6 określa zdarzenia fuzji komórek pośredniczone przez białka SNARE za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. W niniejszym opracowaniu opisujemy innowacyjny test, który kwantyfikuje zdarzenia fuzji komórek pośredniczone przez SNARE poprzez aktywowaną ekspresję β-galaktozydazy i pomiar spektrometryczny. Korzystając z tego testu, rutynowo analizujemy 15–20 kombinacji v- i t-SNARE w jednym doświadczeniu. Wykorzystując cytometrię przepływową do pomiaru ekspresji SNARE na powierzchni komór...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Niniejsza praca jest finansowana ze środków startowych University of Louisville oraz z grantu CA135123 National Institutes of Health (przyznanego C.H.).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
DMEMInvitrogen12800-017
komórki COS-7ATCCCRL-1651
tunicamycynaSigma-AldrichT7765-5MG
pTet-OffClontechK1620-A
pBI-GClontech6150-1
lipofektaminaInvitrogen18324-012
Roztwór do dysocjacji komórek bez enzymówInvitrogen13151-014
Królicze poliklonalne przeciwciało przeciwko represorowi TETMilliporeAB3541
Koniugowany z FITC osiołkowe przeciwciało anty-mysie IgG (H+L)Jackson ImmunoResearch715-095-150
Konfokalny mikroskop skaningowyOlympusFV1000
Cytometr przepływowy FACSCaliburBD Biosciences
Zestaw do analizy enzymatycznej β-galaktozydazy z buforem do lizy reporterowejPromegaE2000
Spektrofotometr UV-VIS Model 100-40HitachiC740843

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Rothman, J. E. Mechanisms of intracellular protein transport. Nature. 372, 55-63 (1994).
  2. Jahn, R., Lang, T., Sudhof, T. C. Membrane fusion. Cell. 112, 519-533 (2003).
  3. Bonifacino, J. S., Glick, B. S. The mechanisms of vesicle budding and fusion. Cell. 116, 153-166 (2004).
  4. Jahn, R., Scheller, R. H. SNAREs--engines for membrane fusion. Nature. 7, 631-643 (2006).
  5. Weber, T. SNAREpins: minimal machinery for membrane fusion. Cell. 92, 759-772 (1998).
  6. Hu, C. Fusion of cells by flipped SNAREs. Science (New York, N.Y). 300, 1745-1749 (2003).
  7. Hu, C., Hardee, D., Minnear, F. Membrane fusion by VAMP3 and plasma membrane t-SNAREs. Experimental cell research. 313, 3198-3209 (2007).
  8. Hasan, N., Corbin, D., Hu, C. Fusogenic Pairings of Vesicle-Associated Membrane Proteins (VAMPs) and Plasma Membrane t-SNAREs - VAMP5 as the Exception. PloS one. 5, e14238(2010).
  9. Gossen, M., Bujard, H. Tight control of gene expression in mammalian cells by tetracycline-responsive promoters. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 89, 5547-5551 (1992).
  10. Hanson, P. I., Heuser, J. E., Jahn, R. Neurotransmitter release - four years of SNARE complexes. Current opinion in neurobiology. 7, 310-315 (1997).
  11. McMahon, H. T. Cellubrevin is a ubiquitous tetanus-toxin substrate homologous to a putative synaptic vesicle fusion protein. [see comments. Nature. 364, 346-349 (1993).
  12. Steegmaier, M., Klumperman, J., Foletti, D. L., Yoo, J. S., Scheller, R. H. Vesicle-associated membrane protein 4 is implicated in trans-Golgi network vesicle trafficking. Molecular biology of the cell. 10, 1957-1972 (1999).
  13. Zeng, Q. A novel synaptobrevin/VAMP homologous protein (VAMP5) is increased during in vitro myogenesis and present in the plasma membrane. Molecular biology of the cell. 9, 2423-2437 (1998).
  14. Galli, T. A novel tetanus neurotoxin-insensitive vesicle-associated membrane protein in SNARE complexes of the apical plasma membrane of epithelial cells. Molecular biology of the cell. 9, 1437-1448 (1998).
  15. Wong, S. H. Endobrevin, a novel synaptobrevin/VAMP-like protein preferentially associated with the early endosome. Molecular biology of the cell. 9, 1549-1563 (1998).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Ilo ciowe oznaczanie beta galaktozydazysystem ekspresji gen w Tet Offbia ka VAMPbia ka syntaksynykom rki COS 7cytometria przep ywowaanaliza spektrofotometrycznaekspresja powierzchniowa kom rek

Powiązane artykuły