Wykrywanie neuroinwazyjnego wirusa zapalenia mózgu za pomocą systemów obrazowania In Vivo (IVIS)

Allison Poussard; Michael Patterson; Katherine Taylor; Alexey Seregin; Jeanon Smith; Jennifer Smith; Milagros Salazar; Slobodan Paessler

doi:10.3791/4429

Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Wykrywanie neuroinwazyjnego wirusa zapalenia mózgu za pomocą systemów obrazowania In Vivo (IVIS)

20.3K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/4429

⸱

2 grudnia 2012

Allison Poussard^*¹ , Michael Patterson^*¹ , Katherine Taylor¹ , Alexey Seregin¹ , Jeanon Smith¹ , Jennifer Smith¹ , Milagros Salazar¹ , Slobodan Paessler¹

¹Experimental Pathology, University of Texas Medical Branch

^* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Wykorzystanie lucyferazy oraz systemów obrazowania in vivo (IVIS) jako nowej metody identyfikacji punktów końcowych choroby przed wystąpieniem objawów klinicznych. IVIS pozwolił nam na wizualizację w czasie rzeczywistym inwazji wirusów zapalenia mózgu przez wiele dni, co zapewnia dokładniejszy model choroby do przyszłych badań. Pozwoliło to również na szybszą identyfikację potencjalnych właściwości ochronnych leków przeciwwirusowych i szczepionek niż w przypadku obecnie stosowanych modeli zwierzęcych. Możliwość obserwacji poszczególnych zwierząt w wielu punktach czasowych zapewnia zmniejszenie liczby potrzebnych zwierząt, redukcję kosztów oraz ogólnej zachorowalności badanych osobników, co gwarantuje bardziej humanitarny i naukowy sposób badania chorób.

Streszczenie

Nowoczesne postępy w technologiach obrazowania sprzyjają dalszemu rozwojowi i udoskonalaniu sposobów prowadzenia badań nad wirusami. Zgodnie z koncepcją 3R (zastąpienie, ograniczenie, udoskonalenie) zaproponowaną pierwotnie przez Russella i Burcha, wykorzystywanie modeli zwierzęcych w badaniach naukowych podlega ciągłej presji w celu identyfikacji nowych metodologii pozwalających na ograniczenie liczby zwierząt przy jednoczesnej poprawie dokładności i szybkości badań. Głównym wyzwaniem dla zasad 3R jest jednak zapewnienie statystycznej dokładności badań przy jednoczesnym zmniejszeniu zachorowalności zwierząt i ich całkowitej liczby. Badania nad skutecznością szczepionek wymagają obecnie dużej liczby zwierząt, aby wyniki uznano za istotne statystycznie, co często prowadzi do wysokiej zachorowalności i śmiertelności jako punktów końcowych służących do identyfikacji ochrony odpornościowej. Wykorzystaliśmy systemy obrazowania in vivo (IVIS) w połączeniu z bioluminescencyjnym enzymem świetlika, aby progresywnie śledzić inwazję ośrodkowego układu nerwowego (CNS) przez wirus zapalenia mózgu w modelu mysim. Zazwyczaj choroba postępuje stosunkowo powoli, jednak replikacja wirusa jest szybka, zwłaszcza w obrębie CNS, co często prowadzi do śmiertelnego wyniku. Po infekcji donosowej myszy szczepem TC83-Luc, czyli atenuowanym szczepem wirusa wenezuelskiego zapalenia mózgu koni zmodyfikowanym tak, aby ekspresował gen lucyferazy, jesteśmy w stanie zwizualizować replikację wirusa w mózgu co najmniej na trzy dni przed wystąpieniem klinicznych objawów choroby. Wykorzystując inwazję CNS jako kluczowy punkt końcowy rozwoju choroby zapalnej mózgu, możemy szybko zidentyfikować terapeutyczną i szczepionkową ochronę przeciwko infekcji TC83-Luc przed wystąpieniem objawów klinicznych. Dzięki technologii IVIS jesteśmy w stanie zademonstrować szybkie i dokładne testowanie leków terapeutycznych oraz szczepionek przy jednoczesnym ograniczeniu liczby zwierząt i ich zachorowalności.

Protokół

1. Przygotowanie zwierząt

Przybycie zwierząt: Po przybyciu do obiektów poziomu biosafety 2 dla zwierząt (ABSL2), należy pozwolić zwierzętom na aklimatyzację w nowym środowisku przez minimum 2 dni. Po tym okresie odpoczynku należy zbadać zwierzęta, aby ocenić ich stan zdrowia i ogólną kondycję fizyczną.
1. W przypadku stosowania reporterów fluorescencyjnych ważne jest wprowadzenie wszystkich zwierząt na dietę bez lucerny, aby ograniczyć autofluorescencję przewodu pokarmowego i sygnał tła.
Golenie zwierząt: Aby poprawić sygnał bioluminescencyjny wykrywany z obszaru czaszki podczas obrazowania, należy ogolić głowy wszystkich zwierząt. Zwierzęta należy poddać znieczuleniu mieszanką tlenu i odparowanego izofluranu. Po pełnym znieczuleniu zwierząt należy użyć maszynki elektrycznej do ogolenia ich głów. Po zakończeniu golenia należy przenieść zwierzęta do klatek i obserwować je do czasu pełnego wybudzenia z narkozy.
Wprowadzenie transpondera Bio Medic Data Systems (BMDS) (wykonywane po ogoleniu myszy, podczas pełnego znieczulenia): W celu zastosowania mniej inwazyjnej metody monitorowania temperatury, należy wszczepić zaprogramowany bezprzewodowy transponder BMDS podskórnie w obszarze grzbietowym każdej myszy. Transpondery te umożliwiają bezprzewodową identyfikację i rejestrację temperatury. Po implantacji transpondera należy nałożyć na ranę weterynaryjny klej tkankowy.
Pomiary wyjściowe: Przed zakażeniem należy zapisać temperaturę wyjściową i masę ciała wszystkich zwierząt. Należy pobrać krew do analizy testem neutralizacji redukcji plaków (PRNT) poprzez upust z splotu zatwarczowego (RO), gdy myszy znajdują się pod wpływem znieczulenia. Po pobraniu krwi należy zastosować weterynaryjną antybiotykową maść do oczu, aby zredukować ryzyko wtórnego zakażenia bakteryjnego. Pomiary wyjściowe powinny być przeprowadzane z uwzględnieniem liczby podań znieczulenia ze względu na stres zwierząt. Kolejne pobrania metodą RO powinny być wykonywane po obrazowaniu, gdy mysz nadal znajduje się pod wpływem środka znieczulającego. Maksymalna ilość krwi pobranej metodą RO powinna wynosić około 200 μl.
Zakażenie: Myszy należy poddać znieczuleniu zgodnie z wcześniejszym opisem. Inokulację wykonuje się drogą donosową, stosując dawkę od 5x10⁶ do 5x10⁷ pfu TC83-Luciferase w całkowitej objętości 40 μl rozcieńczonej w roztworze soli fizjologicznej z buforem fosforanowym (PBS). Po zakażeniu należy umieścić myszy w klatkach i obserwować proces rekonwalescencji.

2. Obrazowanie zwierząt

Zastrzeżenie: Myszy należy przez cały czas utrzymywać w ich klatkach, w komorze z laminarnym przepływem powietrza (BSC) lub w pudełku ograniczającym XIC. Do tego protokołu zatwierdzone komory BSC to klasy II typu B1 lub B2.

Wstrzyknąć wszystkim zwierzętom dożylnie w obszarze otrzewnej (IP) lucyferynę w stężeniu 15 mg/ml w dawce 10 μl na gram masy ciała.
1. Myszy otrzymujące Ampligen należy poddać wstrzyknięciu IP w dawce 12,5 mg/kg masy ciała w czasie -4 h po infekcji lub +48 h po infekcji, zależnie od przypisanej grupy.
Przed wstrzyknięciem lucyferyny podzielić myszy na grupy po trzy sztuki, aby zapewnić ich odpowiednie rozmieszczenie wewnątrz komory izolacyjnej XIC-3.
1. Podczas wszystkich badań obrazowych należy stosować maść lub lubrykant do oczu, aby zapobiec wysychaniu rogówki w trakcie procedury.
Uruchomić oprogramowanie LivingImage i nacisnąć Initialize, aby przygotować komorę obrazującą; ustawić automatyczne zapisywanie, czas ekspozycji na auto (automatyczny czas ekspozycji jest nową funkcją oprogramowania LivingImage w wersji 3.2 i nowszych), pole widzenia na C oraz filtr na otwarty (open); pole widzenia zależy od liczby obrazowanych myszy, a filtr może być optymalizowany w zależności od potrzeb innych projektów obrazowania.
Upewnić się, że filtry węglowe powietrza nie utraciły ważności, butla z tlenem jest pełna, a zbiornik z izofluranem jest napełniony. W komorze izolacyjnej XIC-3 umieścić małe paski taśmy izolacyjnej, co pomoże ograniczyć ruchy zwierząt podczas obrazowania.
Wstrzyknąć myszom lucyferynę IP zgodnie z opisem w sekcji 2.1 i umieścić je w komorze indukcyjnej z izofluranem (z otwartą pokrywą) na 3-5 min.
Po 5 min zamknąć pokrywę komory indukcyjnej i rozpocząć przepływ izofluranu. Środek znieczulający podać w stężeniu około 3-5% przy przepływie tlenu ustawionym na około 2,0 L/min. Po całkowitej utracie przytomności odczekać dodatkowe 30 s i przenieść myszy do komory izolacyjnej XIC-3. Upewnić się, że wykorzystywana komora z laminarnym przepływem powietrza umożliwia bezpieczne odprowadzanie oparów izofluranu, ponieważ procedura ta wiąże się z ucieczką izofluranu z komory indukcyjnej (urządzenie IVIS posiada własne kanistry Passive Fair, a komora XIC-3 łączy się bezpośrednio z gniazdami wlotowymi/wylotowymi, co zapewnia zamknięty przepływ środka znieczulającego).
1. Przenieść myszy do komory izolacyjnej XIC-3 zgodnie z numerem chipa/grupy, z podłączonym i otwartym złączem do izofluranu. Ułożyć myszy w pozycji brzusznej (sternal recumbency), tak aby głowy lekko spoczywały na paskach taśmy.
Przetrzeć komorę XIC etanolem, spryskać dłonie oraz dno komory XIC-3 preparatem Cavicide i przenieść całość do komory obrazowania IVIS. Po umieszczeniu wewnątrz urządzenia obrazującego ponownie podłączyć znieczulenie do komory.
Po 10 min od wstrzyknięcia lucyferyny wykonać obrazowanie myszy za pomocą oprogramowania LivingImage.
Po wstępnym obrazowaniu z otwartym filtrem rozpocząć trójwymiarowe obrazowanie DLIT, korzystając z ustawień Sequence analysis oraz Image Wizard dla bioluminescencyjnej lucyferazy świetlika. Proces ten potrwa 4-5 min i powinien zostać wykonany przy polu widzenia dostosowanym do pożądanej liczby myszy.
1. Analiza ex-vivo jest możliwa po sekcji i pobraniu mózgu. Umieścić mózg na sterylnym naczyniu Petriego, nanieść kroplą 50-100 μl roztworu lucyferyny i umieścić w komorze obrazującej.
Wykonać drugi obraz z otwartym filtrem w 15-17 min po infekcji, po zakończeniu obrazowania DLIT. Upewnić się, że analiza sekwencyjna (sequence analysis) jest wyłączona, a pole widzenia i ustawienia filtra zostały przywrócone do poprzednich wartości.

3. Powrót myszy i analiza danych

Wyłącz parownik izofluranu i przenieś pojemnik zabezpieczający XIC z powrotem do komory bezpieczeństwa biologicznego.
Umieść myszy z powrotem w ich klatce, zamknij górną pokrywę, spryskaj zewnętrzną stronę odpowiednim środkiem dezynfekującym i umieść klatkę z powrotem na regale.
1. Upewnij się, że myszy całkowicie wybudziły się z narkozy.
Powtarzaj powyższą procedurę zgodnie z wymaganiami eksperymentu aż do zakończenia obrazowania.
Zdezynfekuj BSC, wyłącz sprzęt i przenieś wszystkie dane do zewnętrznej lokalizacji laboratoryjnej w celu dalszej analizy.
Przeanalizuj dane i wygeneruj obrazy 3D na podstawie wyników IVIS, korzystając z oprogramowania LivingImage.
1. Upewnij się, że obraz jest odpowiednio zorientowany, a oświetlenie i balans kolorów zostały ustawione. W palecie narzędzi (Tool Palette) dostępne są opcje: Image Adjust, Corrections, Image Information oraz ROI Tools.
2. Wykorzystaj kształty ROI, aby zidentyfikować konkretne natężenia sygnału w zależności od lokalizacji.
3. Zrekonstruuj topografię powierzchni, aby wyróżnić ciało myszy, zainicjuj rekonstrukcję 3D DLIT i użyj dopasowania liniowego (linear fit), aby przypisać mapę organów do rekonstrukcji topograficznej.
Dalsza analiza miana wirusa może zostać przeprowadzona poprzez pobranie krwi i organów. Miareczkowanie w niniejszym badaniu wykonano poprzez homogenizację tkanki mózgowej w zmodyfikowanym medium Orła (MEM). Homogenizat poddano rozcieńczeniom seryjnym, a następnie zainfekowano płytkę 6-dołkową z komórkami Vero przez 1 hr. Komórki przykryto warstwą 1,5% agarozy/2xMEM i inkubowano przez 2 dni w 37 °C. Komórki utrwalono 10% formaliną przez 30 min i zabarwiono fioletem krystalicznym.