Wykorzystanie okna czaszkowego do wizualizacji tętnicy środkowej mózgu podczas niedrożności tętnicy środkowej mózgu wywołanej endoteliną-1

Podsumowanie

Ten artykuł opisuje metodę wizualizacji tętnic mózgowych szczurów przez okno czaszki za pomocą kraniektomii skroniowej w celu obejrzenia proksymalnych części środkowej tętnicy mózgowej (Rysunek 1). Ta wszechstronna metoda może być łączona z różnymi technikami dostarczania leków w celu pomiaru reaktywności tętnic mózgowych in vivo.

Streszczenie

Tworzenie okna czaszkowego to metoda, która pozwala na bezpośrednią wizualizację struktur na powierzchni kory mózgowej^1-3. Technika ta może być wykonywana w wielu miejscach pokrywających mózg szczura, ale najłatwiej jest ją przeprowadzić, wykonując kraniektomię nad łatwo dostępnymi kośćmi czołowymi lub ciemieniowymi. Najczęściej stosowaliśmy tę technikę w połączeniu z modelem niedrożności środkowej tętnicy mózgowej endothelin-1 udaru niedokrwiennego w celu ilościowego określenia zmian średnicy naczynia tętnicy środkowej mózgu, które zachodzą po wstrzyknięciu endoteliny-1 do miąższu mózgu przylegającego do bliższego MCA^{4, 5}. Aby uwidocznić proksymalną część MCA podczas MCAO indukowanego endoteliną -1, używamy techniki tworzenia okna czaszkowego przez kość skroniową po bocznej stronie czaszki szczura (ryc. 1). Tętnice mózgowe można uwidocznić albo z nienaruszoną oponą twardą, albo z oponą twardą naciętą i cofniętą. Najczęściej pozostawiamy oponę twardą nienaruszoną podczas wizualizacji, ponieważ MCAO indukowane endoteliną-1 polega na dostarczeniu peptydu zwężającego naczynia krwionośne do miąższu mózgu. Omija to konieczność nacinania opony twardej bezpośrednio nad wizualizowanymi naczyniami w celu dostarczenia leku. Protokół ten opisuje, jak stworzyć okno czaszkowe do wizualizacji tętnic mózgowych w sposób krokowy, a także jak uniknąć wielu potencjalnych pułapek związanych z tą metodą.

Protokół

Ten protokół został zatwierdzony przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC) na Uniwersytecie Florydy i jest zgodny z "Przewodnikiem po opiece i użytkowaniu zwierząt laboratoryjnych" (ósme wydanie, National Academy of Sciences, 2011).

Materiały

1. Zwierzęta: Ośmiotygodniowy samiec szczura Sprague Dawley (Charles River Farms, Wilmington, MA, USA) o wadze 250-300 g w momencie operacji.
2. znieczulenie
   1. System znieczulenia wziewnego (VetEquip Inc., Pleasanton, CA, USA)
   2. Znieczulenie izofluranem (Baxter Pharmaceutics, Deerfield, IL, USA)
3. System stereotaktyczny (David Kopf Instruments, Tujunga, CA, USA)
   1. System stereotaktyczny dla małych zwierząt
   2. Niepękające nauszniki dla szczurów
   3. Uchwyt na głowicę do znieczulenia gazowego dla szczurów
4. Regulacja temperatury
   1. Termometr z mikrosondą BAT-12 (World Precision Instruments, Inc., Sarasota, Floryda, USA)
   2. T/PUMP, koc termiczny TP600 (Gaymar Industries, Inc., Orchard Park, NY, USA)
5. Chirurgicznych
   1. Nożyczki Metzenbaum, kleszczyki do tęczówki, zwijacze zaciskowe Bulldog, strzykawka 10 μl z igłą skośną o rozmiarze 26, zestaw do kauteryzacji Bovie (World Precision Instruments, Inc., Sarasota, FL, USA)
   2. Wiertarka mikrosilnikowa (Stoelting, Wood Dale, IL, USA)
   3. Wiertło okrągłe 0,8 mm (Roboz Surgical Instrument Co., Inc., Gaithersburg, MD, USA)
   4. Kleszcze do szycia STORZ Bonn (Bausch and Lomb, Inc., Rochester, NY, USA)
6. Materiały chirurgiczne
   1. Szew nylonowy 3.0 (Oasis, Mettawa, IL, USA)
   2. Waciki, maść do oczu Puralube (Fisher Scientific, Pittsburg, PA, USA)
   3. Punkty i paski chirurgiczne (Medtronic Xomed, Inc., Jacksonville, FL, USA)
   4. Elektryczne maszynki do strzyżenia włosów (Oster, Providence, RI, USA)
7. chemikalia
   1. Endothelin-1 (amerykański peptyd, Sunnyvale, CA, USA)
   2. Chlorheksydyna 2% (Agrilabs, St. Joseph, MO, USA)
8. Sprzęt do wizualizacji
   1. Mikroskop chirurgiczny (Seiler Instrument and Manufacturing; St. Louis, MO, USA)
   2. Sony Handycam HDR-SR12 (Sony, Minato, Tokio, Japonia)
   3. Oświetlacz światłowodowy (TechniQuip Corp., Livermore, CA, USA)
9. Pomiar średnicy naczynia
   1. Odtwarzacz multimedialny VLC (Paryż, Francja)
   2. Oprogramowanie Image J (oprogramowanie ImageJ 1.42q, U.S. National Institutes of Health, Bethesda, MA, USA)

1. Kroki przedoperacyjne

1. Przed zabiegiem szczury są trzymane w cyklu światło/ciemność 12:12 ze swobodnym dostępem do wody i karmy dla gryzoni.
2. Znieczulenie indukuje się 4% izofluranem w mieszaninie 100%_O2 gazów w komorze indukcyjnej.
3. Czubek głowy jest golony elektrycznymi maszynkami do strzyżenia włosów.
4. Szczura umieszcza się w pozycji leżącej na podkładce chłonnej leżącej na powierzchni operacyjnej o kontrolowanej temperaturze (kocu termicznym), a głowę umieszcza się w aparacie stereotaktycznym, rozpoczynając od założenia maski znieczulającego gazem.
5. Następnie wkładane i dokręcane są nauszniki.
6. Podczas zabiegu znieczulenie jest utrzymywane 2% izofluranem w mieszaninie 100%_O2 gazów.
7. Okulistyczną maść nawilżającą nakłada się na oba oczy, a powieki są zamknięte, aby zapobiec wysuszeniu oczu podczas zabiegu chirurgicznego.
8. Sonda temperatury doodbytniczej jest wprowadzana w celu utrzymania stałej temperatury rdzenia zwierzęcia wynoszącej 37±0,5 °C.
9. Gdy głowa znieczulonego szczura jest mocno trzymana w urządzeniu stereotaktycznym, obszar operacyjny jest trzykrotnie oczyszczany naprzemiennie chlorheksydyną i solą fizjologiczną.

2. Przygotowanie okna przedczaszkowego

Przed stworzeniem okna czaszkowego, szczur powinien być przygotowany do wszelkich eksperymentów poprzez wszczepienie innego wymaganego sprzętu i powinien przejść wszelkie wymagane zabiegi chirurgiczne. W tym protokole wcześniej wszczepiliśmy kaniulę prowadzącą do MCAO indukowanego endoteliną-1 (ET-1), jak pokazano w towarzyszącej publikacji zatytułowanej "Model niedrożności tętnicy środkowej mózgu indukowany endoteliną-1 dla udaru niedokrwiennego z laserową kontrolą przepływu dopplerowskiego u szczurów".

3. Stworzenie okna czaszkowego

Po umieszczeniu kaniuli prowadzącej lub sprzętu wymaganego do eksperymentów, tworzone jest okno czaszkowe do bezpośredniej wizualizacji proksymalnych części tętnicy środkowej mózgu podczas procedury udaru.

1. Po pierwsze, nożyczki służą do nacinania skóry nad mięśniem skroniowym, zaczynając przyśrodkowo i pracując bocznie.
2. Mięsień skroniowy jest przecinany na pół za pomocą elektrokoagulacji, a następnie cofany za pomocą nylonowego szwu 3,0, aby uwidocznić płaskonabłonkową część kości skroniowej.
3. Kwadrat o boku około 3-4 mm jest rysowany na płaskonabłonkowej części kości skroniowej ogonowej do oczodołu i powyżej podstawy wyrostka jarzmowego, gdy odbija się od kości skroniowej.
4. Wiertło służy do stopniowego wycinania zarysowanego kawałka kości z kości skroniowej. Należy zachować ostrożność, aby nie wywierać zbyt dużego nacisku na wiertło, ponieważ możliwe jest uszkodzenie opony twardej lub kory mózgowej.
5. Częste płukanie sterylną solą fizjologiczną wykonuje się w celu poprawy wizualizacji pola operacyjnego i zapobieżenia przegrzaniu czaszki.
6. Zaczynając od luźnego rogu, kawałek kości temoporal jest ostrożnie usuwany za pomocą cienkich kleszczy z zębami szczura, uważając, aby nie rozerwać żadnych naczyń związanych z oponą twardą.
7. Opona twarda pozostaje nienaruszona, a zanieczyszczenia są spłukiwane za pomocą sterylnej soli fizjologicznej.

4. Rejestracja zwężenia tętnicy mózgowej

Aby zademonstrować, jak rejestrować obrazy w czasie rzeczywistym, do tego protokołu użyto szczura, który przechodzi MCAO indukowany przez ET-1.

1. Przed zastosowaniem związków wazoaktywnych należy nagrać film wyjściowy przez co najmniej 1 minutę. W przypadku MCAO indukowanego przez ET-1 zapis wyjściowy jest wykonywany po opuszczeniu igły do miąższu mózgu, ale przed wstrzyknięciem ET-1.
2. Pompa strzykawkowa jest uruchamiana do wstrzykiwania i rejestrowana przez 1 godzinę lub do pożądanego punktu końcowego. Igła pozostaje na miejscu podczas nagrywania wideo, aby zapobiec zakłóceniom płaszczyzny ogniskowej.
3. Szczur powinien zostać głęboko znieczulony i poddany eutanazji zgodnie z zatwierdzonym protokołem po tej procedurze.

5. Analiza obrazu

Średnica naczynia może być określona dla dowolnej części wizualizowanego MCA. Jako przykład użyjemy jednej gałęzi MCA do pomiaru średnicy naczynia w punktach czasowych przed i po wstrzyknięciu ET-1. Nieruchome klatki z filmu są rejestrowane w odstępach 1-minutowych za pomocą odtwarzacza multimedialnego VLC (VideoLAN).

1. Odtwarzacz VLC jest zainstalowany i otwarty.
2. Wybierając narzędzia, a następnie preferencje, ustawienie zostanie zmienione na "Wszystkie" w sekcji "Pokaż ustawienia".
3. "Menu wideo" jest rozwijane na lewym pasku bocznym, a następnie rozwijane są "moduły wyjściowe". Opcja "Filtry scen" jest wybierana, aby wyświetlić menu filtra wideo sceny.
4. "Scena" jest wpisywana w polu prefiksu nazwy pliku.
5. Zdefiniowany jest prefiks ścieżki katalogu. W tym miejscu zapisywane są nieruchome klatki.
6. Współczynnik nagrywania jest wybierany na podstawie żądanej szybkości przechwytywania nieruchomych klatek. Jeśli film został nagrany z szybkością 29 klatek na sekundę, w polu należy wpisać "1749" (29 klatek/s x 60 sekund/min), aby zapisać jedną klatkę nieruchomą co 1 minutę. Wszystkie zmiany są następnie zapisywane.
7. Żądane wideo jest następnie otwierane w odtwarzaczu VLC, aby automatycznie zapisywać nieruchome klatki raz na 1 minutę.
8. Średnica naczynia jest następnie mierzona za pomocą tych obrazów. Najpierw otwierane jest oprogramowanie ImageJ (NIH).
9. Następnie nieruchome klatki, które będą mierzone, są otwierane w ImageJ.
10. Wybierając menu "analizuj", otwiera się "ustaw pomiary" i wszystkie pola są odznaczone.
11. Następnie wybierane jest narzędzie Linia prosta
.
12. Skrót klawiaturowy "Ctrl +" służy do powiększania w razie potrzeby, a linia jest umieszczana prostopadle do ścieżki naczynia w celu zmierzenia średnicy naczynia.
13. Na koniec długość naczynia uzyskuje się poprzez wybranie menu "analizuj", a następnie "zmierz" (ctrl+M), aby uzyskać długość naczynia.
14. Proces ten powtarza się co najmniej trzy razy i uśrednia dla każdego mierzonego naczynia mierzonego w każdej nieruchomej klatce.
15. Średnica naczynia w każdym punkcie czasowym jest znormalizowana do podstawowej średnicy naczynia, dzięki czemu można dokonać porównań przy użyciu wielu szczurów. Aby to zrobić, użyj wzoru aktualna średnica/średnica linii bazowej x 100%, aby obliczyć % średnicy linii bazowej każdego naczynia.

Wyniki

Zdjęcia z nagranego filmu pokazują, że zmiana średnicy tętnicy mózgowej po wstrzyknięciu ET-1 może być łatwo zauważona za pomocą tej techniki okna czaszkowego (Rysunek 2). W ciągu kilku minut od wstrzyknięcia ET-1 naczynie zacznie się zwężać. W końcu naczynia będą trudne do uwidocznienia, a tkanka mózgowa stanie się blada. Po około 20 minutach działanie ET-1 zmniejszy się, a naczynia zaczną się rozszerzać, stopniowo powracając do średnicy podstawowej po około 45 minutach. Oprócz bardziej oczywistego zwęż...

Dyskusja

Podsumowując, ta technika przygotowania okna czaszkowego jest bardzo wszechstronna, ponieważ można ją zmieniać, aby sprostać potrzebom wielu eksperymentów z niewielkimi modyfikacjami^{4, 5}. Na przykład z powodzeniem monitorowaliśmy przepływ krwi w mózgu w określonych gałęziach MCA za pomocą laserowej przepływowej dopplerowskiej metrii dopplerowskiej, aby skupić się bezpośrednio na tętnicy mózgowej uwidocznionej przez okno czaszki (Mecca AP 2009 i 2011). Ponadto podobny preparat z naciętą oponą twardą może być st...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Wziewny system anestezjologiczny	VetEquip Inc., Pleasanton, CA, USA	901806
Znieczulenie izofluranem	Baxter Pharmaceutics, Deerfield, IL, USA	1001936060
System stereotaktyczny dla małych zwierząt	David Kopf Instruments, Tujunga, CA, USA	900
Niepękające nauszniki, szczur	David Kopf Instruments, Tujunga, CA, USA	957
Uchwyt na głowę do znieczulenia gazem dla szczurów	David Kopf Instruments, Tujunga, CA, USA	1929
Termometr mikrosondowy BAT-12	World Precision Instruments, Inc., Sarasota, FL, USA	BAT-12
T / PUMP, koc termiczny	Gaymar Industries, Inc., Orchard Park, NY, USA	T/PUMP, TP600
Metzenbaum Scissors	World Precision Instruments, Inc., Sarasota, FL, USA	501254
Kleszczyki do tęczówki	World Precision Instruments, Inc., Sarasota, FL, USA	15915
Zwijacze zaciskowe Bulldog	World Precision Instruments, Inc., Sarasota, FL, USA	14119-G
10 μ l strzykawka 26-gaugue	World Precision Instruments, Inc., Sarasota, FL, USA	SGE010RNS
Bovie, zestaw do kauteryzacji wysokotemperaturowej	World Precision Instruments, Inc., Sarasota, FL, USA	500392
Kleszczyki do zębów szczurów 0,12	Stotz	E1811
Wiertarka mikrosilnikowa	Stoelting, Wood Dale, IL, USA	51449
Wiertło	okrągłe 0,8 mmRoboz Surgical Instrument Co., Inc., Gaithersburg, MD, USA	RS-6280C-1
Kleszcze do szycia STORZ Bonn	Bausch and Lomb, Inc., Rochester, NY, USA
Szew nylonowy, rozmiar 3.0	Oasis, Mettawa, IL, USA	MV-663
Waciki bawełniane	Fisher Scientific, Pittsburg, PA, USA	22-029-488
Maść do oczu Puralube	Fisher Scientific, Pittsburg, PA, USA	NC0138063
Elektryczne maszynki do strzyżenia włosów	Oster, Providence, RI, USA	78005-301
ET-1 rozcieńczone do 80 μ Stężenie M w amerykańskim	peptydzie PBS, Sunnyvale, CA, USA	88-1-10A
Chlorheksydyna, 2%	Agrilabs, St. Joseph, MO, USA	1040, Rev. 6-06, Nr NAC: 10580322
Mikroskop chirurgiczny	Seiler Instrument i produkcja, St. Louis, MO, USA	Evolution xR6
Sony Handycam	Sony, Minato, Tokio, Japonia	HDR-SR12
oświetlacz optyczny	TechniQuip Corp., Livermore, CA, USA	FO1– Odtwarzacz multimedialny 150
VLC	(Paryż, Francja)
Oprogramowanie Image J	U.S. National Institutes of Health, Bethesda, MA, USA