Zakłócenie bariery krew-mózg pomaga w dostarczaniu niektórych leków do mózgu. Mannitol podawany dotętniczo obkurcza komórki otaczające naczynia krwionośne w celu fizycznego przerwania bariery.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Szczurzy model przerwania bariery krew-mózg w celu umożliwienia ukierunkowanych terapii nerwowo-naczyniowych
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Komórki śródbłonka ze ścisłymi połączeniami wraz z błoną podstawną i stopami końcowymi astrocytów otaczają naczynia krwionośne mózgu, tworząc barierę krew-mózg1. Bariera selektywnie wyklucza cząsteczki z przechodzenia między krwią a mózgiem na podstawie ich wielkości i ładunku. Funkcja ta może utrudniać dostarczanie leków na zaburzenia neurologiczne. Na przykład wiele leków chemioterapeutycznych nie przekroczy skutecznie bariery krew-mózg, aby dotrzeć do komórek nowotworowych2. W związku z tym poprawa dostarczania leków przez barierę krew-mózg jest obszarem zainteresowania.
Najbardziej rozpowszechnionymi metodami zwiększania dostarczania leków do mózgu są bezpośrednia infuzja mózgowa i zakłócenie bariery krew-mózg3. Bezpośredni wlew domózgowy gwarantuje, że terapie dotrą do mózgu; Jednak ta metoda ma ograniczoną zdolność do dyspersji leku4. Przerwanie bariery krew-mózg (BBBD) umożliwia przepływ leków bezpośrednio z układu krążenia do mózgu, a tym samym skuteczniejsze dotarcie do rozproszonych komórek nowotworowych. Trzy metody przełamywania bariery obejmują przerwanie bariery osmotycznej, przerwanie bariery farmakologicznej oraz skoncentrowane ultradźwięki z mikropęcherzykami. Zakłócenie osmotyczne, zapoczątkowane przez Neuwelt, wykorzystuje hipertoniczny roztwór 25% mannitolu, który odwadnia komórki bariery krew-mózg, powodując ich kurczenie się i przerywanie ich ścisłych połączeń. Przerwanie bariery ochronnej można również osiągnąć farmakologicznie za pomocą związków wazoaktywnych, takich jak histamina5 i bradykinina6. Metoda ta jest jednak selektywna przede wszystkim w odniesieniu do bariery mózgowo-nowotworowej7. Ponadto stwierdzono, że RMP-7, analog peptydu bradykininy, jest gorszy w porównaniu z osmotycznym BBBD z 25% mannitolem8. Wykazano również, że inna metoda, zogniskowane ultradźwięki (FUS) w połączeniu z mikropęcherzykowymi ultradźwiękowymi środkami kontrastowymi, odwracalnie otwiera barierę krew-mózg9. Jednak w porównaniu z FUS, 25% mannitol ma dłuższą historię bezpieczeństwa u ludzi, co czyni go sprawdzonym narzędziem do badań translacyjnych10-12.
Aby osiągnąć BBBD, mannitol musi być dostarczany z dużą szybkością bezpośrednio do krążenia tętniczego mózgu. U ludzi cewnik wewnątrznaczyniowy jest kierowany do mózgu, gdzie można uzyskać szybki, bezpośredni przepływ. Protokół ten jak najdokładniej modeluje ludzką chorobę krew-mózg. Po przecięciu do rozwidlenia tętnicy szyjnej wspólnej, cewnik jest wprowadzany wstecz do ECA i używany do dostarczania mannitolu bezpośrednio do krążenia tętnicy szyjnej wewnętrznej (ICA). Propofol i znieczulenie N2Osą stosowane ze względu na ich zdolność do maksymalizacji skuteczności przełamywania bariery13. Jeśli zostanie przeprowadzona prawidłowo, procedura ta ma zdolność bezpiecznego, skutecznego i odwracalnego otwarcia bariery krew-mózg i poprawy dostarczania leków, które zwykle nie docierają do mózgu 8,13,14.
Protokół
1. Przygotuj zwierzę i sprzęt do zabiegu
- Przed rozpoczęciem operacji należy przygotować obszar operacyjny i zwierzę. Wykonaj cewnik do tętnicy szyjnej, wkładając igłę o rozmiarze 23 w jeden koniec 12-calowej rurki PE50. Wyciąć skos pod kątem około 45° na przeciwległym końcu cewnika. Wysterylizuj sprzęt przed zabiegiem. Noś czepek do włosów, maskę chirurgiczną i sterylne rękawiczki.
- Umieść poduszkę grzewczą na powierzchni, na której zostanie wykonany zabieg. Aktywuj go i pozwól mu się ogrzać. Przykryj obszar chłonną podkładką na ławkę.
- Sprawdź, czy masz 25% mannitolu w roztworze bez kryształów. Jeśli obecne są kryształy, należy je rozpuścić, umieszczając fiolkę w gorącej łaźni wodnej o temperaturze 80 °C i okresowo mieszając.
- Zapisać masę zwierzęcia.
- Przygotować rozcieńczenie propofolu do podania w dawce 0,8 mg/kg/min z szybkością 0,1 ml/min.
- Umieść szczura w pudełku indukcyjnym na 3 minuty. Ustawienia: 5% izofluranu, natężenie przepływu 2 l/min na respiratorze.
- Na wierzchu jednorazowego ręcznika ogol szyję i obie wewnętrzne strony ud.
2. Zaintubuj szczura
- Umieść zwierzę z powrotem w pudełku indukcyjnym na 3 minuty.
- Przygotuj rurkę dotchawiczą z cewnikiem dożylnym. W przypadku tej wielkości i szczepu szczura używamy cewnika o pojemności 18 ga. Rurka musi być wystarczająco duża, aby umożliwić odpowiedni przepływ powietrza, ale wystarczająco mała, aby zmieściła się w tchawicy bez powodowania uszkodzeń. Wyciągnąć igłę z plastikowego cewnika i ostrożnie odłamać igłę w odległości ok. 1 cm od jej ostrej końcówki. Igła z buntem będzie twoim rysikiem. Włóż igłę z powrotem do cewnika.
- Zawieś szczura za zęby na ukośnej powierzchni.
- Skieruj światło bezpośrednio na szyję zwierzęcia i ustaw je między jego uszami.
- Włóż małą szpatułkę na ok. 3 cm do części ustnej gardła. Podnieś do góry, delikatnie wyciągając język z ust.
- Wizualizuj otwór tchawicy. Zobaczysz małą dziurę, która otwiera się i zamyka z każdym oddechem.
- Delikatnie włóż cewnik do otworu. Czasami można poczuć, jak plastik dostaje się do chrząstki tchawicy. Tchawica jest wrażliwa. Nie należy zakładać cewnika na siłę.
- Ustawić wentylator na 1 l/min i 60 uderzeń na minutę, a izofluran na 2%.
- Podłącz cewnik do respiratora i przyklej rurkę do powierzchni operacyjnej.
- Sprawdź, czy zwierzę jest znieczulone, wykonując szczypanie palca u nogi.
3. Ustal znieczulenie Propofol IV
- Zabezpiecz szczura, przyklejając wszystkie cztery kończyny i ogon do powierzchni operacyjnej.
- Trzykrotnie wyszoruj ogoloną szyję i pachwiny mydłem z chlorheksydyną. Następnie wyszoruj chlorheksydyną, spłucz trzy razy.
- Podłączyć strzykawkę z propofolem do zestawu przedłużającego dożylnie. Zamontować strzykawkę na pompie infuzyjnej.
- Za pomocą skalpela przetnij skórę ogolonego uda. Unikaj cięcia mięśni.
- Otwórz nacięcie kleszczami, aby uwidocznić żyłę udową.
- Odciągnij tkankę przez tętnicę, aby odsłonić naczynie.
- Wprowadzić do żyły weterynaryjny cewnik dożylny o mocy 26 ga monoject. Kiedy igła przebije ścianę żyły, poczujesz, że przeciskanie staje się łatwiejsze. Wycofać igłę i wepchnąć cewnik do naczynia.
- Rozpocząć infuzję propofolu od 0,1 ml/min.
- Po 3-5 minutach od rozpoczęcia infuzji propofolu należy zmienić gaz znieczulający na mieszaninę 50%O2 i 50%N2Oi odciąć podawanie izofluranu.
4. Odsłonięcie rozwidlenia tętnicy szyjnej wspólnej
- Wykonaj nacięcie w linii środkowej na szyi za pomocą ostrza skalpela.
- Przeciąć między dwoma dużymi gruczołami ślinowymi nożyczkami lub skalpelem.
- Wypreparuj tkankę od boku do linii środkowej, aby odsłonić tętnicę szyjną. Użyj kleszczy, aby otworzyć warstwy tkanki. Możesz użyć nożyczek, aby usunąć kawałki, które odsłaniasz kleszczami i określasz, że są minimalnie unaczynione. Zatamuj krwawienie gazą, wacikami i kauteryzacją, jeśli to konieczne.
- Wstrzyknąć 3 ml soli fizjologicznej IP, jeśli wystąpiło umiarkowane lub obfite krwawienie.
- Użyj retraktorów, aby odciągnąć tkankę od tętnicy szyjnej. Znajdź rozwidlenie.
- Odsłoń tętnicę potyliczną tuż dystalnie do rozwidlenia. Kauteryzuj go między kleszczami i oddziel za pomocą elektrokoagulacji.
- Użyj kleszczy, aby w pełni odsłonić rozwidlenie tętnicy szyjnej i jak największą część ECA.
- Odsłonić tętnicę tarczycy górną odgałęziającą się od ECA dystalnie do tętnicy potylicznej. Kauteryzuj go między kleszczami i oddziel za pomocą elektrokoagulacji.
5. Cewnikowanie tętnicy szyjnej zewnętrznej
- Umieść 2 odcinki jedwabiu 4/0 pod ECA.
- Chwyć 1 odcinek szwu za pomocą hemostatu i cofnij ECA do tyłu doogonowo (w kierunku łap szczura).
- Weź drugi szew i zawiąż jak najdalej czaszką (w kierunku pyska szczura) węzłem chirurgicznym. W ten sposób powstaje trwała ligatura do poświęcenia Trybunału Obrachunkowego.
- Usuń pierwszy hemostat (ten, który wywierał napięcie ogonowe) i chwyć drugi szew (ten, który jest zawiązany wokół ECA) i delikatnie nałóż czaszkę za pomocą hemostatu.
- Zawiąż luźno węzeł innego chirurga (nie zabezpieczaj - zostaw ledwo zawiązany) dystalnie do rozwidlenia i proksymalnie do podwiązania stałego.
- Nawadniaj 1% lidokainą, aby rozluźnić tętnicę.
- Napełnij cewnik heparynizowaną solą fizjologiczną.
- Umieść tymczasowy klips do naczynia jak najbliżej rozwidlenia. Umieść klips naczynia pod kątem, aby zmaksymalizować przestrzeń do cewnikowania. Przesuń luźny węzeł w kierunku klipsa.
- Wykonaj małą arteriotomię (cięcie) w ECA tuż obok ligatury za pomocą mikronożyczek. Nie powinno być krwawienia, jeśli klips i ligatura są zabezpieczone.
- Używając kleszczy do kontrolowania ścianek ECA, wprowadź skośny koniec cewnika do naczynia.
- Zabezpiecz cewnik luźnym węzłem szwu. Zawiąż tętnicę wokół cewnika.
- Zdejmij klips i wyczyść obszar bawełnianym wacikiem.
- Przesuń cewnik do około 1 mm dystalnie do rozwidlenia. Przytrzymaj tętnicę kleszczami proksymalnie do węzła, aby upewnić się, że naczynie jest unieruchomione.
6. Podawać mannitol
- Napełnij zestaw przedłużaczy dożylnych 8" i strzykawkę o pojemności 6 ml mannitolem, nie tworząc pęcherzyków powietrza. Przechowywać w inkubatorze w temperaturze 37 °C. Uwaga: pracować szybko z mannitolem - łatwo wytrąci się z roztworu w temperaturze pokojowej.
- Aby uwidocznić BBBD, możesz podać niebieski barwnik Evansa i obserwować, jak wnika on w obszary mózgu, w których bariera została naruszona. W tym celu należy podać zwierzęciu 2 ml/kg 2% Evans Blue przez nowe miejsce dożylne na nodze przeciwlegle do wlewu propofolu.
- Przymocuj zestaw przedłużający do filtra 5 μm i napełnij go mannitolem, aby usunąć pęcherzyki powietrza. Następnie przymocuj go do kranu bez tworzenia bąbelków.
- Podawać mannitol w dawce 0,09 ml/s przez 25 sekund. Obserwuj, czy mannitol osiągnął równowagę z przepływem w tętnicy szyjnej wspólnej w punkcie tuż proksymalnym do ICA. Powinno się wydawać, że pulsuje wraz z tętnem szczura. Jeśli mannitol po prostu spływa w dół w kierunku serca, pokonałeś ciśnienie krwi szczura. Może to powodować zagrażające życiu powikłania i słabą barierę krew-mózg.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Rycina 1. Wizualizacja przerwania bariery krew-mózg poprzez ekstrawasację barwnika błękitu Ewansa. Błękit Ewansa jest pigmentem, który wiąże się z albuminami i w warunkach fizjologicznych nie przenika do tkanki mózgowej. Przerwanie bariery krew-mózg po jed...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Istnieje kilka sposobów maksymalizacji skuteczności BBBD. Ważne jest, aby zminimalizować krwawienie w fazie odcięcia. Na ciśnienie krwi i częstość akcji serca może mieć wpływ znaczne krwawienie, a wiadomo, że czynniki te wpływają na stopień BBBD13. Krwawienie można zmniejszyć, stosując szwy do podwiązania głównych naczyń, takich jak tętnice tarczycy górnej i potylicznej, które należy podzielić. Dodatkowo elektrokoagulacja może być stosowana do dzielenia naczyń krwionośnych i preparowania obszarów, które mają b...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Nie stwierdzono konfliktu interesów.
Podziękowania
Ta praca była wspierana przez Fundację J.B. Marshalla.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Długi szczur Evans | Harlan Laboratories | 210-250 g, męski | |
| PE 50 Rurki | Beckton-Dickinson | ||
| 18 mm x 2,5 "Cewnik dożylny | Terumo | Do rurki ET | |
| Zestawy przedłużające 30" IV | |||
| 26 gauge | Monoject | ||
| Evans niebieski barwnik | Sigma | E2129 | |
| Bipolarny | Codmana | ||
| , 5 μ m | Braun |
Bibliografia
- Abbott, N. J., Patabendige, A. A. K., Dolman, D. E. M., Yusof, S. R., Begley, D. J. Structure and function of the blood-brain barrier. Neurobiology of disease. 37, 13-25 (2010).
- Smith, Q. R. The Blood-Brain Barrier. 89, 193-208 (2003).
- Kroll, R. A., Neuwelt, E. A. Outwitting the blood-brain barrier for therapeutic purposes: osmotic opening and other means. Neurosurgery. 42, 1083(1998).
- Kroll, R. A., Pagel, M. A., Muldoon, L. L., Roman-Goldstein, S., Neuwelt, E. A. Increasing volume of distribution to the brain with interstitial infusion: dose, rather than convection, might be the most important factor. Neurosurgery. 38, 746-754 (1996).
- Butt, A. M., Jones, H. C. Effect of histamine and antagonists on electrical resistance across the blood-brain barrier in rat brain-surface microvessels. Brain research. 569, 100-105 (1992).
- Inamura, T., Black, K. L. Bradykinin selectively opens blood-tumor barrier in experimental brain tumors. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 14, 862-870 (1994).
- Matsukado, K., et al. Enhanced tumor uptake of carboplatin and survival in glioma-bearing rats by intracarotid infusion of bradykinin analog, RMP-7. Neurosurgery. 39, 125(1996).
- Kroll, R. A., et al. Improving drug delivery to intracerebral tumor and surrounding brain in a rodent model: a comparison of osmotic versus bradykinin modification of the blood-brain and/or blood-tumor barriers. Neurosurgery. 43, 879(1998).
- Kinoshita, M., McDannold, N., Jolesz, F. A., Hynynen, K. Noninvasive localized delivery of Herceptin to the mouse brain by MRI-guided focused ultrasound-induced blood-brain barrier disruption. Proceedings of the National Academy of Sciences. 103, 11719-11723 (2006).
- Neuwelt, E. A., Dahlborg, S. A. Chemotherapy administered in conjunction with osmotic blood-brain barrier modification in patients with brain metastases. Journal of neuro-oncology. 4, 195-207 (1987).
- Doolittle, N. D., et al. Safety and efficacy of a multicenter study using intraarterial chemotherapy in conjunction with osmotic opening of the blood-brain barrier for the treatment of patients with malignant brain tumors. Cancer. 88, 637-647 (2000).
- Guillaume, D. J., et al. Intra-arterial chemotherapy with osmotic blood-brain barrier disruption for aggressive oligodendroglial tumors: results of a phase I study. Neurosurgery. 66, 48(2010).
- Remsen, L. G., et al. The influence of anesthetic choice, PaCO2, and other factors on osmotic blood-brain barrier disruption in rats with brain tumor xenografts. Anesthesia & Analgesia. 88, 559-559 (1999).
- Nilaver, G., et al. Delivery of herpesvirus and adenovirus to nude rat intracerebral tumors after osmotic blood-brain barrier disruption. Proceedings of the National Academy of Sciences. 92, 9829(1995).
- Fortin, D., McCormick, C. I., Remsen, L. G., Nixon, R., Neuwelt, E. A. Unexpected neurotoxicity of etoposide phosphate administered in combination with other chemotherapeutic agents after blood-brain barrier modification to enhance delivery, using propofol for general anesthesia, in a rat model. Neurosurgery. 47, 199(2000).
- Neuwelt, E. A., et al. Primary CNS lymphoma treated with osmotic blood-brain barrier disruption: prolonged survival and preservation of cognitive function. Journal of clinical oncology. 9, 1580(1991).
- Remsen, L. G., Trail, P. A., Hellström, I., Hellström, K. E., Neuwelt, E. A. Enhanced delivery improves the efficacy of a tumor-specific doxorubicin immunoconjugate in a human brain tumor xenograft model. Neurosurgery. 46, 704(2000).
- Neuwelt, E. A., Pagel, M. A., Kraemer, D. F., Peterson, D. R., Muldoon, L. L. Bone marrow chemoprotection without compromise of chemotherapy efficacy in a rat brain tumor model. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 309, 594-599 (2004).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
